Summary
Denne protokollen beskriver oppsett og bruk av ElectroMap, en MATLAB-basert åpen kildekode programvareplattform for analyse av CARDIAC optiske kartlegging data. ElectroMap gir en allsidig høy-produksjon verktøyet for analyse av optisk kartlegger Voltage og kalsium datasett vannrett en rikt utvalg av CARDIAC eksperimentelle modeller.
Abstract
Optisk kartlegging er en etablert teknikk for høy spatio-Temporal oppløsning studie av CARDIAC elektrofysiologi i multi-cellulære preparater. Her presenterer vi, i en steg-for-steg guide, bruk av ElectroMap for analyse, kvantifisering, og kartlegging av høyoppløselig spenning og kalsium datasett ervervet ved optisk kartlegging. ElectroMap analyse alternativer dekker en rekke viktige elektrofysiologisk parametre, og det grafiske brukergrensesnittet tillater enkel modifisering av forhånds prosessering og parameterdefinisjoner, noe som gjør ElectroMap gjeldende for et bredt spekter av eksperimentelle modeller. Vi viser hvordan innebygd frekvens deteksjon og signal segmentering gir høy gjennomstrømming, analyse av hele eksperimentelle innspillinger, akutte svar og enkelt Beat-to-beat-variasjoner. I tillegg inkorporerer ElectroMap automatiserte multi-beat gjennomsnitt for å forbedre signalkvaliteten på støyende datasett, og her viser vi hvordan denne funksjonen kan hjelpe belyse elektrofysiologisk endringer som ellers ville gå ubemerket når du bruker enkelt Beat analyse. Egendefinerte moduler er inkludert i programvaren for detaljert undersøkelse av ledning, enkelt filanalyse, og alternans, som vist her. Denne programvareplattformen kan brukes til å aktivere og akselerere behandling, analyse og kartlegging av komplekse CARDIAC elektrofysiologi.
Introduction
Optisk kartlegging utnytter fluorescerende journalister av spenning og/eller kalsium konsentrasjon å forhøre CARDIAC elektrofysiologi (EP) og kalsium håndtering i flercellede preparater, med større romlig oppløsning enn oppnåelig med tradisjonelle teknikker1,2,3. Derfor har optisk kartlegging dukket opp som en viktig og stadig mer benyttet teknikk, gir viktig innsikt i fysiologiske og patofysiologiske elektrisk atferd i hjertet3,4,5 ,6,7,8. Effektiv prosessering og analyse av data innhentet fra optiske kartlegging eksperimenter er komplisert av flere faktorer. Den høye spatiotemporal oppløsning natur optisk kartlegging datasett resulterer i rå videofiler sammensatt av tusenvis av bilderammer, som hver består av en rekke individuelle piksler, noe som gir opphav til store datafiler som nødvendig høy gjennomstrømming og automatisert behandling9. Små piksel størrelser, dårlig og ujevn fargestoff lasting og små brøk endringer i fluorescens resulterer i optiske signaler med lavt signal til støyforhold (SNR), som krever pre-prosessering før effektiv analyse er oppnåelig10. Prosessering og analyse kan bli ytterligere komplisert ved bruk av optogenetic pacing protokoller som utnytter lys til å starte aktivering, potensielt forvrenger innspilt signal fra fluorescerende sensorer11,12. Videre, når data er behandlet, flere ikke-konsekvente teknikker og definisjoner kan brukes til å måle parametre av interesse, med de mest aktuelle teknikkene varierer avhengig av eksperimentell oppsett, modell og spørsmål2, 10,13. Disse begrensningene hindrer ytterligere opptak av teknologien og hindrer virkelig objektiv analyse.
For å overkomme disse begrensningene har flere forskningsgrupper utviklet egendefinerte prosesserings rørledninger som er skreddersydd mot deres eksperimentelle modell, spørsmål og hardware7,14,15,16. Andre utnytter kommersiell proprietær programvare der de underliggende algoritmene kan være vanskelig å få tilgang til4,17. Som et resultat, er det et klart behov for en fritt tilgjengelig åpen kildekode programvareplattform for prosessering og analyse av optiske kartlegging data. Det er viktig at denne programvaren er åpen kildekode, enkel å bruke, fleksibel til parameter justering, som gjelder for en rekke eksperimentelle modeller med distinkte EP egenskaper og avgjørende gir enkel og tunable kvantifisering av spekteret av CARDIAC parametere som kan bli studert ved hjelp av optisk kartlegging.
Vi har nylig publisert og gitt ut en omfattende programvareplattform, ElectroMap, for høy-hele, semi-automatisert prosessering, analyse og kartlegging av CARDIAC optisk kartlegging datasett13. Her presenterer vi en video manual for utnyttelse av ElectroMap og demonstrere hvordan den kan brukes til å behandle, analysere og kartlegge flere optiske kartlegging datasett. Vi fokuserer på bruk av ElectroMap å kvantifisere standard EP og kalsium håndtering variabler og demonstrere bruk av frittstående Lednings hastighet, enkelt filanalyse og alternans moduler.
Protocol
1. optisk kartlegging datainnsamling
- Utføre hjerte optisk kartlegging ved hjelp av en rekke eksperimentelle modeller, inkludert intakt og isolert hele hjerter6,18, isolert Atria14,19, ventrikkel kiler20, CARDIAC skiver 21 priser og , 22, og Cellular monolagere23. Se tilknyttede referanser for eksperimentelle design for å samle inn rå optisk kartlegging data fra disse forberedelsene. Forutsatt at data innhentet kan konverteres til en TIFF stabel eller lagret i en. MAT-fil, bør den være analyzable ved hjelp av ElectroMap. Dette inkluderer data av varierende dimensjoner (firkantet/rektangulær) og oppløsninger (maksimalt testet for øyeblikket 2048 piksler x 2048 piksler).
