Summary
Biz biopolymers varlığı şeklinde kalsiyum karbonat kristalleri yağış ve karakterizasyonu için bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Biomineralizasyon, sıklıkla yaşayan organizmalarda fonksiyonel ve/veya yapısal roller ile ilgili organik moleküllerin varlığında minerallerin oluşumudur. Kompleks bir süreçtir ve bu nedenle basit, in vitro, izole moleküllerin biomineralizasyon sürecinde etkisini anlamak için sistem gereklidir. Birçok durumda, biomineralizasyon, ekstrasellüler matrisinde biyopolimerler tarafından yönlendirilir. İzole biopolymlerin Morfoloji ve kalsit in vitro yapısı üzerinde etkisini değerlendirmek için, kalsiyum karbonat yağlaması için buharı difüzyon yöntemi kullandık, Tarama elektron mikroskobu ve mikro Raman karakterizasyonu için, ve ultraviyole-görünür (UV/vis) kristallerin bir biyopolimer miktarını ölçmek için emici. Bu yöntem, biz izole biopolymers açığa, bir kalsiyum klorür çözeltisi içinde çözünmüş, gazlı amonyak ve karbon dioksit, katı amonyum karbonat debileşimi kaynaklanan. Kalsiyum karbonatın çözünürlük ürününün ulaşabileceği koşullarda, kalsiyum karbonat çökme ve kristaller oluşur. Kalsiyum karbonat, termodinamik istikrarında farklılık gösteren farklı polimorf vardır: amorf kalsiyum karbonat, vaterit, aragonit, ve kalsit. Biopolymers yokluğunda, temiz koşullar altında, kalsiyum karbonat çoğunlukla kalsiyum karbonat en termodinamik istikrarlı polimorf olan kalsit formunda mevcut. Bu yöntem, biyofolymeric katkı maddelerinin kalsiyum karbonat kristallerinin Morfoloji ve yapısına etkisini inceler. Burada, iletişim kuralını, kalsiyum karbonat kristalleri oluşumunda, ekstrüler bir bakteriyel protein, TapA, çalışma yoluyla gösteriyoruz. Özellikle, deneysel olarak ayarlanmış ve optik ve Elektron Mikroskopisi ve Raman spektroskopisi gibi karakterizasyon yöntemlerini odaklanıyoruz.
Introduction
Biomineralizasyon, sıklıkla yaşayan organizmalarda fonksiyonel ve/veya yapısal roller ile ilgili organik moleküllerin varlığında minerallerin oluşumudur. Biomineralizasyon hücre içi olabilir, manyetit içindeki manyetit oluşumunda olduğu gibi1, veya ekstrüküler, deniz atası sivri kalsiyum karbonat oluşumunda olduğu gibi2, içinde kollajen ile ilgili hidroksiapatit kemikler3 ve diş amolgenin ile ilişkili emaye4. Biomineralization, yaşayan organizmadaki birçok parametreye bağlı karmaşık bir süreçtir. Bu nedenle, çalışma altında sistemi basitleştirmek için, işlem üzerinde ayrı bileşenlerin etkisini değerlendirmek gereklidir. Birçok durumda, biomineralizasyon ekstrasellüler biopolymers varlığı ile indüklenir. Burada sunulan yöntemin amacı aşağıdaki gibidir: (1) izole biyopolimerler in vitro varlığını kalsiyum karbonat kristalleri oluşturmak için, bir buhar difüzyon yöntemi kullanarak. (2) biyopolimerler kalsiyum karbonat Morfoloji ve yapısı üzerinde etkisini incelemek için.
Organik katkı maddelerinin varlığına kalsiyum karbonat in vitro çöktmek için üç temel yöntem5,6kullanılır. Çözüm yöntemi olarak atıfta olduğumuz ilk yöntem, çözünür tuz kalsiyum (örn., CaCl2) ile çözünür bir karbonat tuzu (örn., sodyum karbonat) ile karıştırılmaya dayanmaktadır. Karıştırma işlemi çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir: gözenekli membranlarla ayrılan üç hücreli bir reaktör içinde7. Burada, dış hücrelerin her biri çözünür bir tuz içerir ve merkezi hücre, test edilecek katkı maddesi ile bir çözüm içerir. Kalsiyum ve karbonat dış orta hücreye diffuz, daha az çözünür kalsiyum karbonat yağış sonuçlanan zaman kalsiyum ve karbonat konsantrasyonları kendi çözünürlük ürün aşan, KSP = [CA2 +] [Co3 2-]. Ek bir karıştırma yöntemi çift jet prosedürü8' dir. Bu yöntemle, her çözünür tuz, kalsiyum karbonat çöktülür katkı içeren bir karıştırıcı çözüm için ayrı bir şırınga enjekte edilir. Burada, enjeksiyon ve bu nedenle karıştırma oranı iyi kontrollü, karışım difüzyon tarafından kontrol edildiği önceki yöntem aksine.
