Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Høj gennemløbs analyse af optiske kortlægnings data ved hjælp af Elektromap

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/59663
Automatic Translation
1,2,3, 1,4, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 5, 1, 1, 3, 1
1Institute of Cardiovascular Sciences, University of Birmingham, 2EPSRC Centre for Doctoral Training in Physical Sciences for Health, School of Chemistry, University of Birmingham, 3School of Computer Science, University of Birmingham, 4Institute of Clinical Sciences, University of Birmingham, 5Institute of Microbiology and Infection, School of Biosciences, University of Birmingham

Summary

Denne protokol beskriver opsætningen og brugen af Elektromap, en MATLAB-baseret open source-software platform til analyse af kardiale optiske kortlægnings data. ElectroMap giver et alsidigt værktøjer med høj gennemløb til analyse af optisk kortlægnings spænding og calcium datasæt på tværs af en bred vifte af kardiale eksperimentelle modeller.

Abstract

Optisk kortlægning er en etableret teknik til høj spatio-temporale opløsning undersøgelse af hjertets Elektrofysiologi i multi-cellulære præparater. Her præsenterer vi i en trinvis vejledning brugen af Elektromap til analyse, kvantificering og kortlægning af højopløsnings spænding og calcium datasæt erhvervet ved optisk kortlægning. Elektromap analysemuligheder dækker en bred vifte af centrale elektrofysiologiske parametre, og den grafiske brugergrænseflade muliggør ligetil ændring af forbehandling og parameterdefinitioner, hvilket gør Elektromap gældende for en bred vifte af eksperimentelle modeller. Vi viser, hvordan indbygget pacing frekvens detektering og signal segmentering giver mulighed for en høj gennemløbs analyse af hele eksperimentelle optagelser, akutte reaktioner og single Beat-to-beat variabilitet. Derudover inkorporerer Elektromap automatiseret multi-Beat gennemsnit for at forbedre signalkvaliteten af støjende datasæt, og her viser vi, hvordan denne funktion kan hjælpe med at belyse elektrofysiologiske ændringer, der ellers ville gå uopdaget, når du bruger single Beat-analyse. Brugerdefinerede moduler er inkluderet i softwaren til detaljeret undersøgelse af ledning, enkelt fil analyse, og alternans, som påvist her. Denne software platform kan bruges til at aktivere og fremskynde behandling, analyse og kortlægning af komplekse kardielle Elektrofysiologi.

Introduction

Optisk kortlægning udnytter fluorescerende reportere af spænding og/eller calciumkoncentration til at afhøre hjertets Elektrofysiologi (EP) og calcium håndtering i flercellede præparater, med større rumlig opløsning end opnåelige med traditionelle teknikker1,2,3. Derfor er optisk kortlægning dukket op som en vigtig og stadigt mere anvendt teknik, der giver vigtig indsigt i fysiologiske og patofysiologiske elektriske adfærd i hjertet3,4,5 ,6,7,8. En effektiv behandling og analyse af data indhentet fra eksperimenter med optisk kortlægning kompliceres af flere faktorer. Den høje spatiotemporale opløsning karakter af optiske kortlægning datasæt resulterer i rå videoer filer bestående af tusindvis af billedrammer, hver består af en række individuelle pixels, hvilket giver anledning til store datafiler, der kræver høj hastighed og automatiseret forarbejdning9. Små pixelstørrelser, dårlig og ujævn farve belastning og små brøk ændringer i fluorescens resulterer i optiske signaler med lavt signal-støjforhold (SNR), der kræver forbehandling før effektiv analyse er opnåelig10. Behandling og analyse kan kompliceres yderligere ved brug af optogenetiske pacing protokoller, som udnytter lys til at starte aktivering, potentielt forvrænge det optagede signal fra lysstofrør11,12. Når data er blevet behandlet, kan der desuden anvendes flere ikke-konsekvente teknikker og definitioner til at måleparametre af interesse, idet de mest anvendelige teknikker varierer afhængigt af forsøgs opsætning, model og spørgsmål2. 10,13. Disse begrænsninger forhindrer yderligere udbredelse af teknologien og hindrer en virkelig objektiv analyse.

For at overvinde disse begrænsninger, har flere forskningsgrupper designet brugerdefinerede forarbejdning rørledninger skræddersyet til deres eksperimentelle model, spørgsmål og hardware7,14,15,16. Andre udnytter kommerciel proprietær software, hvor de underliggende algoritmer kan være svært at få adgang til4,17. Som følge heraf er der et klart behov for en frit tilgængelig open source-software platform til behandling og analyse af optiske kortlægnings data. Det er vigtigt, at denne software er open source, nem at bruge, fleksibel til parameter justering, der gælder for en række eksperimentelle modeller med særskilte EP egenskaber og afgørende tillader ligetil og tunable kvantificering af rækken af hjerte parametre, der kan undersøgt ved hjælp af optisk tilknytning.

Vi har for nylig udgivet og udgivet en omfattende software platform, Elektromap, til high-hele, semi-automatiseret behandling, analyse og kortlægning af kardiale optiske kortlægning datasæt13. Her præsenterer vi en video manual for udnyttelsen af Elektromap og demonstrere, hvordan det kan bruges til at behandle, analysere og kortlægge flere optiske kortlægning datasæt. Vi fokuserer på brugen af Elektromap til at kvantificere standard EP og calcium håndtering variabler og demonstrere brugen af standalone lednings hastighed, enkelt fil analyse og alternans moduler.