2. programvareinstallasjon og oppstart
Merk: nedenfor er detaljert de to metodene for å installere og kjøre ElectroMap-enten innenfor MATLAB kjøre fra kilden (. m) kode eller som en frittstående kjørbar fil (. exe for Windows). Det final programvare og dens funksjonaliteten er invariant imellom det to setup valgmulighetene (annet enn et par forskjellene inne adresseliste styringen). Derfor er de viktigste hensyn for å velge versjon å installere er tilgang til MATLAB og nødvendige verktøykasser og om tilgang til kildekoden er ønsket. Der det er mulig, anbefales det å bruke MATLAB-versjonen for raskere oppstart ganger, kortere behandlingstid, og enklere feilrapportering.
-
Oppsett 1: kjører electromap i MATLAB
- Installere MATLAB. ElectroMap ble designet i MATLAB 2017a, har imidlertid programvare blitt testet for bruk i alle påfølgende utgivelser av MATLAB (opp til 2018b i skrivende stund). Følgende verktøykasser kreves: bildebehandling, signal behandling, statistikk og maskinlæring og kurve montering.
- Last ned/Klon alle filer fra den siste "kildekoden" utgivelsen av ElectroMap fra GitHub depotet (https://GitHub.com/CXO531/ElectroMap). Unzip det dataoverførte innholdet å en ønsket plasseringen.
- Åpne MATLAB og naviger til mappeplasseringen vert for ElectroMap kildekoden. Deretter åpner filen ElectroMap. m og trykk Kjør i editoren, eller alternativt skrive ElectroMap i kommandovinduet og trykk Return. Dette vil starte ElectroMap brukergrensesnitt, figur 1a.
-
Oppsett 2: standalone. exe-fil
- Last ned installasjonsfilen: https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI.
- Følg instruksjonene i installasjonsprogrammet, som vil laste ned nødvendig MATLAB Runtime fra nettet sammen med ElectroMap programvare.
- Kjør ElectroMap. exe.
Merk: Start opp tid for den frittstående versjonen kan være flere minutter.
3. bilde lasting og pre-prosessering
- Trykk på Velg mappe og naviger til plasseringen av datafilen (e) som skal analyseres. Denne ville fylle det igjen-hånd liste med alle fil-størrelse innen det adresseliste det er av det korrekt arkiv type (. tif eller. MAT). . MAT-filer må bare inneholde variabelen for bildes takken.
Merk: bare mapper og ikke individuelle filer vises når du navigerer gjennom katalog velgeren. - Velg filen som skal lastes inn fra grensesnittet, og trykk på Last inn bilder.
- Når den er lastet inn, vises den første rammen, og den røde disposisjonen vil indikere automatisk terskelverdi av bildet. Hvis nødvendig, laster du tidligere brukte ROIs på nytt ved å velge Lagre/Last inn ROI. I dette tilfellet hopper du over trinn 3,3.
- Som standard er terskelverdi basert på piksel intensiteten i det første bildet. Hvis ønskelig, endre dette til en terskel basert på signalet tid kurset amplitude ved å endre alternativet i bildet for terskel rullegardinmenyen. Vær oppmerksom på at når terskelverdi er valgt, er det da søkt på hele bildet stabelen.
- Om ønskelig kan du endre terskel alternativet til manuell, som vil aktivere glidebryteren for å justere bilde terskelen manuelt. I tillegg beskjære bilder (beskjære bilde) og/eller tegne et egendefinert område av interesse (Egendefinert ROI) for analyse ved å velge den aktuelle kryss boksen (e) under terskel alternativer. Note det avansert valgmulighetene for område av begrave utvalg som antallet av arealer er anvendelig fra ROI utvalg fra overdelen meny.
- Når du har brukt en passende terskel, trykker du Prosessbilder for å bruke behandlingen. Innstillinger for behandling er beskrevet nedenfor (trinn 3.4.1-3.4.5). Nå må du kontrollere at du har angitt riktige kamerainnstillinger. Dette er pikselstørrelse i ΜM (viktig: Dette er bilde pikselstørrelsen, og ikke størrelsen på pikslene som utgjør brikken eller tilsvarende maskinvare i bildeenheten) og bildefrekvens i kHz.
- For signal inversjon merker du av for Inverter data for å aktivere. Hvis rapportert fluorescerende signal er omvendt proporsjonal med parameter av interesse (som med vanlig brukte potensiometrisk fargestoffer) signalet kan bli invertert.
- For romlig filtrering velger du Gaussian eller Average fra kjerne menyen. Størrelsen på romlig gjennomsnitt området styres av størrelsen input tilstøtende til kernel dropdown menyen (dvs. 3 resultater i 3 pixel x 3 pixel filter kernel). Når du bruker et Gaussian-filter, kan standardavviket også angis fra Sigma -inndata.
- For Baseline korreksjon, Velg Top-hat24 eller polynom (4th eller 11th grad) korreksjon25 fra Baseline -menyen. Korreksjon kan brukes på hver piksel individuelt (lang behandlingstid) eller som et gjennomsnitt av hele bildet (raskere, men forutsetter homogene grunn endringer). Topp-hat korreksjon kan også endres ved å sette Top-hat lengde i millisekunder, ved siden av den planlagte valg dropdown menyen. Lengden på Top-hat-kjernen bør være større enn tidsskalaen til den enkelte handling potensialer/kalsium transienter.