CaCO3 kristalize için kullanılan Ikinci yöntem Kitano Yöntem9' dir. Bu yöntem karbonat/hidrojen karbonat dengesine dayanmaktadır (2hco3- (aq) + CA2 +(aq) 
caco3 (s) + Co2 (g) + H2O (l)). Burada, CO2 , katı bir formda caco3 içeren bir çözelti içine bubbled, sol ve bu nedenle kalsiyum karbonat çözünmesi denge kayması. Çözünmemiş kalsiyum karbonat filtrelenir ve istenilen katkı maddeleri bikarbonat zengin çözüme eklenir. CO2 daha sonra buharlığa izin, böylece katkı varlığı içinde kalsiyum karbonat oluşturan, sağa reaksiyon kayması.
Burada açıklayacağız kalsiyum karbonat kristalizasyonu, üçüncü yöntem, buharı difüzyon yöntemi10. Bu ayarda, kalsiyum klorür çözeltisi içinde çözünen organik katkı maddesi, bir toz formunda Amonyum karbonat yakınında kapalı bir odaya yerleştirilir. Amonyum karbonat tozu karbondioksit ve amonyak haline geldiğinde, kalsiyum iyonlarının (örn. CaCl2) içeren çözeltisi içine yayılır ve kalsiyum karbonat çöktürülmüştür (bkz. Şekil 1 ). Kalsiyum karbonat kristalleri yavaş yağış veya hızlı yağış ile büyüyebilir. Yavaş yağış için, CaCl2 çözeltisi içinde katkı içeren bir çözüm Amonyum karbonat tozu yanında bir kurutucu yerleştirilir. Protokolde uzunluk olarak açıklanan hızlı yağış, hem katkı çözeltisi hem de Amonyum karbonat çok iyi bir plaka içinde birlikte daha yakın yerleştirilir. Yavaş yağış yöntemi daha az çekirdekleme merkezleri ve daha büyük kristaller üretecek ve hızlı yağış daha çekirdekleme merkezleri ve küçük kristaller neden olur.
Yukarıda açıklanan yöntemler, teknik karmaşıklığı, kontrol düzeyinde ve yağış süreci oranı farklıdır. Karıştırma yöntemi, hem çift Jet hem de üç hücreli sistem için özel bir set-up6 gerektirir. Karıştırma yönteminde, diğer çözünür sayaç iyonlarının varlığı (örn., na+, CL-)6 kaçınılmaz, Kitano yöntemi ise, kalsiyum ve (bi) karbonat çözeltinin tek iyonlarının ve ek varlığı içermez (örn., na+, CL-). Ayrıca, karıştırma yöntemi nispeten büyük hacimli gerektirir ve bu nedenle pahalı biopolymers ile çalışmak için uygun değildir. Çift jetin avantajı, çözüm enjeksiyonu oranını kontrol etmek ve diğer yöntemlere kıyasla hızlı bir süreçtir.
Kitano yöntemi ve buhar difüzyon yönteminin avantajı, kalsiyum karbonat oluşumunun, CO2 ' nin bir CAcl2 çözeltisi içine/dışına yayılması ile kontrol edilmesi, böylece daha yavaş çekirdeklenme ve yağış süreçleri için izin verilmesi 11 ' i , 12. Ayrıca, Co2 difüzyon ile kalsiyum karbonat oluşumu vivo13,14,15içinde kalsifikasyon süreçleri benzer olabilir. Bu yöntemle, iyi tanımlanmış ve ayrılmış kristaller16oluşturulur. Son olarak, tek veya birden fazla biyopolimerler kalsiyum karbonat oluşumu üzerinde etkisi test edilebilir. Bu da, bir dizi katkı konsantrasyonunun kalsiyum karbonat oluşumuna etkisinin yanı sıra biyopolimerler karışımlarının bir çalışma-tüm kontrollü bir şekilde gerçekleştirilen bir sistematik çalışma sağlar. Bu yöntem, geniş bir yelpazede konsantrasyonları ve hacimleri katkı maddeleri ile kullanılmak için uygundur. Kullanılan en az birim yaklaşık 50 μL 'dir ve bu nedenle sınırlı miktarda kullanılabilir biopolymers olduğunda bu yöntem avantajlıdır. Maksimal hacim, daha büyük bir iyi plakanın erişilebilirliğine veya CaCl2 içeren plaka veya pancarı yerleştirecek olan kurutucu bağlıdır. Aşağıda açıklanan yöntem bir 96-iyi plaka ile çalışma için optimize edilmiştir protein TapA17olarak seçilmiş bir biyopolimer ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kalsiyum karbonat kristalizasyonu
- Kontrol hazırlığı ve optimizasyonu
- Temiz cam parçaları hazırlayın. Cam temizlemek için aynı temizleme prosedürü kullanın.