Protocol

1. indsamling af optisk kortdata

  1. Udfør kardiel optisk kortlægning ved hjælp af en af en bred vifte af eksperimentelle modeller, herunder intakt og isoleret hele hjerter6,18, isoleret Atria14,19, ventrikulære kiler20, hjerte skiver 21 , 22, og cellulære monolag23. Se tilknyttede referencer for eksperimentelle designs for at indsamle rå optiske kortlægnings data fra disse præparater. Forudsat at de indhentede data kan konverteres til en TIFF-stak eller gemmes i en. MAT-fil, skal den kunne analyserbar ved hjælp af Elektromap. Dette omfatter data af varierende dimensioner (kvadratisk/rektangulær) og opløsninger (maksimum testet i øjeblikket 2048 pixels x 2048 pixels).

2. software installation og opstart

Bemærk: nedenfor er detaljeret de to metoder til at installere og køre Elektromap – enten inden for MATLAB køre fra kilde (. m) kode eller som en standalone eksekverbar fil (. exe til Windows). Den endelige software og dens funktionalitet er invariant mellem de to opsætningsmuligheder (bortset fra nogle få forskelle i mappe navigation). Derfor er de vigtigste overvejelser for at vælge version til at installere adgang til MATLAB og krævede værktøjskasser og om adgang til kildekode ønskes. Hvor det er muligt, anbefales det at bruge MATLAB-versionen til hurtigere opstartstider, kortere behandlingstid og nemmere fejlrapportering.

  1. Setup 1: kører elektromap inden for MATLAB
    1. Installer MATLAB. ElectroMap blev designet i MATLAB 2017a, men, software er blevet testet til brug i alle efterfølgende udgivelser af MATLAB (op til 2018b på tidspunktet for skrivning). Følgende værktøjskasser er påkrævede: billedbehandling, signal behandling, statistik og maskinel indlæring og kurve montering.
    2. Download/klon alle filer fra den seneste ' kildekode ' frigivelse af Elektromap fra GitHub repository (https://github.com/CXO531/ElectroMap). Udpak det hentede indhold til den ønskede placering.
    3. Åbn MATLAB, og Naviger til den mappeplacering, som er vært for Elektromap-kildekoden. Åbn derefter filen electromap. m , og tryk på Kør i editoren, eller alternativt type elektromap i kommandovinduet, og tryk på Returtasten. Dette vil starte Elektromap brugergrænseflade, figur 1a.
  2. Setup 2: standalone. exe fil
    1. Hent installationsfilen: https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI.
    2. Følg instruktionerne i installationsprogrammet, som vil downloade krævede MATLAB Runtime fra internettet sammen med Elektromap software.
    3. Kør Electromap. exe.
      Bemærk: opstart tid for den standalone version kan være flere minutter.

3. indlæsning af billede og forbehandling

  1. Tryk på Vælg mappe , og Naviger til placeringen af den eller de datafiler, der skal analyseres. Dette vil udfylde den venstre liste med alle filer i denne mappe, der er af den korrekte filtype (. tif eller. MAT). . MAT-filer må kun indeholde billedstak variablen.
    Bemærk: kun mapper og ikke individuelle filer vises, når du navigerer gennem Biblioteks vælgeren.
  2. Vælg fil, der skal indlæses fra i grænsefladen, og tryk på Indlæs billeder.
    1. Når indlæst, det første billede vises, og den røde kontur vil indikere automatisk tærskel for billedet. Hvis det er nødvendigt, skal du genindlæse tidligere brugte ROIs ved at vælge Gem/Indlæs ROI. I dette tilfælde, springe trin 3,3.
    2. Som standard er tærskel baseret på pixel intensiteterne i det første billede. Hvis det ønskes, ændre dette til en tærskel baseret på signalet Time Course amplitude ved at ændre indstillingen i billedet for tærskel rullemenuen. Bemærk, at når tærskel er valgt, anvendes den derefter til hele billed stakken.
  3. Hvis det ønskes, skal du ændre tærskel indstillingen til Manuel, som aktiverer skyderen for manuelt at justere billed tærsklen. Du skal desuden beskære billeder (beskære billede) og/eller tegne et brugerdefineret interesseområde (Brugerdefineret ROI) til analyse ved at vælge de relevante afkrydsningsfelt (er) under tærskelindstillinger. Bemærk, at avancerede indstillinger for område af interesse udvælgelse såsom antal områder er tilgængelige fra ROI udvælgelse fra den øverste menu.
  4. Når der er anvendt en passende tærskel, skal du trykke på proces billeder for at anvende behandlingen. Indstillingerne for behandling er beskrevet nedenfor (trin 3.4.1-3.4.5). På dette tidspunkt skal du sørge for, at de korrekte kameraindstillinger er indtastet. Disse er pixelstørrelse i ΜM (vigtigt: Dette er billedets pixelstørrelse, og ikke størrelsen af de pixels, der udgør chippen eller tilsvarende hardware i billedenheden) og frame rate i kHz.
    1. For signal inversion skal du markere afkrydsningsfeltet inverter data for at aktivere. Hvis rapporteret fluorescerende signal er omvendt proportional med parameter af interesse (som med almindeligt anvendte potentiometriske farvestoffer) signalet kan inverteres.
    2. Vælg Gaussian eller Average i kerne menuen for afstands filtrering. Størrelsen af det rumligt gennemsnit område styres af størrelsen input støder op til kernen dropdown menu (dvs. 3 resultater i 3 pixel x 3 pixel filter kernel). Når du anvender et Gaussian-filter, kan standardafvigelsen også indstilles fra Sigma -indgangen.
    3. For korrektion ved baseline skal du vælge top-hat24 eller polynomium (4th eller 11th grad) korrektion25 fra baseline menuen. Korrektion kan anvendes på hver pixel individuelt (lang behandlingstid) eller som et gennemsnit af hele billedet (hurtigere, men antager homogene grundlæggende ændringer). Top-hat korrektion kan også ændres ved at indstille top-hat længde i millisekunder, støder op til den grundlæggende udvælgelse dropdown menu. Længden af top-hat kernen bør være større end tidsskalaen af de enkelte handlings potentialer/calcium transienter.
    4. For tidsmæssig filtrering, Vælg Savitzky-Goaly eller Infinite Impulse (IIR) filtrering fra filtrering menuen.
      Bemærk: andre end for det gennemsnitlige vævs signal, der vises nederst til venstre, anvendes temporale filtrering på hver pixel individuelt på tidspunktet for parameter kvantificering fra ensemble gennemsnitlige billed intervaller. Dette er blevet implementeret for at reducere behandlingstid ved at filtrere små sektioner af data, når det kræves i stedet for hele filer.
    5. Til fjernelse af billeder skal du være opmærksom på, at hvis indstillingen Fjern rammer er valgt, kan store toppe med amplitude, der er større end interesse signalet, fjernes fra billed sættet. Dette kan være nyttigt i optisk tempo datasæt såsom optogenetisk pacing hvor depolarisering initieres ved optisk aktivering af opsiner såsom channelrhodopsin 211,12.
      Bemærk: da frame Removal potentielt vil introducere ufysiologiske trin ændringer i Billedsignalerne, kan tidsmæssig filtrering introducere artefakter til dataene, og det anbefales derfor ikke her.
  5. Bemærk, at signalet vil blive segmenteret, når proces billeder er blevet valgt i henhold til mulighederne under segmenterings muligheder, men dette kan hurtigt ændres uden at genbehandle hele datasættet (Se afsnit 4).

