Fremstillingsprocessen af en PDMS-baseret, flerlags, mikrofluidisk enhed, der tillader in vitro transkription og oversættelse (ivtt) reaktioner, der skal udføres over længere perioder er beskrevet. Desuden gives der en omfattende oversigt over den hardware og software, der kræves for at automatisere og vedligeholde disse reaktioner for længerevarende varigheder.
Begrænsningerne af celle-baseret syntetisk biologi bliver stadig tydeligere, da forskerne har til formål at udvikle større og mere komplekse syntetiske genetiske regulerende kredsløb. Analysen af syntetiske genetiske reguleringsnetværk in vivo er tidskrævende og lider under manglende miljøkontrol, med eksogene syntetiske komponenter, der interagerer med værts processer, hvilket resulterer i uønsket adfærd. For at overvinde disse problemer, celle-fri karakterisering af nye kredsløb er ved at blive mere udbredt. In vitro transskription og oversættelse (IVTT) blandinger tillader regulering af forsøgs miljøet og kan optimeres for hvert unikt system. Protokollerne præsenteres her detaljer fremstilling af en flerlags mikrofluidisk enhed, der kan udnyttes til at opretholde ivtt reaktioner for længerevarende varigheder. I modsætning til batch reaktioner, hvor ressourcer er opbrugt over tid og (af-) produkter akkumuleres, brugen af mikrofluidisk enheder giver mulighed for genopfyldning af ressourcer samt fjernelse af reaktionsprodukter. På denne måde er det cellulære miljø emuleret ved at opretholde en out-of-ligevægt miljø, hvor den dynamiske opførsel af genkredsløb kan undersøges i længere tid. For fuldt ud at udnytte den flerlags mikrofluidisk enhed, hardware og software er blevet integreret for at automatisere ivtt reaktioner. Ved at kombinere ivtt reaktioner med den mikrofluidisk platform præsenteret her, bliver det muligt at omfattende analysere komplekse netværk adfærd, fremme vores forståelse af de mekanismer, der regulerer cellulære processer.
Celler er i stand til at fornemme og reagere på deres omgivelser ved hjælp af komplekse dynamiske regulerende netværk1,2. Feltet af syntetisk biologi udnytter vores viden om de naturligt forekommende komponenter, der omfatter disse netværk til ingeniør biologiske systemer, som kan udvide funktionaliteten af cellerne3,4. Omvendt er det også muligt at fremme vores forståelse af de naturlige netværk, der styrer livet ved at designe forenklede, syntetiske analoger af eksisterende kredsløb eller ved fremad-Engineering biologiske systemer, som udviser naturligt forekommende adfærd. De Novo engineering af sådanne biologiske systemer udføres på en bottom-up mode, hvor nye genetiske kredsløb eller signalveje er konstrueret på en rationel måde, ved hjælp af veldefinerede dele5,6. Kombinationen af den rationelle udformning af netværk med udformningen af biologisk relevante systemer gør det muligt dybdegående karakterisering og undersøgelse af biologiske reguleringssystemer med forskellige niveauer af abstraktion7.
De pioner værker af Elowitz og Leibler8 og Gardner et al.9 var de første til at demonstrere den vellykkede indførelse af syntetiske genetiske netværk i cellulære værter. I det følgende årti har talrige forskere fortsat med at bygge videre på disse første succeser på trods af fremkomsten af flere begrænsninger med hensyn til indførelsen af syntetiske kredsløb i cellerne7,10,11 ,12. Ideelt set bør indførelsen af syntetiske kredsløb i cellulære værter ske i en modulær måde. Desværre gør kompleksiteten af det cellulære miljø dette særligt udfordrende, med funktionen af mange dele og netværk er meget kontekstafhængige12,13,14. Som et resultat, netværk ofte oplever uønskede interaktioner med indfødte vært der som kan påvirke funktionen af syntetisk kredsløb. På samme måde kan komponenter i det udefrakommende netværk hæmme værts processerne, konkurrere om fælles ressourcer inden for værten og påvirke vækst kinetikken15,16,17. Med henblik på rationelt at udforme og forudsige adfærden af syntetiske net i et in vivo-miljø kræves der derfor en omfattende model af alle værts-og kredsløbs specifikke dynamikker18.