- Bir cam mikroskop slayt parçaları kesmek için bir elmas kalem kullanın, böylece bir iyi bir 96-Well plaka uygun.
Not: 5 mm x 5 mm 'lik parçalar büyük ölçüde sığmalıdır. - Su cam slaytlar kapsar ve 10 dakika için bir banyo sonicator sonikat böylece üç distile su (TDW) ile bir kabı cam parçaları yerleştirin.
- Su decant, cam slaytlar kapsayacak şekilde etanol eklemek ve 10 dakika boyunca bir banyo sonicator sonikat.
- Bir azot gazı akışı ile slaytlar ve cam kuru ve 130 W at 10 dakika için bir hava plazma temizleyici yerleştirin.
- Bir cam mikroskop slayt parçaları kesmek için bir elmas kalem kullanın, böylece bir iyi bir 96-Well plaka uygun.
- Pürüzsüz-Faceted kalsit kristalleri ile zengin bir örnek elde etmek için istenilen deneysel koşullar altında gerçekleştirilen kalsifikasyon deneylerinde kullanılan CaCl2 konsantrasyonunu optimize (olmadan veya en azından vaterite bir sayı ile kristalleri).
- Amonyum karbonat tozu ile 96-Well plaka köşelerinde kuyuları doldurun ve alüminyum folyo kullanarak plaka mühür; Parafin filmi ile folyo kapak. Azot Gazı kullanarak herhangi bir kalıntı Amonyum karbonat temizleyin.
DIKKAT: Amonyum karbonat burun ve akciğerleri tahriş eder; Sadece duman kaputu içinde kullanın. - 0,5 M CaCl2' nin stok çözümünü hazırlayın. Bu stok çözümü, çoklu kuyu plakasında CaCl2 çözeltileri konsantrasyonlarının degradasyonunu hazırlamak için kullanılacaktır.
Not: 10 mL 'Lik bir stok çözümü tüm deney için yeterlidir. - Daha önce kesilmiş ve temizlenmiş cam parçaları beş farklı kuyuya yerleştirin. Merkeze en yakın kuyuları kullan.
- Her iyi bir cam parça ile doldurun 100 bir CaCl2 çözüm16μL ile. Mix TDW ve 0,5 M CaCl2 (stok) farklı kuyular arasında CAcl2 artan konsantrasyon gradyan elde etmek. Farklı boyutta bir iyi plaka kullanılırsa, ayrı kalsit kristalleri elde etmek için CaCl2 konsantrasyonunu ayarlayın (adım 1.1.2.10 ve tartışma bölümüne bakın).
Not: Bu protokolde artan bir CaCl2 gradyan 10, 20, 30, 40, 50 mm konsantrasyonlarda ayrı kuyularda kullanılır. Konsantrasyon aralığını veya test edilen konsantrasyonların sayısını artırmak için ek kuyular kullanın. - Amonyum karbonat 3x içeren kuyuların her birinin kapağında iğne ile delinmesi.
- Kapağı geri koyun, kenarlıkları parafin filmi ile mühürleyin ve 20 saat boyunca bir kuluçte 18 °C ' de saklayın.
- Kuluçkalı sonra, bir duman başlığı içinde dikkatle kapağı açın ve bir döngü ile su/hava arayüzünde oluşan kristalleri çıkarın.
- Cam parçaları çift destile su (DDW) içeren bir kabı içine aktarmak için bir cımbız kullanın. Örnekleri kabı çıkarın ve Petri tabak alt üzerine cam parçaları düzeltmek için çift taraflı bant kullanın.
- Kuru aşırı su, doku mendilleri ile slayt kenarlarına dokunmadan. Petri tabağı kapağı ve 24 saat için bir kurutucu yerleştirin.