4. data segmentering og ensemble gennemsnit

Bemærk: når filen er behandlet, vil toppe i det gennemsnitlige vævs signal (nederste højre spor, figur 1a) være blevet detekteret og mærket af røde cirkler. Kun toppe over en fastsat tærskel (blå linje på spor, der er indstillet af peak tærskel) tælles. Derudover tælles toppe kun, hvis de er tilstrækkeligt forsinkede i forhold til de tidligere toppe, der er indstillet af min peak distance input. Signalet er derefter segmenteret baseret på de detekterede toppe. For det første beregnes den effektive cyklus længde (CL) af hver spids ved at måle tiden mellem den og den næste top. Hvis et antal toppe (fastsat af min. antal toppe input) har lignende CLS (tærskel for som er fastsat af minimum grænse input) så de er grupperet og den gennemsnitlige CL for disse toppe beregnet.

  1. For yderligere segmentering af data, tryk segment signal. Sub-segmentering muligheder er: ingen – alle toppe med samme CL grupperet sammen; Alle – segmenter af ntoppe inden for konstante CL-tider (ntoppe er indstillet af segment størrelse input) er identificeret; Sidst -Final ntoppe før en CL ændring identificeres og grupperes, og alle andre er ikke analyseret; og single Beat -dette svarer til at anvende alle segmentering med nPeaks = 1, og så ingen gruppering eller ensemble gennemsnit (Se 4,5) anvendes. Dette kan anvendes ved at vælge single Beat -knappen.
    1. Anvend brugerdefineret segmentering af signalet ved at zoome ind på en tid af interesse og vælge segment signal. Dette vil tilføje en ekstra indstilling med titlen zoomet afsnit til sektions listeboks, svarende til de valgte tidspunkter.
  2. Resultaterne af segmentering vil blive vist i listen-boksen støder op til det gennemsnitligt væv signal, og vil vise sektionsnummer og den anslåede CL. Alle segmenterede tids sektioner er angivet med forskellige farver. Vælg et segment fra listefeltet for at fremhæve den pågældende sektion med rødt. Dette vil også automatisk udløse analyser af dette afsnit, som om knappen producer kort blev valgt (Se afsnit 5).
  3. Analyser af grupperede toppe vil blive udført på "ensemble gennemsnit" data. Dette indebærer gennemsnit af toppe i et segment sammen, med reference tiderne er de toppe identificeret i trin 4,2. Opdater tidsvinduet til gennemsnit ved at ændre før -og efter -input og trykke på segment signalet.