- For midlertidig filtrering velger du filtrering av Savitzky-Goaly eller uendelig impuls (IIR) fra filtrerings menyen.
Merk: annet enn for vevet gjennomsnittlig signal som vises i nedre venstre, Temporal filtrering brukes på hver piksel individuelt på tidspunktet for parameter kvantifisering fra ensemble gjennomsnitt bildeområder. Dette er implementert for å redusere behandlingstiden ved å filtrere små deler av data når det kreves i stedet for hele filer. - For fjerning av bilder, Legg merke til at hvis alternativet Fjern rammer er valgt, kan store topper med amplitude større enn signalet av interesse fjernes fra bilde settet. Denne kanskje være nyttig inne optisk tempoet datasett som optogenetic pacing der hvor depolarization er innviet av optisk aktivisering av opsins som channelrhodopsin 211,12.
Merk: som ramme fjerning vil potensielt innføre unfysiologisk trinn endringer i bildesignaler, kan Temporal filtrering innføre artefakter til data og så er ikke anbefalt her.
- Merk at signalet vil bli segmentert når prosessen bilder er valgt i henhold til alternativene under Segmentering alternativer, men dette kan raskt endres uten å bearbeide hele datasettet (se avsnitt 4).
4. data segmentering og ensemble snitt
Merk: Når filen er behandlet, topper i vevet gjennomsnitt signal (nederst til høyre spor, figur 1a) vil ha blitt oppdaget og merket med røde sirkler. Bare topper over en angitt terskel (blå linje på spor som er angitt av topp terskelverdi) telles. I tillegg er topper bare telles hvis de er tilstrekkelig forsinket i forhold til tidligere topper, satt av min peak Distance inngang. Signalet blir deretter segmentert basert på de oppdagede toppene. Først beregnes effektiv syklus lengde (CL) for hver topp ved å måle tiden mellom den og den neste toppen. Hvis en rekke topper (satt av min antall Peaks input) har lignende CLs (terskel som er satt av minimum grense input) da de er gruppert og gjennomsnittlig CL for de toppene beregnet.
- For ytterligere segmentering av dataene trykker du på Segment signal. Sub-segmentering alternativer er: ingen -alle topper med samme CL gruppert sammen; Alle -segmenter av nTOPPER innenfor konstant CL ganger (nPeaks er satt av Segment størrelse input) er identifisert; Siste -Final nPEAKS før en CL endring er identifisert og gruppert, og alle andre er ikke analysert; og single beat -dette er det samme som å bruke all segmentering med nPeaks = 1, og så ingen gruppering eller ensemble snitt (se 4,5) er brukt. Dette kan brukes ved å velge single beat -knappen.
- Bruk egendefinerte segmentering av signalet ved å zoome inn på en tid av interesse og velge Segment signal. Dette vil legge til et ekstra alternativ med tittelen zoomet seksjon til seksjonen listeboks, som tilsvarer de tids punktene som er valgt.
- Resultatene av segmentering vises i listen-boksen ved siden av vevet gjennomsnitt signal, og vil vise Seksjons nummer og estimert CL. Alle segmentert tid deler er betegnet av annerledes fargene. Velg et segment fra listeboksen for å utheve den aktuelle delen i rødt. Dette vil også automatisk utløse analyser av denne delen, som om Produser kart -knappen ble valgt (se avsnitt 5).
- Analyser av grupperte topper vil bli utført på ' ensemble gjennomsnitt ' data. Dette innebærer snitt toppene i et segment sammen, med referanse ganger er toppene identifisert i trinn 4,2. Oppdater tidsvinduet til gjennomsnittet ved å endre før -og etter -inngangene og trykke på Segment signalet.
5. action potensial/kalsium transient varighet og Lednings hastighet analyse
- Når bildene er behandlet, vil Produser kart -knappen bli aktiv. Trykk på Produser kart for å bruke action potensiell varighet (APD), aktiveringstid, Lednings hastighet og SNR-analyse. Analysen vil som standard bli brukt på det første signal segmentet. Velg andre segmenter fra listen-boksen vil bruke analyse til valgt segment.
Merk: resultatene av analysen vises i resultattabellen, inkludert gjennomsnitt, standardavvik, standard feil, avvik og 5 til 95te persentil analyse. Varighet kart er kalt ' APD ' kart imidlertid, kalsium signaler behandlet ved hjelp av de samme innstillingene vil måle kalsium forbigående varighet. - Velg få pikselinformasjon for å se en detaljert visning av signalet fra en hvilken som helst piksel i bildet, og Sammenlign piksler for å plotte signaler samtidig fra opptil seks steder.
- Bruk panelet signal behandling til å justere innstillinger for varighets analyse. Disse er: varighet – tid med prosent repolarisering/forfall for å måle fra topp; ' APD ' Baseline -tidsperiode av signal som er definert som referanse Baseline for amplitude målinger; og ' APD ' starttid – starttid for varighets målinger. Dette er de samme alternativene for å avgjøre aktiveringstiden for isochronal kart (omtalt nedenfor) og er betegnet: Start (d2F/dt2Max), oppstrekningen (dF/dtMax), Depolarisation midtpunkt (tid på 50% amplitude), Peak (tid med maksimal amplitude). Disse definisjonene brukes på mus og marsvin handling potensialer er vist i figur 2a.