- Bir stereokapsam (3,5 x büyütme) ve/veya dik optik mikroskop (10X-40X büyütme) ile cam parçaları üzerinde oluşan kristalleri gözlemlemek. Kontrol çözümleri temiz ise, rombohedral kristaller (büyük olasılıkla kalsit) optik mikroskop ile gözlenir (Şekil 2A).
- Rhombohedral kristallerin yanı sıra, kontrol Küresel kristaller içerir (büyük olasılıkla vaterit, Şekil 2B), ya da tarama elektron mikroskop (SEM) görüntüleri sert yerine pürüzsüz yüzler ile rhombohedral kristalleri göstermek ( Şekil 3 A, B), temizleme adımının (1.1.1) doğru şekilde gerçekleştirildiğinden emin olmak için kristalizasyon protokolünü tekrarlayın. Ayrıca, özel kuyular dışında plaka alanlarda hiçbir Amonyum karbonat olduğunu daha iyi dikkatli olun. Aksi takdirde, sonraki adıma geçin.
- Amonyum karbonat tozu ile 96-Well plaka köşelerinde kuyuları doldurun ve alüminyum folyo kullanarak plaka mühür; Parafin filmi ile folyo kapak. Azot Gazı kullanarak herhangi bir kalıntı Amonyum karbonat temizleyin.
- Temiz cam parçaları hazırlayın. Cam temizlemek için aynı temizleme prosedürü kullanın.
- Katkı maddelerinin varlığında kristalizasyon
- Katkı maddelerinin CaCO3kristalizasyonu üzerindeki etkisini incelemek için, katkı maddeleri olmadan (farklı kuyularda), bir kontrol CAcl2 çözeltisi ve katkı maddeleri ile CAcl2 çözümleri içeren çok iyi bir plaka ayarlayın. Deneme için Bölüm 1.1.2 bulunan CaCl2 optimum konsantrasyon kullanın.
Not: aşağıdaki protokol, önceki bir çalışmada16bildirilen olarak en uygun koşulları kullanır. - 1.1.2.2 adım yineleyin.
- Adım 1.1.2.1 açıklandığı gibi plaka köşelerinde Amonyum karbonat tozu yerleştirin.
- Her iyi nerede yağış ortaya çıkar, Bölüm 1.1.1 açıklandığı gibi kesilmiş ve temizlenmiş bir cam parça yerleştirin.
- Kontrol kuyuları hazırlamak için, pipet 90 μL TDW kontrol kuyuları içine. Denetim dahil olmak üzere her iyi en az bir çoğaltır hazırlayın. Kullanılan katkı maddesi bir tampon çözümünde ise, TDW suyu yerine 90 μL tamponu pipet.
- Katkı maddesi içeren kuyuları hazırlayın. Adım 1.2.5 ' yi su içinde katkı çözeltisi 90 μL ekleyerek yineleyin. Eğer katkı tampon (TDW yerine) ise, istenilen son konsantrasyon karşılamak için tampon ile katkı konsantrasyonu önceden ayarlayın. 90 μL toplam hacmini koru; Pipet önce katkı, sonra tampon.
Not: 100 mM NaCl 'de protein TapA 10 μM son konsantrasyon, 25 mM Tris pH 8,0 tampon16 Bu protokolde kullanılır. - 50 mM CaCl2' nin son konsantrasyonuna ulaşmak için hem kontroller hem de katkı maddeleri içeren kuyular Için 10 μl 0,5 M CAcl2 stok çözeltisi (1.2.2. adımda hazırlanmıştır) ekleyin.
- 1.1.2.5-1.1.2.9 adımlarını yineleyin.
- Katkı maddelerinin CaCO3kristalizasyonu üzerindeki etkisini incelemek için, katkı maddeleri olmadan (farklı kuyularda), bir kontrol CAcl2 çözeltisi ve katkı maddeleri ile CAcl2 çözümleri içeren çok iyi bir plaka ayarlayın. Deneme için Bölüm 1.1.2 bulunan CaCl2 optimum konsantrasyon kullanın.
2. kalsiyum karbonat kristalleri karakterizasyonu
- Bir tarama elektron mikroskop ile, optik mikrokopya ile elde daha yüksek bir çözünürlükte katkılar varlığı oluşan kalsiyum karbonat kristalleri gözlemlemek (bkz. Adım 1.1.2.10).
- Çift taraflı karbon teyp ile bir alüminyum saplama kristalleri içeren cam parçaları monte edin.