5. aktionspotentiale/calcium forbigående varighed og lednings hastighed analyse

  1. Når billederne er blevet behandlet, vil knappen producer kort blive aktiv. Tryk på producer Maps for at anvende aktions potentiel varighed (APD), aktiveringstidspunkt, lednings hastighed og SNR-analyse. Som standard vil analysen blive anvendt på det første signal segment. Vælg andre segmenter fra listefeltet vil anvende analyse på det valgte segment.
    Bemærk: resultaterne af analysen vises i resultattabellen, herunder middelværdi, standardafvigelse, standardfejl, varians og 5th til 95th percentilanalyse. Varighed kort kaldes ' APD ' kort men, calcium signaler behandlet ved hjælp af de samme indstillinger vil måle calcium forbigående varighed.
  2. Vælg Hent pixeloplysninger for at se en detaljeret visning af signalet fra en vilkårlig pixel i billedet, og Sammenlign pixel for at afbilde signaler på samme tid fra op til 6 placeringer.
    1. Brug panelet signal behandling til at justere indstillingerne for varigheds analyse. Disse er: varighed -tid af procent repolarisering/forfald at måle fra Peak; ' APD ' baseline -tidsperiode for signal, der er defineret som referencebase line for amplitude målinger; og ' APD ' starttid -starttidspunkt for varigheds målinger. Disse er de samme muligheder for at beslutte aktiveringstiden for isochronal Maps (diskuteret nedenfor) og kaldes: Start (d2F/dt2Max), upstroke (DF/dtMax), depolariserings midtpunkt (tid på 50% amplitude), Peak (tidspunkt for maksimal amplitude). Disse definitioner, der anvendes på handlings potentialerne for mus og marsvin, er vist i figur 2a.
      Bemærk: Hvis du ændrer nogen af disse indstillinger, opdateres varigheds oversigten og resultattabellen automatisk. Kort skalering og outlier fjernelse muligheder er også tilgængelige.
  3. Lednings hastigheden måles også automatisk inden for den primære software grænseflade. Dette opnås ved hjælp af multi vektor metoden i Bayly et al26 fra det isochronale kort, der er defineret af den valgte aktiveringsforanstaltning (omtalt i trin 5,4). Tryk på aktiverings punkter for at gengive en 3D-repræsentation af aktiverings kortet.
  4. Den multi-vektor lednings hastighed måling metode rumligt segmenter isochronal kort i regioner af n x n pixels. Indstil værdien af n ved hjælp af den lokale vinduesstørrelse input, og Indstil intervallet af aktiverings tider for at anvende analyse til at bruge tilpasningen aktiverings tider indgange.
    Bemærk: for hver lokal region, en polynomium overflade, f, er monteret, der bedst beskriver forholdet mellem Aktiveringstid og rumlig position, (x,y). Gradient vektor, CVlokale, af denne overflade beregnes derefter som:
    Equation 11
    hvor Equation 9 betegner den todimensionale kartesiske rumlige differentialoperatør26.
  5. For hver pixel i isochronal map beregnes en lokal vektor, der repræsenterer hastighed og retningen af ledning. Vælg Isochronal map med vektorer i rullemenuen Vis for at se denne analyse.
  6. SNR beregnes som forholdet mellem den maksimale amplitude sammenlignet med standardafvigelsen for signalet ved baseline. Denne analyse udføres efter alle behandlingstrin. Tryk på SNR-beregning i den øverste menu for at redigere indstillingerne for den periode af signalet, der er defineret som oprindelig plan.

6. lednings analysemodul

  1. Tryk ledning for at få adgang til mere detaljeret analyse af lednings hastigheden. Dette åbner et separat modul, hvor ledning kan kvantificeres ved hjælp af Bayly multi-vektor metode som i hovedgrænsefladen, enkelt vektor metoder, og som en aktiverings kurve.
  2. Tryk på en enkelt vektor for at analysere ledning ved hjælp af den enkelte vektor metode, hvor CV beregnes ud fra forsinkelsen i aktiveringstiden mellem to punkter. Dette kan gøres ved hjælp af automatiske eller manuelle metoder, vælges under den enkelte vektor knap.
    1. For automatisk enkelt vektor metode skal du vælge en distance og et startpunkt, hvorfra der skal måles ledning. Softwaren vil derefter udføre en 360-graders Sweep fra det valgte punkt, måling af tidsforsinkelsen og beregning af den tilhørende lednings hastighed langs alle retninger i 1-graders intervaller. Resultaterne af denne analyse vises i grafen ved siden af kortet, og retningen af den langsomste ledning vises med rødt.
    2. For manuel enkelt vektor metode skal du vælge både et start-og slutpunkt fra isochronal-kortet for at beregne lednings hastigheden. Tryk på Ryd startpunktfor at vælge et nyt startpunkt.
  3. Tryk på lokal vektor for at anvende multi vektor metoden, hvor indstillingerne svarer til dem fra hovedgrænsefladen. Inden for lednings modulet kan fordelingen af lednings hastigheder samt vinkel fordelingen af beregnede vektorer og den kantede afhængighed af lednings hastigheden vises.
  4. Tryk på aktiverings kurven for at afbilde den procentdel af vævet, der er aktiveret som en funktion af tiden. Tid til 100% aktivering vises automatisk, mens brugerdefinerede værdier for minimum (blå) og maksimum (rød) aktiverings procenter, der skal måles, kan også vælges.