Et levedygtigt alternativ til brugen af cellulære værter til karakterisering af syntetiske net er anvendelsen af in vitro transkription og oversættelse (IVTT) teknologier. Som en test for syntetiske net udføres der reaktioner i opløsninger, som omfatter alle de komponenter, der er nødvendige for at muliggøre genekspression19,20,21. På denne måde skabes et biologisk relevant, omend kunstigt, miljø, inden for hvilket syntetiske net kan testes22,23,24,25,26, 27,28. En stor fordel ved at bruge IVTT løsninger er evnen til at udføre reaktioner under bruger-specificerede betingelser, med forskerne i stand til at tune den præcise sammensætning af hver reaktion2. Desuden, den celle-fri tilgang muliggør High-gennemløb afprøvning af syntetiske netværk, da det fjerner behovet for at udføre tidskrævende cellulære kloning trin. Som et resultat, varigheden af successive design-build-testcyklusser er væsentligt reduceret29,30,31,32. Design cyklussen kan accelereres yderligere ved at anvende celle frie kloningsteknikker såsom Gibson assembly til hurtigt at konstruere nye netværk, og ved at opbygge netværk fra lineære DNA-skabeloner, som-i modsætning til plasmider kræves til in vivo test- kan forstærkes via polymerase kædereaktioner (PCR)33,34.
Batch reaktioner er den enkleste metode, hvormed IVTT reaktioner kan udføres, kræver et enkelt reaktions fartøj, hvori alle reaktions komponenterne kombineres35. Sådanne reaktioner er tilstrækkelige til protein ekspression og grundlæggende kredsløb test endnu vise sig utilstrækkelige, når de forsøger at studere den langsigtede dynamiske opførsel af et netværk. I løbet af en batch reaktion er reagenserne enten udtømte eller underkastes nedbrydning, hvilket resulterer i et kontinuerligt fald i transskription og oversættelses rater. Endvidere, som reaktioner fremskridt biprodukter ophobes, der kan forstyrre-eller helt hæmme-den korrekte funktion af netværket. I sidste ende begrænser brugen af batch reaktorer den dynamiske adfærd, der kan iagttages, idet negativ regulering er særligt udfordrende at implementere5,36.
Alsidigheden af ivtt-systemer muliggør flere alternative metoder, som forlængede ivtt-reaktioner kan udføres, lige fra kontinuerlig flow til dråbe baserede metoder samt enklere dialyse tilgange2,30, 37,38,39,40. Anvendelsen af mikrofluidisk-enheder giver brugerne øget kontrol over deres reaktioner og samtidig øge gennemløb og minimere omkostningerne35,41,42, med hver specifik tilgang, der har sin egne fordele. Brugen af kontinuerlig flow kan nemt optimeres for at øge ekspression udbytter dog, den manglende evne til effektivt at fjerne specifikke reaktionsprodukter gør studiet af dynamisk opførsel ikke-triviel39. Mens anvender dråbe baserede mikrofluidisk systemer giver høj gennemløb screening af nye netværk, vanskeligheden ved at levere friske reagenser til reaktionen resulterer i dråberne ligner små volumen batch reaktioner43. Dialyse baserede reaktorer tillader indførelse af friske reagenser samt fjernelse af nogle reaktionsprodukter men, RNA molekyler og større proteiner ophobes i reaktoren, at være for stor til at sprede gennem membranen porer. Desuden kræves store mængder reagenser for at opretholde disse reaktioner i længere perioder30,44. I 2013 præsenterede maerkl et al. en multi-lags mikrofluidisk-anordning designet specielt til at udføre forlængede ivtt-reaktioner36,45. Brugen af flerlags mikrofluidiske enheder giver mulighed for direkte kontrol over væskestrømmen, hvilket giver mulighed for omdirigering af flow samt isolering af væske i specifikke områder af enheden46,47. Disse isolerede regioner kan fungere som uafhængige nanoliter-skala reaktions kamre, hvor IVTT reaktioner kan udføres. I løbet af en enkelt IVTT-reaktion anvendes periodiske injektioner af friske reagenser i reaktoren til genopfyldning af IVTT-komponenter og DNA-skabeloner. Samtidig forskydes en tilsvarende mængde af den gamle