- 40-50 s için au/PD tabakası ile Coat.
- 5 kV ivme voltajında görüntüleri kazanın.
Not: Şekil 3a uygun bir kontrol deneyi oluşan kalsiyum karbonat KRISTALLERI bir temsili SEM görüntü gösterir, Şekil 4 protein TapA varlığında oluşan kalsiyum karbonat kristalleri temsili görüntüleri gösterir iken .
- Oluşturulan kalsiyum karbonat polimortros belirlemek için mikro Raman spektroskopisi gerçekleştirin. Micro Raman, bir Raman spektrumunun tam bir tozdan ziyade tek kristallerden toplanması sağlar.
- İlgi kristal seçmek için mikroskop bir 20X amacı kullanın.
- 514 nm argon lazer kullanarak Raman spektrumunu 100 − 3200 cm-1 aralığında toplayın.
Not: Şekil 5 , kalsit (A) ve vaterit (B) temsili spektrumunu gösterir. Aragonit spektrum için, referans18bakın.
-
CaCO3 ' teki katkı maddelerinin kütle yüzdesini ölçmek
- Kullanılan katkın yok etme katsayısı (ε) doğrulayın/ölçün. Bir proteinin yok olma katsayısı online sunucular tarafından verilebilir19. Yok olma katsayısı bilinmiyorsa, farklı konsantrasyonlarda katkı emici emilimini ölçmek, emilme vs konsantrasyon arsa ve eğri eğiminin yok olma katsayısı hesaplayın.
- Kristallerin oluşturduğu cam parçalarını tartın, tercihen bir mikrodenge kullanın.
- 0,1 M asetik asit çözeltisi, Vortex ve numune sonikat 1,2 mL içine cam kapalı kristalleri hurda. Örneği 24 saat oda sıcaklığında saklayın.
DIKKAT: deri veya göz teması durumunda asetik asit çok tehlikelidir; dikkatli bir şekilde ele almakta ve düzenlemeleri takip ediniz. - Kristaller kazıldıktan sonra cam slayt tartmak.
- Çözeltinin UV/Vis emici (A) spektrumunu ölçün. Eğer katkı maddesi bir protein ise, 280 nm 'de emici ölçümü yapın ve Beer-Lambert denklemini kullanarak konsantrasyonu (C)hesaplayın:
nerede l küvet içinde optik yoludur. - İçinde bulunan konsantrasyon (C) kullanın 2.3.5 ve kullanılan hacim (V = 1,2 ml) kristallerin/üzerindeki katkı maddelerinin kütlesini (m) hesaplamak için. Konsantrasyon mg/ml ise, C denklemi kullanın ● V = m.
- Konsantrasyon mol/L içinde ise, o zaman (n) C uygulama k ● V = nhesaplayın. Ardından, katkı maddelerinin kütlesini ( m) hesaplamak için moleküler ağırlığı (MW) kullanın (m = n ● MW).
- Denklem kullanarak kristallerin/üzerinde katkı maddeleri ağırlığı yüzdesini hesaplayın:
, m katkı kitlesi olduğu, ve δms cam kapalı hurdaya edildi kalsiyum karbonat kristallerin kütlesi Parça.
, m katkı kitlesi olduğu, ve δms cam kapalı hurdaya edildi kalsiyum karbonat kristallerin kütlesi Parça.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel ayarlanan bir şematik Şekil 1' de gösterilir. Kısaca, difüzyon yöntemi 96-Well plakaları kalsiyum karbonat kristalleri oluşturmak ve kalsiyum karbonat kristalleri Morfoloji ve yapısı üzerinde biyopolimerler etkisini test etmek için kullanılır. Bu deneylerde, Amonyum karbonat, kalsiyum karbonat çözümlerine yayılan, kalsiyum karbonat kristalleri oluşumuna neden olan amonyak ve CO2' ye bölünmüştür (Şekil 1 ve Şekil 2).