7. yderligere analyser og moduler

  1. Bortset fra automatisk udførte varighed og lednings hastighed analyser, flere andre parametre kan kvantificeres ved hjælp af Elektromap. Disse analyser er valgbare fra rullemenuen over display kortet. Vælg en af disse muligheder for at udføre analysen, og resultaterne vises i den 4. række i resultattabellen: 1) diastolisk interval – tid fra 90% repolarisering til aktiveringstidspunkt for det næste aktionspotentiale; 2) dominerende frekvens -frekvensspektrum af hver pixel beregnes ved hjælp af fast Fourier transformation, og frekvensen med den mest magt er defineret som den dominerende frekvens. Avancerede indstillinger for rækkevidde og vindue til dominerende frekvens analyse er tilgængelige ved at vælge frekvens tilknytning. 3) tid til peak -stigningen tid mellem to brugervalgte procenter (standard 10 til 90%) af den depolariserings fase af aktionspotentialet eller frigivelsen af calcium. Procentværdier kan ændres ved at vælge TTP-indstillinger. og 4) afslapning konstant (τ)-afslapning konstant beregnes ved at montere en mono-eksponentiel forfald af formen af formen:
    Equation 22
    Hvis fluorescens niveauet på tidspunktet t afhænger af den maksimale fluorescens, F0, og det efterfølgende forfald (C er en konstant)27. Værdien mellem at passe ligning 2 er valgbar inden for de vigtigste elektromagnetisk brugergrænseflader, samt en godhed af pasform udelukkelseskriterier baseret på r2 værdi.
  2. Tryk på Enkeltfilanalyse for at åbne et dedikeret modul til varighed af høj gennemløb og lednings analyse af hvert identificeret segment i en fil. Analysen kan udføres på enten hele billedet (varighed, lednings-og aktiveringstidspunkt) eller på udvalgte områder eller interessepunkter (kun i øjeblikket varighed). Resultaterne er forbruges til en. csv-fil.
    Bemærk: for APD-værdier fra hele billedet er den første kolonne i. csv-filen middelværdien, mens den anden kolonne er standardafvigelsen.
  3. Tryk på alternans for at starte et selvstændigt modul til dedikeret analyse og kortlægning af Beat-to-beat variabilitet. Se O'Shea et al. 201913 for detaljer om alternans forarbejdning og analyse muligheder. Specifikt, dette modul er designet til at identificere to perioden svingninger, kendt som alternans. Både varighed og amplitude alternans beregnes og outputted.
    Bemærk: varighed alternans måles ved at sammenligne varigheds målingen fra en top til den næste; Hvis henholdsvis peak en og to og APD1 og APD2 , så varigheden ALTERNAN (δapd) beregnes som
    Equation 33
    Varigheds målingen udføres ved hjælp af indstillingerne i hovedgrænsefladen. I mellemtiden kan amplitude alternans kvantificeres og kortlægges på tværs af multi cellulære præparater som absolut ændring (defineret som en procentdel, hvor 0% = samme amplitude mellem et beat og det næste). Desuden kan virkningerne af fænomener som calcium belastning yderligere undersøges ved at måle og sammenligne belastning og frigive alternans, som det tidligere er rapporteret28. Hvis L er defineret som peak amplitude af de store beats (dvs. hvor amplituden er større end den foregående Beat), S amplituden af de små beatsEquation 4, ogD den diastoliske belastning af de små beats, frigivelsen alternans ( Equation 5 ) defineres som:
    Equation 64
    Omvendt er last alternans (Equation 7) defineret som:
    Equation 85
    Alternans målinger kan foretages på tværs af hele vævet, og resultaterne af analysen vises i nederste højre af modulet. Når du først bruger modulet, udføres analysen på tværs af hele eksperimentel filen, og de viste resultater er en gennemsnitlig Beat-Beat-forskel på tværs af hele filen. Analysen kan dog begrænses til bestemte tidspunkter i filen ved at vælge hold zoom, zoome ind på et bestemt tidsrum og vælge Analysér zoomet afsnit. Dette opdaterer resultatpanelet, så det viser analysen fra den valgte tidsperiode.
    1. Vælg Afspil for at vise en Beat-to-beat-video af alternans-analysen. Derudover skal du vælge Opret gennemsnitlig kort for at eksportere et kort over alternans adfærd i gennemsnit fra valg af tidspunkter, som er indstillet i pop-up-menuen, når du bruger denne funktion.
  4. Tryk på fase kort for at starte fase tilknytnings modulet. En Hilbert transformation udføres for at beregne den øjeblikkelige fase (mellem-π og + π) af signalerne på hvert tidspunkt. Tryk på Afspil eller træk skyderen for at visualisere fase adfærden over tid, og klik på en pixel for at gengive et fase diagram.

8. eksport af data

  1. Data eksporteres fra Elektromap i forskellige former. Tryk på Eksportér værdier for at gemme værdierne for det aktuelt viste kort i den primære anvendte grænseflade. Målte værdier kan gemmes som enten et kort (bevarer pixel placeringer) eller komprimeres til en enkelt liste og kan gemmes som. csv,. txt eller. MAT filer.
  2. Tryk på Eksporter kort for at få vist et pop op-billede med det aktuelt viste kort, som derefter kan gemmes i forskellige billedformater. Visningsindstillinger for kortet styres ved at vælge Kortindstillinger , men kan også redigeres, når Eksporter kort er blevet valgt. For eksempel kan en farvebjælke tilføjes ved at vælge dette ikon fra den øverste menu, og skalaen kan indstilles ved at vælge rediger ≫ colormap.
  3. Tryk på aktiverings video for at gengive en animation af aktiverings sekvensen, som kan gemmes som en animeret. gif-fil.
  4. Tryk på segment video for at gemme en. avi-videofil af den aktuelt viste parameter for hvert identificeret segment.

Representative Results

Alt arbejde, der blev udført som led i denne undersøgelse, blev udført i overensstemmelse med etiske retningslinjer, som blev fastlagt af loven af britiske dyr (videnskabelige procedurer) 1986 og Europa-Parlamentets direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål. Eksperimenter blev godkendt af hjemmekontoret (mus: PPL 30/2967 og PFDAAF77F, Guinea Pig: PPL PF75E5F7F) og de institutionelle Review boards på University of Birmingham (Mouse) og King's College London (marsvin). Detaljerede metoder til indsamling af de rå data, der er blevet analyseret her, kan findes i vores tidligere publikationer5,6,14,19.

Den vigtigste grænseflade, som Elektromap styres fra, er vist i figur 1a. De nødvendige trin til at analysere et datasæt styres primært af de belastnings billeder, proces billederog producere kort knapper, og de vises fremhævet med henholdsvis grøn, blå og rød i figur 1a. Figur 1b-D viser de handlinger, der udføres ved valg af hver af disse knapper. Indlæs billeder anvender billed tærskel indstillingerne som valgt af brugeren (figur 1b), mens proces billeder (figur 1c) anvender filtrering og baseline korrektion. Endelig, producere kort vil første gennemsnitlige data i henhold til tidsvinduet og segmentering indstillinger (medmindre single Beat segmentering er valgt) og derefter udføre analyser beskrevet ovenfor.