Merk: Hvis du endrer noen av disse alternativene, oppdateres varighets kartet og resultattabellen automatisk. Det finnes også alternativer for kart skalering og avvikende fjerning.
- Bruk panelet signal behandling til å justere innstillinger for varighets analyse. Disse er: varighet – tid med prosent repolarisering/forfall for å måle fra topp; ' APD ' Baseline -tidsperiode av signal som er definert som referanse Baseline for amplitude målinger; og ' APD ' starttid – starttid for varighets målinger. Dette er de samme alternativene for å avgjøre aktiveringstiden for isochronal kart (omtalt nedenfor) og er betegnet: Start (d2F/dt2Max), oppstrekningen (dF/dtMax), Depolarisation midtpunkt (tid på 50% amplitude), Peak (tid med maksimal amplitude). Disse definisjonene brukes på mus og marsvin handling potensialer er vist i figur 2a.
- Lednings hastighet måles også automatisk innenfor de viktigste programvaregrensesnitt. Dette oppnås ved hjelp av multi-vektor metode Bayly et al26 fra isochronal kartet definert av den valgte aktiverings tiltak (diskutert i trinn 5,4). Trykk på aktiveringspunkter for å gjengi en 3D-representasjon av aktiverings kartet.
- Den multi-vektor Lednings hastighet målemetode romlig segmenter isochronal kartet i regioner av n x n piksler. Angi verdien for n ved å bruke den lokale vindusstørrelsen input, og angi intervallet av aktiverings tider til å bruke analyse til å bruke tilpasnings aktiverings ganger innganger.
Merk: for hver lokal region er en polynom overflate, f, montert som best beskriver forholdet mellom aktiveringstid og romlig posisjon, (x,y). Den gradient vektor, CVLocal, av denne overflaten er da beregnet som:
1
der
betegner den todimensjonale kartesiske romlige differensial operatør26. - For hver piksel i isochronal kartet, en lokal vektor som representerer hastighet og retning av Lednings ledning er beregnet. Velg Isochronal kart med vektorer fra rullegardinmenyen for å vise denne analysen.
- SNR beregnes som forholdet mellom maksimal amplitude sammenlignet med standardavviket for signalet ved Baseline. Denne analysen er utført postere alle behandlingstrinn. Trykk på SNR-beregning i toppmenyen for å redigere innstillinger for perioden for signalet som er definert som opprinnelig plan.
1
betegner den todimensjonale kartesiske romlige differensial operatør26.6. Lednings analyse modul
- Trykk ledning for å få tilgang til mer detaljert analyse av Lednings hastighet. Dette åpner en egen modul der ledningsnett kan kvantifisert ved hjelp av Bayly multi-vektor metode som i de viktigste grensesnittet, enkelt vektor metoder, og som en aktiverings kurve.
- Trykk på single Vector for å analysere ledning ved hjelp av enkel vektor-metoden, der CV beregnes fra forsinkelsen i aktiveringstiden mellom to punkter. Dette kan gjøres ved hjelp av automatiske eller manuelle metoder, valgbar under enkelt Vector knappen.
- For automatisk enkel vektor metode, Velg en avstand og startpunkt for å måle ledning. Programvaren vil da utføre en 360-graders sveip fra det valgte punktet, måle tidsforsinkelsen og beregne tilhørende Lednings hastighet langs alle retninger i 1-graders intervaller. Resultatene av denne analysen vises i grafen ved siden av kartet, og retningen av tregeste ledning er vist i rødt.
- For manuell enkel vektor metode, velge både en start-og sluttpunkt fra isochronal kartet for å beregne Lednings hastighet. Hvis du vil velge et nytt startpunkt, trykker du Tøm startpunkt.
- Trykk Local Vector å bruke multi vektor metoden, med innstillingene samsvarer med de fra de viktigste grensesnittet. Innenfor Lednings-modulen, fordelingen av Lednings hastighet, samt kantete fordeling av beregnede vektorer og kantete avhengighet av Lednings hastighet kan vises.
- Presse aktivisering kurven å plotte prosenten av tissue aktivert som funksjonen av tid. Tid til 100% aktivering vises automatisk, mens egendefinerte verdier for minimum (blå) og maksimum (rød) aktiverings prosenter mellom å måle kan også velges.
7. ytterligere analyser og moduler
- Bortsett fra automatisk utførte varighet og gjennomføring hastighet analyser, kan flere andre parametre være kvantifisert hjelp ElectroMap. Disse analysene kan velges fra rullegardinmenyen over visnings kartet. Velg ett av disse alternativene for å utføre analysen, og resultatene vil vises i 4th -raden i resultattabellen: 1) diastolisk intervall -tid fra 90% repolarisasjon til aktiveringstiden for neste handling potensial; 2) dominerende frekvens -frekvensspekteret av hver piksel er beregnet ved hjelp av rask Fourier Transform, og frekvensen med mest makt er definert som den dominerende frekvensen. Avansert rekkevidde-og vindusinnstillinger for dominerende frekvens analyse er tilgjengelig ved å velge frekvens kartlegging; 3) tid til topp – oppstigningstiden mellom to bruker valgte prosenter (standard 10 til 90%) av den depolarization fasen av handlingen potensial eller frigjøring av kalsium. Prosentverdier kan endres ved å velge ttp innstillinger; og 4) avslapping konstant (τ)-avslapping konstant beregnes ved å montere en mono-eksponentiell forfall av form av skjemaet:
2
hvor fluorescens nivået på time t er avhengig av peak fluorescens, F0, og den påfølgende forfall (C er en konstant)27. Verdien mellom å passe ligningen 2 er valgbar innenfor de viktigste ElectroMap brukergrensesnitt, samt en godhet av passform ekskludering kriterier basert på r2 verdi. - Trykk enkelt filanalyse for å åpne en dedikert modul for høy gjennomstrømming varighet og Lednings analyse av hvert identifiserte segmentet i en fil. Analysen kan utføres på enten hele bildet (varighet, Lednings-og aktiveringstid) eller på utvalgte regioner eller steder av interesse (foreløpig varighet bare). Resultatene er produseres til en CSV-fil.