Biyopolimerler etkisi ile oluşan kalsiyum karbonat kristalleri karşılaştırılması ile değerlendirilir ve (kontrol) katkı maddeleri olmadan. Katkı maddelerinin ilavesi öncesinde, optimize edilmiş kalsiyum karbonat konsantrasyonu seçilir ve solüsyonların ve cam eşylarının temizliği test edilir. Şekil 2 A kontrol deneyi, farklı rhombohedral kalsiyum karbonat kristalleri oluşur temsili bir görüntü gösterir. Bu kristaller büyük olasılıkla kalsit vardır (bkz. Şekil 5). Eğer çözümler veya plastik veya cam düzgün temizlenmemiş ise küresel kristaller (Şekil 2B, kırmızı daireler ile işaretlenmiş), rhombohedral kalsit kristalleri ek olarak oluşturur. Küresel kristaller büyük olasılıkla vaterite (bkz. Şekil 5). Uygun koşulların kullanımı için ek bir gösterge, kontrol denemede kalsit yüzleri pürüzsüzlük olduğunu. Bu, Şekil 3' te GÖSTERILDIĞI gibi sem ile gözlemlenebilir. Şekil 3 A düzgün kalsit yüzleri ile uygun bir kontrol gösterir, Şekil 3B basamaklardan oluşan yüzler ile kalsit kristalleri gösterir ise. Buradaki küresel kristaller vaterite. Kristal morfolojisine katkı maddelerinin etkisi açıktır, böylece kontrol kristalleri ayrı ve pürüzsüz-Faceted gerekir.
Bir biyopolimer kalsiyum karbonat morfolojisi üzerinde etkisini göstermek için, biz burada protein TapA kullandık. Şekil 4 çözelti içinde TapA varlığını oluşturulan kalsiyum karbonat kristalleri gösterir. Kristaller kontrol kristalleri farklıdır. Çoklu kalsit mikrokristallerinden oluşan kompleks bir küresel kalsiyum karbonat montajı oluştururlar ( Şekil 5' te Raman spektrumuna bakın). Kristallerin yapısını karakterize etmek için bir yöntem Raman spektroskopisidir. Şekil 5 , başarılı (a) ve başarısız (b) kontrol deneylerinden alınan tipik kalsit spektrumlarını (Şekil 5A) ve vaterite (Şekil 5B) gösterir. Tipik emici zirveler20 aralığında olan 100 − 400 cm-1 (kafes modları), bir zirve ~ 710 cm-1 (simetrik bükme Co32-) ve ~ 1090 cm-1 (simetrik germe Co3 2-). Raman vardiya bölünmesi unutmayın ~ 1080 cm-1 vaterite21en belirgin özelliğidir. Aragonit tam bir spektrum için başvuru22 bakın. TapA varlığını oluşturulan kristallerin Raman spektrum kalsit spektrumuna benzer (Şekil 5A). Ek dorukların hangi tek bir kalsiyum karbonat Polymorph tek bir spektrumuna karşılık gelmez göründüğü durumlarda, ya da bu bir kombinasyonu, onlar tamamen adım 1.1.2.8 yıkanmamış kalsiyum klorür aşırı atfedilen olabilir.
Protokolün son bölümünde, kalsiyum karbonat kristalleri içinde veya içindeki organik içeriğin yüzdesini (Ağırlık/Ağırlık) ölçtük. Kristaller asetik asitle çözülür ve biyopolimer çözelti içine serbest bırakıldı. Biopolimer karakteristik emici spektrumuna sahip olduğu durumlarda, çözelti konsantrasyonu tespit edilebilir. Aromatik yan gruplar içeren proteinler durumunda, burada TapA burada durumda çalışması gibi, 280 nm de emici kullanılır. Eklenti emici spektrum, asit kristalleri çözünmesi aşağıdaki ölçülen, Şekil 6 (yeşil) kontrol spektrum ile birlikte gösterilir (katkı olmadan asit-çözünmüş kalsiyum karbonat kristalleri; siyah). Beer-Lambert Yasası kullanarak (adım 2.3.5 bakın) ve 29.700 M-1 cm-1bir tükenme katsayısı kullanarak, biz eklenti kütle yüzdesi 1,8% ± 0,2% olduğunu bulduk. Biyopolymerler düşük pH 'de toplanmaz zaman asit kristal çözünme aşağıdaki çözümün emici ölçmek mümkündür. Katkı maddesi içeren çözelti emici bir null sinyal onun toplama göstergesidir. Bu durumda, termal yerçekimi Analizi (TGA) gibi farklı analiz yöntemleri, kristallerin içinde/içinde bulunan katkı maddelerinin kütlesini tahmin etmek için kullanılabilir.