Et af de vigtigste aspekter ved Elektromap er fleksibiliteten med hensyn til kameratype og eksperimentel model. Dette er afgørende for nytten af en optisk kortlægning software på grund af den særskilte hjerte EP og anatomiske egenskaber, der findes mellem udbredte modeller. Figur 2a viser for eksempel den action potentielle morfologi af murine Atria sammenlignet med marsvin ventrikel, indspillet ved hjælp af spændings følsomme farvestoffer som tidligere rapporteret6,14. På trods af den særskilte form af aktionen potentiale, og brugen af to separate optiske kortlægning kameraer med forskellige billedhastigheder og pixelstørrelser, elektromagnetisk kan udnyttes til succes analysere begge datasæt. Dette kræver dog en ændring af nogle af parametrene i brugergrænsefladen (figur 2b). Bemærk, at det forlængede marsvine aktionspotentiale nødvendiggør et større tidsvindue. For at forhindre, at den oprindelige korrektion af Tophat ufysiologisk modificerer de optisk optagede signaler, skal dens tidslængde desuden forøges, så den er større end tidsforløbet for aktionspotentialet.

ElectroMap tilbyder et væld af behandlingsmuligheder for at hjælpe med at forbedre SNR af optisk indspillede signaler, som kan være nødvendige for effektivt at inddrive EP parametre. Et eksempel er automatiseret ensemble gennemsnit af toppe efter data segmentering. Figur 3a-C viser, hvordan anvendelsen af ensemble gennemsnit, i stedet for andre metoder, kan forbedre SNR fra isolerede murine venstre Atria (n = 13). Dette reducerer målingens heterogenitet og sandsynligheden for analyse svigt (figur 3D). F. eks. ændrede en ændring af pacingfrekvensen fra 3 Hz til 10 Hz ikke APD50, når der ikke foretages nogen ensemble-gennemsnit, men et forventet29 fald i APD50 ved 10 Hz-pacing blev observeret, når målt fra ensemble-gennemsnit data ( Figur 3E).

Figur 4 viser effekten og nytten af automatiseret pacing frekvens detektering og segmentering tilbydes af Elektromap. Her, mus venstre Atria (n = 5) var tempo på en 120 MS cyklus længde og cyklus længde blev trinvis forkortet af 10 MS, indtil det nåede 50 MS. Elektromap automatisk identificeret pacing cyklus længde og grupperet væv gennemsnitlige toppe i overensstemmelse hermed (figur 4a ). Dette blev opnået med høj nøjagtighed i alle datasæt (figur 4b). Automatiseret segmentering af data tilladt ligetil og høj gennemløb analyse af opbremsning af lednings hastighed med øget pacing frekvens/forkortet cyklus længde (figur 4c, D). Samtidig, APD50 (figur 4e) og diastolisk interval (figur 4F) forkortet. Amplitude af de optisk målte toppe faldt, mens tid til peak steg (figur 4g, H). Disse er igen de forventede tilbagelevering svar i hjernevæv29,30 og brug af elektromagnetisk kan hjælpe derfor belyse ændringer i respons på pacing hyppighed i tilstedeværelse af farmakologiske agenser, genetisk modifikation, eller sygdomstilstande.

En vigtig overvejelse i brugen af en software som Elektromap er tilstedeværelsen af artefakter i de underliggende data. Figur 5, for eksempel viser, at motion artefakter (forvrængning af optisk indspillet signal ved vævs bevægelse) kan udelukke nøjagtige målinger af aktivering og især repolarisering inden elektromagnetisk. Se diskussionen for yderligere overvejelser.

Figure 1
Figur 1: Elektromap vigtigste forarbejdningstrin. (A) grafisk brugergrænseflade af Elektromap, med belastningen billeder (grøn), proces billeder (blå), og producere kort (rød) knapper fremhævet. (B) indstillinger for billed tærskel, der kan anvendes ved valg af Indlæs billeder. (C) indstillinger for signal behandling, der er tilgængelige for brugeren, omfatter rumlig og tidsmæssig filtrering og grundlinje korrektion og kan anvendes på billed stakken ved at trykke på proces billeder. (D) ensemble gennemsnit og parameter kvantificering (vist APD måling), der aktiveres ved at vælge producere kort. Figur tilpasset fra O'Shea et al., 201913. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: analyse af data fra mus og marsvin ved hjælp af Elektromap. A) optisk registreret aktionspotentiale fra mus Atria og marsvine ventrikler sammen med både den første (DF/DT) og anden (d2f/dt2) afledte af disse signaler. De forskellige definitioner for aktiverings-og repolariserings tider, der kan beskæftises inden for Elektromap, fremhæves. (B) screenshots af billed-og signalbehandling indstillinger udnyttet i electromaps interface. Røde bokse fremhæve indstillinger, der kræves modifikation mellem analyser af mus og marsvin data. Figur tilpasset fra O'Shea et al., 201913. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ensemble gennemsnit for at løse APD ændringer. (A) apd50 kort og eksempel enkelt pixel signal fra single Beat optiske action potentialer. (B) apd50 kort og eksempel enkelt pixel signal fra optiske aktionspotentialer genereret af ensemble gennemsnit af 10 efterfølgende beats (peak metode). (C) SNR af Single Beat sammenlignet med 10 Beat gennemsnit signaler. D) apd50 heterogenitet (i) og antal måle svigt (II) som funktion af SNR for single beat og 10 Beat gennemsnitligt APD50 kort. (E) apd50 ved 3 og 10 Hz pacing frekvens, målt fra single beat og 10 Beat kort. (Data vist som middel ± standardfejl, n = 13 venstre Atria, * * * *p < 0,001 efter elevens parrede t-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: brug af Elektromap til at studere pacing frekvensrespons i hjertevæv. (A) eksempel Elektromap skærmbillede af pacing frekvens genkendelse og segmentering. (B) sammenligning af kendte og Elektromap målte pacing cyklus længder. (C) aktiverings kort på 120 ms og 60 MS pacing cyklus længder. (D-H) Grupperet data for lednings hastighed (D), apd50 (E), diastolisk interval (F), amplitude (G) og tid til Peak (H) som en funktion af pacing cyklus længde faldende fra 120 MS til 60 MS i 10 MS intervaller. (Data vist som middel ± standardfejl, n = 5 venstre Atria) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: effekt af motion artefakter. (A) apd50 kort. (B) aktiverings kort. (C) eksempel signaler fra lokaliteter markeret (krydser) på APD og aktiverings kort. I området af vævet markeret med Røde Kors, er sammentrækning ikke blevet med held koblet, forvrænge det målte optiske signal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her præsenterer vi en trin-for-trin guide til udnyttelse af open source software ElectroMap for fleksibel og multi variabel analyse af kardielle optiske kortlægning datasæt. For at opnå en vellykket brug af Elektromap kræves der billeddata for at være i. tif eller. MAT formater. ElectroMap indeholder flere modificerbare brugerindstillinger. Som påvist i figur 2aer dette nødvendigt på grund af den brede heterogenitet, der findes mellem eksperimentelle modeller og Billedbehandlingsudstyr. Det betyder dog, at standardindstillingerne i softwaren ikke altid vil være optimale, så et kritisk skridt i at bruge softwaren er for brugeren at tune indstillinger for deres særlige eksperimentelle setup. Disse omfatter kameraindstillinger og tidshorisonter, som vist i figur 2b. Når der er fundet optimale indstillinger, kan disse gemmes og genindlæses på et senere tidspunkt ved at vælge konfigurationsfilen.