reaktions opløsning, hvorved reaktionsprodukter fjernes. På denne måde opretholdes en out-of-ligevægt miljø, hvor de basale transkription og oversættelse satser forblive i Steady-State, forlænge levetiden af IVTT reaktioner og giver rig dynamisk adfærd at forekomme. Ved at anvende denne fremgangsmåde, forskerne er i stand til at undersøge de kinetiske rater af de enkelte processer, der opstår inden for et bestemt kredsløb, medvirken i frem-engineering af nye genetiske netværk. For eksempel, niederholtmeyer et al. implementeret denne fremgangsmåde til at karakterisere forskellige elementer af en genetisk ring oscillator, fastsættelse af kinetiske satser heraf36. I yderligere undersøgelser viste Yelleswarapu et al., at de kinetiske rater af Sigma faktor 28 (σ28) bestemt under batch betingelser ikke var tilstrækkelige til at beskrive adfærden af en σ28-baseret oscillator, og at tilføjelsen af flow-baserede data forbedrede model forudsigelser af netværkets opførsel22.
Formålet med dette manuskript er at fremlægge en komplet protokol til fremstilling af flerlags mikrofluidiske enheder, der kan udføre langvarige IVTT-reaktioner. Desuden vil dette manuskript beskrive al den hardware og software, der kræves for at udføre forlængede IVTT-reaktioner. Aktivering af den mikrofluidisk enhed-nødvendig for at kontrollere strømmen af væsker deri-opnås ved hjælp af en serie af pneumatiske ventiler, der tilsluttes direkte til de mikrofluidisk enheder via længder af slanger. Til gengæld styres pneumatiske ventiler via en specialbygget virtuel kontrol grænseflade. Væskestrømmen i de mikrofluidiske anordninger opnås ved hjælp af kontinuerligt tryk, som leveres af et kommercielt tilgængeligt tryk reguleringssystem. IVTT-reaktioner udføres typisk mellem 29 °C og 37 °C, og en mikroskop inkubator anvendes til at regulere temperaturen under reaktionerne. Imidlertid nedbrydes funktionaliteten af IVTT-blandingen gradvist, når den opbevares over 4 °C. Som sådan vil dette manuskript ekspandere på off-chip kølesystemet bruges til at køle ivtt blandingen før injektion i mikrofluidisk enhed. Afslutningsvis giver dette manuskript et omfattende overblik over de procedurer, der er nødvendige for at kunne udføre længerevarende IVTT-reaktioner ved hjælp af en mikrofluidisk strømnings reaktor, således at andre forskere vil være i stand til at replikere denne teknologi med relative Lethed.
En PDMS-baseret flerlags mikrofluidisk-enhed er blevet præsenteret, og dens evne til at opretholde ivtt-reaktioner i længere perioder er blevet påvist. Selvom velegnet til dette specifikke eksempel, denne teknologi kan tænkes bruges til mange andre applikationer. Den ekstra kontrol over fluid flow-parret med evnen til kontinuerligt at genopbygge reaktions reagenser, mens du fjerner (ved) produkter-er ideel til kontinuerlige syntese reaktioner, undersøgelse af forskellige dynamiske adfærd, og den samtidige overledning af flere variationer af en enkelt reaktion.
På trods af den relativt ligetil fabrikationsproces af PDMS-baserede enheder kræver brugen heraf en omfattende hardware opsætning. Bestående af ventilsystemer, trykregulatorer, tryk pumper, inkubatorer og køleenheder er overgangen fra fabrikation til brug ikke elementær og kræver en betydelig initialinvestering. Desuden kræver evnen til konsekvent at oprette og udføre vellykkede eksperimenter med disse anordninger en betydelig tidsinvestering; et punkt, som dette manuskript har til formål at løse. Men når du er på plads, kan hele opsætningen ændres til en række formål. Desuden består hardware opsætningen af talrige modulære elementer, som hver kan udvides, så det er muligt at arbejde med mere komplekse mikrofluidiske enheds designs. Derudover muliggør det modulære design udskiftning af hardwarekomponenter ved tilsvarende fungerende alternativer, således at brugerne ikke er begrænset til den specifikke opsætning, der er beskrevet her48,49.