Merk: for APD verdier fra hele bildet, er den første kolonnen i CSV-filen gjennomsnittet, mens den andre kolonnen er standardavviket. - Trykk på alternans for å starte en frittstående modul for dedikert analyse og kartlegging av Beat-to-beat-variasjon. Se O ' Shea et al. 201913 for mer informasjon om alternans behandlings-og analyse alternativer. Nærmere bestemt er denne modulen utformet for å identifisere to periode svingninger, kjent som alternans. Både varighet og amplitude alternans beregnes og produseres.
Merk: varighets alternans måles ved å sammenligne varighets målingen fra en topp til den neste. det vil si at hvis den høyeste en og to og APD1 og APD2 henholdsvis, vil varigheten alternan (ΔAPD) beregnes som
3
Varighets målingen utføres ved hjelp av innstillingene i det primære grensesnittet. I mellomtiden kan amplitude alternans være kvantifisert og kartlagt på tvers av multi-cellulære forberedelser som absolutt endring (definert som en prosentandel der 0% = samme amplitude mellom en beat og den neste). Videre kan virkningene av fenomener som kalsium belastning bli ytterligere undersøkt ved å måle og sammenligne Last og Release alternans, som tidligere har blitt rapportert28. Hvis L er definert som topp amplitude av store beats (dvs. hvor amplituden er større enn den forrige beat), S amplituden til de små beats, og
D den diastolisk Load av de små beats, utgivelsen alternans ( 
) er definert som:
4
I motsatt fall er Load
alternans () definert som:
5
Alternans målinger kan gjøres over hele vevet, og resultatene av analysen vises i nedre høyre i modulen. Når du først bruker modulen, analysen utføres på tvers av hele eksperimentelle filen, og resultatene vises er en gjennomsnittlig beat-beat forskjell over hele filen. Imidlertid kan analysen begrenses til bestemte tider i filen ved å velge Hold zoom, zoome inn på en bestemt tidsperiode og velge analyser zoomet seksjon. Dette vil oppdatere resultatpanelet for å vise analyse fra den valgte tidsperioden.- Velg spill for å vise en beat-to-beat-video av den alternans analysen. I tillegg kan du velge Opprett gjennomsnittlig kart for å eksportere et kart over alternans virkemåte i gjennomsnitt fra de valgte tids punktene, som er angitt i hurtigmenyen når du bruker denne funksjonen.
- Trykk på fase kart for å starte fase tilordnings modulen. En Hilbert Transform er utført for å beregne momentant fase (mellom-π og + π) av signalene ved hver timepoint. Trykk på spill av eller dra glidebryteren for å visualisere fase atferden over tid, og klikk på en piksel for å gjengi et fase diagram.
2
3
D den diastolisk Load av de små beats, utgivelsen alternans ( 
) er definert som:
4
alternans () definert som:
58. eksportere data
- Data eksporteres fra ElectroMap i en rekke former. Trykk Eksporter verdier for å lagre verdiene for kartet som vises i det primære brukte grensesnittet. Målte verdier kan lagres enten som et kart (bevare pixel plasseringer) eller kondensert inn i en enkelt liste, og kan lagres som. csv,. txt eller. MAT filer.
- Trykk på Eksporter kart for å få opp en pop-up som inneholder kartet som vises, som deretter kan lagres i en rekke bildeformater. Visningsalternativer for kartet styres ved å velge Kartinnstillinger , men kan også redigeres når eksport kart er valgt. En fargelinje kan for eksempel legges til ved å velge dette ikonet fra toppmenyen, og skalaen kan angis ved å velge rediger > fargekartet.
- Trykk på Activation video for å gjengi en animasjon av aktiverings sekvensen, som kan lagres som en animert GIF-fil.
- Trykk på Segment video for å lagre en AVI-videofil av den gjeldende viste parameteren for hvert identifiserte segment.
Representative Results
Alt arbeid utført som en del av denne studien ble foretatt i samsvar med etiske retningslinjer fastsatt av UK Animals (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986 og direktiv 2010/63/EU i Europaparlamentet om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål. Eksperimenter ble godkjent av hjemmekontor (mus: PPL 30/2967 og PFDAAF77F, Guinea Gris: PPL PF75E5F7F) og den institusjonelle gjennomgang styrene ved University of Birmingham (mus) og King ' s College London (marsvin). Du finner detaljerte metoder for innsamling av rådata som er analysert her, i våre tidligere publikasjoner5,6,14,19.
Det viktigste grensesnittet som ElectroMap styres fra, vises i figur 1a. De nødvendige trinnene for å analysere et datasett styres hovedsakelig av Last inn bilder, behandle bilderog lage kart -knapper, og vises uthevet i grønn, blå og rød, henholdsvis i figur 1a. Figur 1B-D viser operasjonene som forekommer ved valg av hver av disse knappene. Last inn bilder bruker bilde terskelverdi alternativene som er valgt av brukeren (figur 1B), mens Prosessbilder (figur 1C) bruker filtrering og Baseline korreksjon. Til slutt, produsere Maps vil første gjennomsnittlige data i henhold til tidsvinduet og segmentering innstillinger (med mindre single beat segmentering er valgt) og deretter utføre analyser beskrevet ovenfor.