Şekil 1 : Kalsiyum karbonat kristalleri oluşumu için hızlı buharı difüzyon yönteminin şematik açıklaması. Bir kalsiyum içeren çözünür tuz (örneğin, kalsiyum klorür) bir Amonyum karbonat tozu yakın yerleştirilir. Burada bir 96-kuyu plakasında iki kuyu gösteriyoruz. Plaka sonra mühürlü, ve amonyum karbonat amonyak ve kalsiyum-iyi içeren, kalsiyum karbonat kristalleri (burada bir kalsit kristali SEM görüntü tarafından gösterilen) yağış sonuçlanan difüzik karbondioksit içine bölünmüştür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Kalsiyum karbonat kristallerinin optik mikroskop görüntüleri. Temiz bir kontrol çoğunlukla rombohedral kristaller (A) ile karakterize kalsit içerir. Denetim örneği küresel kristalleri (kırmızı bir daire tarafından işaretlenmiş olanlar gibi) (B) içeriyorsa, temizleme protokolünü Bölüm 1.1.1 ' de önerilen şekilde yineleyin. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : İki kontrol deneyinde oluşan kalsiyum karbonat kristalleri Tarama elektron MİKROGRAFİ. (A) çoğunlukla rhombohedral kristaller (kalsit) içeren bir örnek bir görüntü. (B) büyük olasılıkla vaterite olan kırık kalsit yönleri ve küresel kristaller ile bir örnek bir mikrograf. Bu durumda, denetim denemeleri tekrarlanması gerekir. Bu rakam Azulay ve ark.16' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Bir protein TapA varlığında oluşan kalsit kristalleri SEM görüntüler. Ölçek çubukları sırasıyla 50 μm (A) ve 10 μm (B) temsil eder. Bu rakam Azulay ve ark.16' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Raman spektrumları iki polimorphs kalsiyum karbonat. (A) kalsit. (B) vaterite. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6 : UV/VIS emici spektrumları TapA (yeşil) ve tampon solüsyonu (100 mm NaCl, 25 mm Tris pH 8,0; Siyah). Emilme, asit içinde onların çözünme aşağıdaki kalsiyum karbonat kristalleri TapA konsantrasyonu hesaplamak için kullanıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntem, organik katkı maddelerinin varlığında kalsiyum karbonat kristalleri oluşturma ve organik biyopolymerlerin Morfoloji ve kalsiyum karbonat kristallerinin yapı üzerindeki etkisini değerlendirmek amaçlanmaktadır. Bu yöntem, kontrol deneyinde oluşan kalsit kristalleri için organik katkı maddelerinin varlığını oluşturduğu kristallerin karşılaştırılması üzerine kurulmuştur. Kalsiyum karbonat kristalleri oluşturmak için difüzyon yönteminin nasıl kullanılacağını, optik ve elektron mikroskobu kullanarak morfolojisini nasıl karakterize ettiğimizi, Raman spektroskopisini kullanarak yapısını nasıl karakterize ettiğimizi ve organik içeriğin nasıl belirleneceğini gösterdik. kristallerin (ağırlık/ağırlık yüzdesi).
Biz bir bakteriyel ekstrasellüler protein etkisini değerlendirmek için kullanılan protokol tarif, TapA, Morfoloji ve kalsiyum karbonat yapısı, ancak protokol biyolojik olarak saflaştırılmış veya sentezlenen diğer polimer için harcanabilir. Tek bir biyopolimer etkisine ek olarak, bu yöntem, kalsiyum karbonat yağış üzerindeki etkisi farklı polimerler arasında herhangi bir muteviye değerlendirmek için biolitik karışımları ile kullanılabilir. Biz 96-Well plaka deneysel set-up sınırlıdır; Ancak, kalsiyum karbonat çözeltisinin yerleştirildiği ve amonyum karbonat kaynağından fiziksel olarak ayrıldığı diğer herhangi bir ayarlama (yani, çözümler ve toz mühürlü bir gemiye yerleştirilir), mümkündür. Kullanılan tipik gemiler Multi-Well plakaları ve 10-50 mm tipik bir konsantrasyon aralığı 96-kuyu plakaları10,16,23ile deneysel bir set-up için kullanılır. Mühürlü bir kabı veya bir kurutucu da kullanılabilir.
Bu yöntemin kullanımı kolaydır ve düşük konsantrasyonlarda ve düşük hacimlerde biyopsi katkı maddeleri ile uyumludur. Çok kuyu plakasında çalışmak, çoklu parametrelerin aynı anda tek bir çok kuyu plaka deneyinde taramasını sağlar. Bu yöntem, Amonyum karbonat tozu pozisyonuna göre kalsiyum karbonat kuyuları göreli konumuna duyarlı olabilir. Bu nedenle, bakım her zaman çok iyi plaka aynı konumda kuyular kullanmak için alınmalıdır ve aynı zamanda kuyuların konumunu değişen sonuçları etkilemez kontrol etmek. Normalde, deneyler gerçekleşecek kuyular ve amonyum karbonat tozu arasında yeterince büyük bir mesafe kullanarak, sonuçların yeniden üretilebilmesini sağlar. Buna ek olarak, bir bölüm 1.1.2 açıklandığı gibi ayrı kristaller kontrol deneyinde oluşur, böylece CaCl2 çözeltisi konsantrasyonu ayarlamak için önemlidir. Katkı maddeleri konsantrasyonu da hiçbir etkisi gözlenen aşağıda minimal konsantrasyon aşmak için optimize edilmelidir. Yöntemin katkı maddelerinin konsantrasyonuna son derece duyarlı olduğunu unutmayın; farklı katkı konsantrasyonları kalsiyum karbonat kristalleri24Morfoloji ve yapısı üzerinde farklı bir etkiye neden olabilir.
Bu yöntemin bir büyük sınırlama amonyak ve CO2 hem kalsiyum klorür test çözümleri içine diffü ve bu nedenle deney boyunca pH zayıf kontrolü vardır. Amonyak difüzyon sonucu olarak, çözelti içinde pH artar (amonyum olur), denge denklemlerinde gösterildiği gibi5,6 ((NH4)2Co3 (s) → 2nh3 (g) + Co2 (g) + H 2 O(l), NH3 (aq) + H2O(l) → NH4+(aq) + Oh-(aq), CA2 +(aq) + Co2 (aq) + 2oh-(aq) Caco3 (s) + H2O (l)) ve kalsiyum karbonat oluşumuna iyilik.
Giriş içinde açıklanan ek yöntemler ile karşılaştırıldığında, bu yöntem Teknik olarak basittir. Yavaş yağış süreci nedeniyle, kristal büyüme gerçek zamanlı olarak takip edilebilir, şeffaf Multi-Well tekniği emici veya saçılma teknikleri kullanarak. Buna ek olarak, kristal büyümenin kinetiği takip etmek için, bir de farklı zaman noktalarında kristal Morfoloji ve yapı prob olabilir, yerine 20 saat sonra, bizim çalışmada gerçekleştirilen gibi. Bu yöntem, magnezyum, baryum ve kadmiyum karbonatlar gibi küçük bir yeterli KSP taşıyan karbonat diğer tuzlarının yağış çalışması için genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Prof. Lia Addadi, Prof. Jonathan erez ve Dr. Yael Politi 'ye verimli tartışmalar için teşekkür etmek ister. Bu araştırma Israil Bilim Vakfı (ıSF), Grant 1150/14 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Gadot | 64-19-7 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 506-87-6 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 10035-04-8 | |
| Ethanol Absolute | Gadot | 64-17-5 | |
| Micro-Raman | Renishaw | inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 90i model | |
| Nis elements Br software | Nikon | For microscope imaging | |
| Scanning Electron Microscope | ThermoFisher Scientific | FEI Sirion microscope | |
| Spectrophotometer | JASCO | V-670 model | |
| Sputter coater | Polaron | SC7640 model |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190 (4212), 377-379 (1975).
- Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase. Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).
- Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).
- Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. Biomineralization: from nature to application. 12, John Wiley & Sons. (2008).
- Nielsen, M. H., Lee, J. R. I. Methods in Enzymology. De Yoreo, J. J. 532, Academic Press. 209-224 (2013).
- Page, M. G., Cölfen, H. Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly. Crystal Growth & Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).
- Wang, H., Huang, W., Han, Y. Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate. Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).
- Sedlák, M., Antonietti, M., Cölfen, H. Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals. Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).
- Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. Pure aragonite synthesis. Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).
- Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization. CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).
- Gehrke, N., Cölfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment. Crystal Growth & Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).
- Rudloff, J., et al. Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3. Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).
- Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon. Nature. 246, 527 (1973).
- Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. Geochemical Perspectives on Coral Mineralization. Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).
- Erez, J. Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons. Nature. 273, 199 (1978).
- Azulay, D. N., et al. Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals. Crystal Growth & Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).
- Abbasi, R., et al. The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein. ChemBioChem. , (2018).
- Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).
- Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. 571-607 (2005).
- Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure. Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).
- Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications. Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).
- Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).
- Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension. Polymer Journal. 42, 583 (2010).
- Magnabosco, G., et al. Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies. CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).