Variabilitet mellem de enkelte enheder og under de ydre forhold (f. eks. trykudsving) kan resultere i unøjagtigheder, når de udfører eksperimenter ved hjælp af disse enheder. For at løse dette problem skal der udføres en kalibrering af systemet før hvert eksperiment, hvilket giver et unikt opdaterings forhold for hver af reaktorerne. Mens kalibreringen adresserer enheden-til-enhed og eksperiment-til-eksperiment variationer, er det en tidskrævende proces og ikke fejlfri. Væsker med forskellige viskositeter vil ikke flyde med samme hastighed, når de udsættes for identisk tryk, og som sådan udfører kalibreringen med flere reagenser, kan ikke give identiske opdaterings forhold. Denne effekt dæmpes ved at anvende tre kontrol kanaler til Peristaltisk at pumpe reagenserne ind i den mikrofluidiske enhed i modsætning til regulering af strømmen ved at variere det medfølgende tryk. Som en sidste udvej i tilfælde, hvor forskellen i viskositet er meget stor, kan der implementeres et unikt opdaterings forhold for hver enkelt reagens ved at udføre flere kalibrerings eksperimenter.
Brugen af en peristaltisk pumpe til injektion af reagenser i den mikrofluidiske anordning dæmper virkningerne af at anvende opløsninger med varierende viskositeter, men det skaber også et sekundært problem. Ved hjælp af diskrete trin til pumpning af væsker ind i den mikrofluidiske anordning, betyder, at opløsningen af injektioner i en enkelt reaktor, er begrænset af den mængde, der injiceres, når du udfører en enkelt pumpe cyklus. Inden for vores forskning er denne værdi-bestemt under kalibreringen-omtrent lig med 1%, hvilket indikerer, at en enkelt pumpe cyklus forflytter ca. 1% af reaktor volumenet (ca. 0,1 nL). Som sådan kræver forskydningen af 30% af reaktor volumenet udførelse af 30 pumpe cyklusser med 23 pumpe cyklusser af ivtt-reaktions opløsningen, og der tilsættes kun 7 pumpe cyklusser af DNA eller ultrarent vand. Selv om de er tilstrækkelige til vores forskning, kan alternative forsøgsprotokoller støde på problemer, når de forsøger at tilføje et større antal unikke reagenser, bruge en lavere opdaterings fraktioneller tilføje mindre volumener af en enkelt reagens til en reaktor. I sådanne tilfælde kan mikrofluidic enhedens design tilpasses til at give reaktorer med en større volumen. Et eksempel på en sådan er rapporteret i Niederholtmeyer et al.36.
Det er afgørende, at anordningen, der er skitseret i dette manuskript, gør det muligt at opretholdes reaktioner ved længerevarende varigheder, hvilket resulterer i transkription og oversættelses rater i steady state. Ved periodisk indsprøjtning nye reagenser i reaktorerne-og fjerne reaktion (af) produkter-Reaktionerne er vedvarende og komplekse dynamiske adfærd kan overvåges. På denne måde er der skabt en platform, som-til en vis grad-efterligner det cellulære miljø. Endvidere, denne platform muliggør udforskning af systemets dynamik, ved at tilpasse perioden mellem injektioner og den specifikke sammensætning af injektionerne. Som følge heraf er disse flerlags mikrofluidiske enheder et effektivt værktøj til karakterisering og optimering af nye syntetiske net, der udviser kompleks dynamisk adfærd.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det europæiske forskningsråd, ERC (projekt n. 677313 BioCircuit), et NWO-VIDI-stipendium fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO, 723.016.003), støtte fra ministeriet for uddannelse, kultur og videnskab (Gravity programmer, 024.001.035 & 024.003.013), Human Frontier Science program Grant RGP0032/2015, det Europæiske Forskningsråd under den Europæiske Unions Horizon 2020 forsknings-og innovationsprogram Grant 723106, og en schweizisk National Science Foundation Grant 200021_182019.