Et viktig aspekt ved ElectroMap er fleksibiliteten med hensyn til kameratype og eksperimentell modell. Dette er avgjørende for nytten av en optisk kartlegging programvare på grunn av den distinkte CARDIAC EP og Anatomiske egenskaper som finnes mellom brukte modeller. Figur 2a for eksempel viser handlingen potensielle morfologi av murine Atria i forhold til Guinea Pig ventrikkel, innspilt ved hjelp av spennings følsomme fargestoffer som tidligere rapportert6,14. Til tross for den distinkte formen av handlingen potensial, og bruk av to separate optiske kartlegging kameraer med ulike framerates og piksel størrelser, kan ElectroMap utnyttes til å analysere begge datasettene. Dette krever imidlertid endring av noen parametere i brukergrensesnittet (figur 2b). Note det det langvarig guinea gris aksjonen muligheter nødvendiggjør en større tid vindu. I tillegg, for å hindre Top-hat Baseline korreksjon unphysiologically endre optisk innspilte signaler, må lengden økes slik at den er større enn den tiden løpet av handlingen potensial.
ElectroMap tilbyr en rekke behandlingsalternativer for å bidra til å forbedre SNR av optisk innspilte signaler som kan være nødvendig for å effektivt gjenopprette EP parametere. Et eksempel er automatisert ensemble snitt av topper følgende data segmentering. Figur 3a-C demonstrerer hvordan anvendelsen av Ensemble snitt, i stedet for andre metoder, kan forbedre SNR fra isolerte murine venstre Atria (n = 13). Dette reduserer målings heterogenitet og sannsynligheten for analyse svikt (figur 3D). For eksempel, en endring av pacing frekvens fra 3 Hz til 10 Hz ikke endre APD50, når ingen ensemble snitt er foretatt, men en forventet29 reduksjon i APD50 ved 10 Hz pacing ble observert når målt fra ensemble gjennomsnitt data ( Figur 3E).
Figur 4 demonstrerer effekten og nytten av automatisert tempo frekvens deteksjon og segmentering som tilbys av ElectroMap. Her musen venstre Atria (n = 5) var tempoet på en 120 MS syklus lengde og syklus lengden ble trinnvis forkortet med 10 MS til den nådde 50 MS. ElectroMap automatisk identifisert pacing syklus lengden og gruppert vev gjennomsnitt topper tilsvarende (figur 4a ). Dette ble oppnådd med høy nøyaktighet i alle datasett (figur 4b). Automatisert segmentering av data tillot enkel og høy gjennomstrømming analyse av bremse av Lednings hastighet med økt pacing frekvens/forkortet syklus lengde (figur 4c, D). Samtidig forkortes APD50 (figur 4e) og diastolisk intervall (figur 4f). Amplitude av optisk målte topper redusert, mens tiden til peak økt (figur 4G, H). Dette er igjen forventet restitusjon svar i CARDIAC vev29,30 og bruk av ElectroMap kan hjelpe derfor belyse endringer som svar på pacing frekvens i nærvær av farmakologiske midler, genetisk modifisering, eller sykdomstilstander.
En viktig faktor i bruken av en programvare som ElectroMap er tilstedeværelsen av artefakter i de underliggende dataene. Figur 5, for eksempel viser at bevegelse gjenstander (forvrengningen av optisk innspilt signal ved vev bevegelse) kan utelukke nøyaktige målinger av aktivisering og spesielt repolarisasjon innen ElectroMap. Se diskusjon for ytterligere hensyn.
Figur 1: ElectroMap viktigste behandlingstrinn. (A) grafisk brukergrensesnitt for ElectroMap, med Last images (grønn), Prosessbilder (blå), og produserer kart (rød) knappene uthevet. (B) bilde terskelverdi alternativer som kan brukes ved valg av Last bilder. (C) signal behandlingsalternativer som er tilgjengelige for brukeren, inkluderer romlig og timelig filtrering og korrigering av grunnlinje og kan brukes på bildes takken ved å trykke på Prosessbilder. (D) ensemble snitt og parameter kvantifisering (vist APD måling) som aktiveres ved å velge produsere kart. Figur tilpasset fra O ' Shea et al., 201913. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: analyse av mus og marsvin data ved hjelp ElectroMap. (A) optisk registrert handling potensial fra mus Atria og marsvin ventriklene, sammen med både den første (DF/dt) og andre (d2f/dt2) derivat av disse signalene. Det forskjellige definisjoner for aktivisering og repolarisasjon timene arbeidsføre innen ElectroMap er fremhevet. (B) skjermbilder av innstillinger for bilde-og signalbehandling benyttet i ElectroMaps-grensesnittet. Rød boksene høydepunkt innfatningene det krevde modifisering imellom analyser av musen og Guinea Gris data. Figur tilpasset fra O ' Shea et al., 201913. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: ensemble snitt for å løse APD endringer. (A) APD50 kart og eksempel én piksel signal fra enkelt beat optiske handling potensialer. (B) APD50 Map og eksempel enkelt piksel signal fra optisk handling potensialer generert av Ensemble snitt av 10 påfølgende beats (peak metode). (C) SNR av single beat sammenlignet med 10 beat gjennomsnitt signaler. (D) APD50 heterogenitet (i) og antall måle svikt (II) som en funksjon av SNR for single beat og 10 beat gjennomsnitt APD50 kart. (E) APD50 på 3 og 10 Hz pacing frekvens, målt fra enkelt takt og 10 beat kart. (Data vist som gjennomsnittet ± standard feil, n = 13 venstre Atria, * * * *p < 0,001 av studentens sammenkoblede t-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bruk av ElectroMap til å studere pacing frekvens responser i CARDIAC vev. (A) eksempel ElectroMap skjermbilde av pacing frekvens anerkjennelse og segmentering. (B) sammenligning av kjente og ElectroMap målte Fremdrifts syklus lengder. (C) aktiverings kart på 120 ms og 60 MS tempo syklus lengder. (D-H) Grupperte data for Lednings hastighet (D), APD50 (E), diastolisk intervall (F), amplitude (G) og tid til topp (H) som en funksjon i tempo syklus lengde som avtar fra 120 MS til 60 MS i trinn på 10 MS. (Data vist som gjennomsnittet ± standard feil, n = 5 venstre Atria) Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: effekt av bevegelses artefakter. (A) APD50 Map. (B) aktiverings kart. (C) eksempel signaler fra steder merket (krysser) på APD og aktiverings kart. I området av vevet merket med det røde korset, sammentrekning har ikke blitt vellykket lokomotivet, forvrenger den målte optiske signalet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her presenterer vi en steg-for-steg guide for utnyttelse av åpen kildekode-programvare ElectroMap for fleksibel og multi variabel analyse av CARDIAC optisk kartlegging datasett. For vellykket bruk av ElectroMap, er bildedata nødvendig å være i. tif eller. MAT-formater. ElectroMap inkorporerer flere brukerinnstillinger som kunne endres. Som demonstrert i figur 2a, er dette nødvendig på grunn av den brede heterogenitet som eksisterer mellom eksperimentelle modeller og bilde maskinvare. Dette betyr imidlertid at standardinnstillingene i programvaren vil ikke alltid være optimalt, så et kritisk skritt i å bruke programvaren er for brukeren å tune innstillinger for deres spesielle eksperimentelle oppsett. Disse inkluderer kamerainnstillinger og tidsrammer, som vist i figur 2b. Når optimale innstillinger er funnet, kan disse lagres og lastes på nytt på senere tidspunkt ved å velge konfigurasjonsfil.
Innlemmelse av automatisert CL måling og signal segmentering er viktige fordeler av programvaren. Disse funksjonene tillater analyse av akutte reaksjoner i eksperimentelle opptak og utvide analysen fra å fokusere på isolerte enkelt rytmer. Når ønsket segmentering er oppnådd, tillater enkelt filanalyse modulen automatisert analyse av hvert enkelt segment (inkludert enkelt beats), og innser høy gjennomstrømming analyse av flere variabler over innspillingen produseres i en enkelt. CSV-fil. I forbindelse, ensemble snitt av grupperte topper er en effektiv metode for å forbedre kvaliteten på støyende signaler som automatisk utføres i ElectroMap. Imidlertid er ensemble snitt ikke overalt fordelaktig, for eksempel i studier av Beat-to-beat variasjon. Derfor integrerer ElectroMap enkelt beat segmentering for å unngå ensemble snitt, alternativ behandling alternativer for å forbedre SNR (romlig og Temporal filtrering) og inkluderer alternans analyse modul for å videre undersøke og kart Beat-to-beat variasjon.
Datasett med optisk tilordning viser ofte artefakter som grunnlinje drift og bevegelses artefakter. Like, signalene som genereres kan være lav kvalitet på grunn av små piksel størrelser, korte eksponeringstider og lav brøk fluorescerende endringer2. Disse faktorene forhindrer effektiv og nøyaktig analyse av den underliggende EP-atferden. Som skissert, ElectroMap har flere behandling strategier for å overvinne disse problemene. Men anvendelsen av disse algoritmene til fundamentalt dårlig kvalitet/forvrengte data vil fortsatt hindre effektiv analyse. SNR er derfor en av parametrene som måles og vises i ElectroMap. Samtidig kan brukeren velge og sammenligne signalene fra bestemte regioner fra prøven ved hjelp av pixel info og Sammenlign moduler, slik at identifisering av fenomener som bevegelse artefakter vist i figur 5, og hensiktsmessig utelukkelse av data.
I dag støtter ikke ElectroMap fjerning av bevegelses artefakter fra rådata på samme måte som grunnlinje korrigering. Derfor er en mulig fremtidig utvikling av programvaren inkludering av bevegelse gjenstand fjerning av beregningsorientert metoder som er rapportert31,32. Videre er ElectroMap for tiden begrenset til å studere ett optisk signal. Men for ratiometrisk fargestoffer og samtidig bruk av spenning og kalsium fargestoffer27, samtidig behandling av to bølgelengde kanaler er nødvendig. Integreringen av dual signal analyse er derfor en viktig fremtidig tillegg til programvaren. Utvidelse av analyse alternativer som gjelder for arrhythmic datasett, for eksempel fase singularitet sporing, vil like utvide omfanget av programvaren33,34. Til slutt kan flere av analysealternativene som beskrives, også være nyttige i analyse av elektrode tilordningsdata. Faktisk har ElectroMap blitt brukt til å analysere elektrode kartlegging data til tross for kontrasterende electrogram bølgeform20,35, og videre optimalisering vil utvide bruken for denne modalitet.