Indarbejdelse af automatiseret CL-måling og signal segmentering er vigtige fordele ved softwaren. Disse funktioner gør det muligt at analysere akutte reaktioner i eksperimentelle optagelser og udvide analysen fra at fokusere på isolerede enkelt slag. Når den ønskede segmentering er opnået, giver single filanalyse modulet mulighed for automatiseret analyse af hvert enkelt segment (herunder enkelte beats), der realiserer en analyse af flere variabler med høj gennemløb på tværs af optagelsen i en enkelt. csv-fil. I sammenhæng er Ensemble gennemsnit af grupperede toppe en effektiv metode til at forbedre kvaliteten af støjende signaler, der automatisk udføres i Elektromap. Men, ensemble gennemsnit er ikke allestedsnærværende gavnlig, for eksempel i undersøgelser af Beat-to-beat variabilitet. Derfor, Elektromap integrerer single Beat segmentering for at undgå ensemble gennemsnit, alternative behandlingsmuligheder for at forbedre SNR (rumlig og tidsmæssig filtrering) og omfatter alternans analysemodul til yderligere at undersøge og kort variation i beat-to-beat.

Optisk kortlægning datasæt udviser ofte artefakter såsom baseline drift og motion artefakter. Ligeledes kan de genererede signaler være af lav kvalitet på grund af små pixelstørrelser, korte eksponeringstider og lav fraktioneret fluorescerende ændringer2. Disse faktorer forhindrer en effektiv og præcis analyse af den underliggende EP-adfærd. Som skitseret, Elektromap har flere forarbejdnings strategier til at overvinde disse spørgsmål. Anvendelsen af disse algoritmer på grundlæggende dårlig kvalitet/forvrænget data vil dog stadig forhindre en effektiv analyse. SNR er derfor en af de parametre, der måles og vises i Elektromap. På samme måde kan brugeren vælge og sammenligne signalerne fra specifikke regioner fra eksemplet ved hjælp af pixel info og sammenligne moduler, hvilket gør det muligt at identificere fænomener som bevægelses artefakter vist i figur 5og passende udelukkelse af data.

På nuværende tidspunkt understøtter Elektromap ikke fjernelse af bevægelses artefakter fra rå data på samme måde som oprindelig korrektion. Derfor, en mulig fremtidig udvikling af softwaren er inddragelse af motion artefakt fjernelse af beregningsmæssige metoder som er blevet rapporteret31,32. Desuden er Elektromap i øjeblikket begrænset til at studere et optisk signal. Men for ratiometriske farvestoffer og samtidig brug af spænding og calcium farvestoffer27, er samtidig behandling af to bølgelængde kanaler påkrævet. Integrationen af Dual signal analyse er derfor en vigtig fremtidig tilføjelse til softwaren. Udvidelse af analysemuligheder, der gælder for arytmiske datasæt, såsom fase singularitet tracking, ville ligeledes udvide omfanget af softwaren33,34. Endelig kan flere af de beskrevne analysemuligheder også være nyttige i analysen af elektrode kortlægnings data. Faktisk, elektromap er blevet brugt til at analysere elektrode kortlægning data på trods af kontrasterende elektro gram bølgeform20,35, og yderligere optimering vil udvide sin brug for denne modalitet.

Disclosures

P.K. modtager forskningsstøtte fra flere medicinal-og enheds virksomheder, som er aktive inden for atrieflimren, og har modtaget honorarer fra flere af disse virksomheder. L.F. har modtaget institutionel forskningsstøtte EU, BHF, MRC, DFG og Gilead. P.K. og L.F. er opført som opfindere på to patenter, der indehaves af University of Birmingham (atrieflimren terapi WO 2015140571, markører for atrieflimren WO 2016012783).