Reagents | |||
Acetone | VWR | 20063.365 | |
AZ 40 XT | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | – | Positive Photoresist |
AZ 726 MIF Developer | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | – | Developer Positive Photoresist |
Isopropanol | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
Microscope slides | VWR | ECN 631-1550 | |
mr Dev 600 | Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) | – | Developer Negative Photoresist |
Silicon Free Heat Sink Grease | Circuit Works | CW7270 | Thermal Compound |
Silicon wafers | Silicon Materials | – | <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness |
SU-8 3050 | Microchem Corp. (Newton, MA) | – | Negative Photoresist |
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) | The Dow Chemical Company | 01317318 | |
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
4 channel digital input/output module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-504 | 8x |
Camera lens | The Imaging Source | – | |
Compression fitting | Koolance, Inc. | FIT-V06X10 | Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x |
Controller end module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-600 | |
Device connecting tubing | Saint-Gobain Performance Plastics | AAD04103 | 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80) |
Device connector pins | Unimed SA (Lausanne, Switserland) | 200.010-A | AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L |
Ethernet Controller | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-881 | |
Female bus connector | Encitech | DTCK15-DBS-K | 15 pole female bus connector |
Fluid reservoirs | Fluigent | Fluiwell-4C | |
Fluigent pressure system | Fluigent | MFCS-EZ | 0 – 345 mbar |
Hg short arc lamp | Advanced Radiation Corporation | – | 350W |
Hot plate | Torrey Pines Scientific | HP61 | |
Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-E | |
LabVIEW Software | de Greef Lab, Eindhoven University of Technology | https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software | |
Liquid coolant | Koolance, Inc. | LIQ-705CL-B | |
Luer stubs | Instech Laboratories, Inc. | LS23 | |
Male Luer to barb connectors | Cole Parmer | 45505-32 | 3/32" ID |
Matlab Software | de Greef Lab, Eindhoven University of Technology | https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software | |
Microcamera | The Imaging Source | DMK 42AUC03 | |
Microscope camera | Hamamatsu Photonics | OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU) | |
Orbital shaker | Cole Parmer | EW-513000-05 | |
Oven | Thermo Scientific | Heraeus T6P 50045757 | |
Oxygen plasma asher | Quorum Technologies | K1050X | |
PDMS puncher | SYNEO | Accu-Pucnh MP10 | |
PEEK tubing | Trajan | 1301005001-5F | 0.005" ID, 1/32" OD, Red |
Peltier element | European Thermodynamics | APH-127-10-25-S | |
Peltier temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | |
Photomask | CAD/Art Services, Inc. | – | |
Photomask Design | Maerkl Lab, EPFL | https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ | |
Pneumatic valve array | FESTO | – | 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves. |
Power adapter | Koolance, Inc. | ADT-EX004S | 110/220V AC Power Adapter |
PTFE tubing | Cole Parmer | 06417-21 | #24 AWG Thin Wall PTFE |
Punching pin | SYNEO | CR0320245N21R4 | OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm) |
PVC Tubing | Koolance, Inc. | HOS-06CL | 6 mm ID, 10 mm OD |
Single edge blades | GEM Scientific | – | |
Soft tubing | Fluigent | – | Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD) |
Spin coater | Laurell Technologies Corporation | WS-650MZ-23NPPB | |
Stereo microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
Thermistor cable | Warner Instruments | TA-29 | Cable with bead thermistor |
UV exposure system | ABM, USA | – | Near UV Exposure System, 350W |
Vacuum pump | Vacuumbrand GmbH | MD1C | |
Water cooled cold plate block | Koolance, Inc. | PLT-UN40F | |
Water cooler | Koolance, Inc. | EX2-755 | |
Weighing scales | Sartorius | M-prove |