Disclosures
P.K. mottar forsknings støtte fra flere legemiddel-og enhets selskaper som er aktive i atrieflimmer og har mottatt honoraria fra flere slike selskaper. L.F. har mottatt institusjonelle forsknings tilskudd EU, BHF, MRC, DFG og Gilead. P.K. og L.F. er oppført som oppfinnere på to patenter holdt av University of Birmingham (atrieflimmer Therapy WO 2015140571, markører for atrieflimmer-2016012783).
Alle andre forfattere erklærer ingen potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av EPSRC studentship (sci-PHY-4-Health Centre for doktorgrads trening L016346) til DP, K.R. og L.F., Wellcome Trust Seed Award Grant (109604/Z/15/Z) til DP, British Heart Foundation Grants (PG/17/55/33087, RG/17/15/33106) til DP , EU (Grant avtalen ingen 633196 [CATCH ME] til P.K. og L.F.), British Heart Foundation (FS/13/43/30324 til P.K. og L.F.; PG/17/30/32961 til P.K. og A.H.), og Leducq Foundation til P.K.. JW støttes av British Heart Foundation (FS/16/35/31952).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB and Simulink R2018a | Mathworks, Inc, Natick, MA | MATLAB software |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G.
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110, 609-623 (2012).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R.
- Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. Local β-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia. Circulation Research. 110, 1454-1464 (2012).
- Syeda, F., et al. PITX2 Modulates Atrial Membrane Potential and the Antiarrhythmic Effects of Sodium-Channel Blockers. Journal of the American College of Cardiology. 68, 1881-1894 (2016).
- Winter, J., et al. Sympathetic nervous regulation of cardiac alternans in the intact heart. Frontiers in Physiology. 9, 1-12 (2018).
- Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7, 313-320 (2014).
- Sato, P. Y., et al. Loss of Plakophilin-2 Expression Leads to Decreased Sodium Current and Slower Conduction Velocity in Cultured Cardiac Myocytes. Circulation Research. 105, 523-526 (2009).
- Yu, T. Y., et al. Optical mapping design for murine atrial electrophysiology. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering: Imaging & Visualization. 5, 368-378 (2017).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 303, H753-H765 (2012).
- Crocini, C., Ferrantini, C., Pavone, F. S., Sacconi, L. Optogenetics gets to the heart: A guiding light beyond defibrillation. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 132-139 (2017).
- Entcheva, E., Bub, G. All-optical control of cardiac excitation: Combined high-resolution optogenetic actuation and optical mapping. The Journal of Physiology. 9, 2503-2510 (2016).
- O’Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
- Yu, T. Y., et al. An automated system using spatial oversampling for optical mapping in murine atria. Development and validation with monophasic and transmembrane action potentials. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 340-348 (2014).
- Jaimes, R., et al. Functional response of the isolated, perfused normoxic heart to pyruvate dehydrogenase activation by dichloroacetate and pyruvate. Pflugers Archiv. 468, 131-142 (2016).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308, H1112-H1125 (2015).
- Parrish, D. C., et al. Transient denervation of viable myocardium after myocardial infarction does not alter arrhythmia susceptibility. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory. , (2017).
- Ihara, K., et al. Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping. Journal of Visualized Experiments. (132), e56478 (2018).
- Holmes, A. P., et al. A Regional Reduction in Ito and IKACh in the Murine Posterior Left Atrial Myocardium Is Associated with Action Potential Prolongation and Increased Ectopic Activity. Plos One. 11, e0154077 (2016).
- Lang, D., et al. Arrhythmogenic remodeling of β
2 versus β1 adrenergic signaling in the human failing heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8, 409-419 (2015). - Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
- Wen, Q., et al. Transverse cardiac slicing and optical imaging for analysis of transmural gradients in membrane potential and Ca2+ transients in murine heart. The Journal of Physiology. 596, 3951-3965 (2018).
- Houston, C., et al. Characterisation of re-entrant circuit (or rotational activity) in vitro using the HL1-6 myocyte cell line. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 119, 155-164 (2018).
- Yu, T. Y., et al. Optical mapping design for murine atrial electrophysiology. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering: Imaging and Visualization. 5, 368-376 (2017).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 303, H753-H765 (2012).
- Bayly, P. V., et al. Estimation of Conduction Velocity Vector Fields from Epicardial Mapping Data. IEEE Transactions on Bio-Medical Engineering. 45, 563-571 (1998).
- Jaimes, R., et al. A technical review of optical mapping of intracellular calcium within myocardial tissue. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 310, H1388-H1401 (2016).
- Wang, L., et al. Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: Ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation. Circulation Research. 114, 1410-1421 (2014).
- Winter, J., Shattock, M. J. Geometrical considerations in cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis. Europace. , (2016).
- Mironov, S., Jalife, J., Tolkacheva, E. G. Role of conduction velocity restitution and short-term memory in the development of action potential duration alternans in isolated rabbit hearts. Circulation. 118, 17-25 (2008).
- Khwaounjoo, P., et al. Image-Based Motion Correction for Optical Mapping of Cardiac Electrical Activity. Annals of Biomedical Engineering. 43, 1235-1246 (2014).
- Christoph, J., Luther, S. Marker-Free Tracking for Motion Artifact Compensation and Deformation Measurements in Optical Mapping Videos of Contracting Hearts. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Umapathy, K., et al.
- Tomii, N., et al. Detection Algorithm of Phase Singularity Using Phase Variance Analysis for Epicardial Optical Mapping Data. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63, 1795-1803 (2016).
- Cantwell, C. D., et al. Techniques for automated local activation time annotation and conduction velocity estimation in cardiac mapping. Computers in Biology and Medicine. 65, (2015).