Alle andre forfattere erklærer ikke nogen potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af EPSRC Studentship (sci-PHY-4-sundhedscenter for ph. d.-uddannelse L016346) til D.P., K.R. og L.F., Wellcome Trust Seedbonus Grant (109604/Z/15/Z) til D.P., British Heart Foundation Grants (PG/17/55/33087, RG/17/15/33106) til D.P. , Den Europæiske Union (tilskudsaftale nr. 633196 [CATCH ME] til P.K. og L.F.), British Heart Foundation (FS/13/43/30324 til P.K. og L.F.; PG/17/30/32961 til P.K. og A.H.) og Leducq Foundation til P.K.. J.W. understøttes af British Heart Foundation (FS/16/35/31952).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MATLAB and Simulink R2018a Mathworks, Inc, Natick, MA MATLAB software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 94, 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110, 609-623 (2012).
  3. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE Reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
  4. Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. Local β-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia. Circulation Research. 110, 1454-1464 (2012).
  5. Syeda, F., et al. PITX2 Modulates Atrial Membrane Potential and the Antiarrhythmic Effects of Sodium-Channel Blockers. Journal of the American College of Cardiology. 68, 1881-1894 (2016).
  6. Winter, J., et al. Sympathetic nervous regulation of cardiac alternans in the intact heart. Frontiers in Physiology. 9, 1-12 (2018).
  7. Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7, 313-320 (2014).
  8. Sato, P. Y., et al. Loss of Plakophilin-2 Expression Leads to Decreased Sodium Current and Slower Conduction Velocity in Cultured Cardiac Myocytes. Circulation Research. 105, 523-526 (2009).
  9. Yu, T. Y., et al. Optical mapping design for murine atrial electrophysiology. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering: Imaging & Visualization. 5, 368-378 (2017).
  10. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 303, H753-H765 (2012).
  11. Crocini, C., Ferrantini, C., Pavone, F. S., Sacconi, L. Optogenetics gets to the heart: A guiding light beyond defibrillation. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 132-139 (2017).
  12. Entcheva, E., Bub, G. All-optical control of cardiac excitation: Combined high-resolution optogenetic actuation and optical mapping. The Journal of Physiology. 9, 2503-2510 (2016).
  13. O’Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  14. Yu, T. Y., et al. An automated system using spatial oversampling for optical mapping in murine atria. Development and validation with monophasic and transmembrane action potentials. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 340-348 (2014).
  15. Jaimes, R., et al. Functional response of the isolated, perfused normoxic heart to pyruvate dehydrogenase activation by dichloroacetate and pyruvate. Pflugers Archiv. 468, 131-142 (2016).
  16. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308, H1112-H1125 (2015).
  17. Parrish, D. C., et al. Transient denervation of viable myocardium after myocardial infarction does not alter arrhythmia susceptibility. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory. , (2017).
  18. Ihara, K., et al. Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping. Journal of Visualized Experiments. (132), e56478 (2018).
  19. Holmes, A. P., et al. A Regional Reduction in Ito and IKACh in the Murine Posterior Left Atrial Myocardium Is Associated with Action Potential Prolongation and Increased Ectopic Activity. Plos One. 11, e0154077 (2016).
  20. Lang, D., et al. Arrhythmogenic remodeling of β2 versus β1 adrenergic signaling in the human failing heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8, 409-419 (2015).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Wen, Q., et al. Transverse cardiac slicing and optical imaging for analysis of transmural gradients in membrane potential and Ca2+ transients in murine heart. The Journal of Physiology. 596, 3951-3965 (2018).
  23. Houston, C., et al. Characterisation of re-entrant circuit (or rotational activity) in vitro using the HL1-6 myocyte cell line. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 119, 155-164 (2018).
  24. Yu, T. Y., et al. Optical mapping design for murine atrial electrophysiology. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering: Imaging and Visualization. 5, 368-376 (2017).
  25. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 303, H753-H765 (2012).
  26. Bayly, P. V., et al. Estimation of Conduction Velocity Vector Fields from Epicardial Mapping Data. IEEE Transactions on Bio-Medical Engineering. 45, 563-571 (1998).
  27. Jaimes, R., et al. A technical review of optical mapping of intracellular calcium within myocardial tissue. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 310, H1388-H1401 (2016).
  28. Wang, L., et al. Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: Ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation. Circulation Research. 114, 1410-1421 (2014).
  29. Winter, J., Shattock, M. J. Geometrical considerations in cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis. Europace. , (2016).
  30. Mironov, S., Jalife, J., Tolkacheva, E. G. Role of conduction velocity restitution and short-term memory in the development of action potential duration alternans in isolated rabbit hearts. Circulation. 118, 17-25 (2008).
  31. Khwaounjoo, P., et al. Image-Based Motion Correction for Optical Mapping of Cardiac Electrical Activity. Annals of Biomedical Engineering. 43, 1235-1246 (2014).
  32. Christoph, J., Luther, S. Marker-Free Tracking for Motion Artifact Compensation and Deformation Measurements in Optical Mapping Videos of Contracting Hearts. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
  33. Umapathy, K., et al. Phase Mapping of Cardiac Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 3, 105-114 (2010).
  34. Tomii, N., et al. Detection Algorithm of Phase Singularity Using Phase Variance Analysis for Epicardial Optical Mapping Data. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63, 1795-1803 (2016).
  35. Cantwell, C. D., et al. Techniques for automated local activation time annotation and conduction velocity estimation in cardiac mapping. Computers in Biology and Medicine. 65, (2015).

Tags

Medicin optisk kortlægning software Elektrofysiologi arytmi fluorescerende sensorer aktionspotentiale calcium
Høj gennemløbs analyse af optiske kortlægnings data ved hjælp af Elektromap
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O’Shea, C., Holmes, A. P., Yu, … More

O’Shea, C., Holmes, A. P., Yu, T. Y., Winter, J., Wells, S. P., Parker, B. A., Fobian, D., Johnson, D. M., Correia, J., Kirchhof, P., Fabritz, L., Rajpoot, K., Pavlovic, D. High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap. J. Vis. Exp. (148), e59663, doi:10.3791/59663 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter