1. indsamling af optisk kortdata Udfør kardiel optisk kortlægning ved hjælp af en af en bred vifte af eksperimentelle modeller, herunder intakt og isoleret hele hjerter6,18, isoleret Atria14,19, ventrikulære kiler20, hjerte skiver 21 , 22, og cellulære monolag23. Se tilknyttede referencer for eksperimentelle designs for at indsamle rå optiske kortlægnings data fra disse præparater. Forudsat at de indhentede data kan konverteres til en TIFF-stak eller gemmes i en. MAT-fil, skal den kunne analyserbar ved hjælp af Elektromap. Dette omfatter data af varierende dimensioner (kvadratisk/rektangulær) og opløsninger (maksimum testet i øjeblikket 2048 pixels x 2048 pixels). 2. software installation og opstart Bemærk: nedenfor er detaljeret de to metoder til at installere og køre Elektromap – enten inden for MATLAB køre fra kilde (. m) kode eller som en standalone eksekverbar fil (. exe til Windows). Den endelige software og dens funktionalitet er invariant mellem de to opsætningsmuligheder (bortset fra nogle få forskelle i mappe navigation). Derfor er de vigtigste overvejelser for at vælge version til at installere adgang til MATLAB og krævede værktøjskasser og om adgang til kildekode ønskes. Hvor det er muligt, anbefales det at bruge MATLAB-versionen til hurtigere opstartstider, kortere behandlingstid og nemmere fejlrapportering. Setup 1: kører elektromap inden for MATLAB Installer MATLAB. ElectroMap blev designet i MATLAB 2017a, men, software er blevet testet til brug i alle efterfølgende udgivelser af MATLAB (op til 2018b på tidspunktet for skrivning). Følgende værktøjskasser er påkrævede: billedbehandling, signal behandling, statistik og maskinel indlæring og kurve montering. Download/klon alle filer fra den seneste ‘ kildekode ‘ frigivelse af Elektromap fra GitHub repository (https://github.com/CXO531/ElectroMap). Udpak det hentede indhold til den ønskede placering. Åbn MATLAB, og Naviger til den mappeplacering, som er vært for Elektromap-kildekoden. Åbn derefter filen electromap. m , og tryk på Kør i editoren, eller alternativt type elektromap i kommandovinduet, og tryk på Returtasten. Dette vil starte Elektromap brugergrænseflade, figur 1a. Setup 2: standalone. exe fil Hent installationsfilen: https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI. Følg instruktionerne i installationsprogrammet, som vil downloade krævede MATLAB Runtime fra internettet sammen med Elektromap software. Kør Electromap. exe.Bemærk: opstart tid for den standalone version kan være flere minutter. 3. indlæsning af billede og forbehandling Tryk på Vælg mappe , og Naviger til placeringen af den eller de datafiler, der skal analyseres. Dette vil udfylde den venstre liste med alle filer i denne mappe, der er af den korrekte filtype (. tif eller. MAT). . MAT-filer må kun indeholde billedstak variablen.Bemærk: kun mapper og ikke individuelle filer vises, når du navigerer gennem Biblioteks vælgeren. Vælg fil, der skal indlæses fra i grænsefladen, og tryk på Indlæs billeder. Når indlæst, det første billede vises, og den røde kontur vil indikere automatisk tærskel for billedet. Hvis det er nødvendigt, skal du genindlæse tidligere brugte ROIs ved at vælge Gem/Indlæs ROI. I dette tilfælde, springe trin 3,3. Som standard er tærskel baseret på pixel intensiteterne i det første billede. Hvis det ønskes, ændre dette til en tærskel baseret på signalet Time Course amplitude ved at ændre indstillingen i billedet for tærskel rullemenuen. Bemærk, at når tærskel er valgt, anvendes den derefter til hele billed stakken. Hvis det ønskes, skal du ændre tærskel indstillingen til Manuel, som aktiverer skyderen for manuelt at justere billed tærsklen. Du skal desuden beskære billeder (beskære billede) og/eller tegne et brugerdefineret interesseområde (Brugerdefineret ROI) til analyse ved at vælge de relevante afkrydsningsfelt (er) under tærskelindstillinger. Bemærk, at avancerede indstillinger for område af interesse udvælgelse såsom antal områder er tilgængelige fra ROI udvælgelse fra den øverste menu. Når der er anvendt en passende tærskel, skal du trykke på proces billeder for at anvende behandlingen. Indstillingerne for behandling er beskrevet nedenfor (trin 3.4.1-3.4.5). På dette tidspunkt skal du sørge for, at de korrekte kameraindstillinger er indtastet. Disse er pixelstørrelse i ΜM (vigtigt: Dette er billedets pixelstørrelse, og ikke størrelsen af de pixels, der udgør chippen eller tilsvarende hardware i billedenheden) og frame rate i kHz. For signal inversion skal du markere afkrydsningsfeltet inverter data for at aktivere. Hvis rapporteret fluorescerende signal er omvendt proportional med parameter af interesse (som med almindeligt anvendte potentiometriske farvestoffer) signalet kan inverteres. Vælg Gaussian eller Average i kerne menuen for afstands filtrering. Størrelsen af det rumligt gennemsnit område styres af størrelsen input støder op til kernen dropdown menu (dvs. 3 resultater i 3 pixel x 3 pixel filter kernel). Når du anvender et Gaussian-filter, kan standardafvigelsen også indstilles fra Sigma -indgangen. For korrektion ved baseline skal du vælge top-hat24 eller polynomium (4th eller 11th grad) korrektion25 fra baseline menuen. Korrektion kan anvendes på hver pixel individuelt (lang behandlingstid) eller som et gennemsnit af hele billedet (hurtigere, men antager homogene grundlæggende ændringer). Top-hat korrektion kan også ændres ved at indstille top-hat længde i millisekunder, støder op til den grundlæggende udvælgelse dropdown menu. Længden af top-hat kernen bør være større end tidsskalaen af de enkelte handlings potentialer/calcium transienter. For tidsmæssig filtrering, Vælg Savitzky-Goaly eller Infinite Impulse (IIR) filtrering fra filtrering menuen.Bemærk: andre end for det gennemsnitlige vævs signal, der vises nederst til venstre, anvendes temporale filtrering på hver pixel individuelt på tidspunktet for parameter kvantificering fra ensemble gennemsnitlige billed intervaller. Dette er blevet implementeret for at reducere behandlingstid ved at filtrere små sektioner af data, når det kræves i stedet for hele filer. Til fjernelse af billeder skal du være opmærksom på, at hvis indstillingen Fjern rammer er valgt, kan store toppe med amplitude, der er større end interesse signalet, fjernes fra billed sættet. Dette kan være nyttigt i optisk tempo datasæt såsom optogenetisk pacing hvor depolarisering initieres ved optisk aktivering af opsiner såsom channelrhodopsin 211,12.Bemærk: da frame Removal potentielt vil introducere ufysiologiske trin ændringer i Billedsignalerne, kan tidsmæssig filtrering introducere artefakter til dataene, og det anbefales derfor ikke her. Bemærk, at signalet vil blive segmenteret, når proces billeder er blevet valgt i henhold til mulighederne under segmenterings muligheder, men dette kan hurtigt ændres uden at genbehandle hele datasættet (Se afsnit 4). 4. data segmentering og ensemble gennemsnit Bemærk: når filen er behandlet, vil toppe i det gennemsnitlige vævs signal (nederste højre spor, figur 1a) være blevet detekteret og mærket af røde cirkler. Kun toppe over en fastsat tærskel (blå linje på spor, der er indstillet af peak tærskel) tælles. Derudover tælles toppe kun, hvis de er tilstrækkeligt forsinkede i forhold til de tidligere toppe, der er indstillet af min peak distance input. Signalet er derefter segmenteret baseret på de detekterede toppe. For det første beregnes den effektive cyklus længde (CL) af hver spids ved at måle tiden mellem den og den næste top. Hvis et antal toppe (fastsat af min. antal toppe input) har lignende CLS (tærskel for som er fastsat af minimum grænse input) så de er grupperet og den gennemsnitlige CL for disse toppe beregnet. For yderligere segmentering af data, tryk segment signal. Sub-segmentering muligheder er: ingen – alle toppe med samme CL grupperet sammen; Alle – segmenter af ntoppe inden for konstante CL-tider (ntoppe er indstillet af segment størrelse input) er identificeret; Sidst -Final ntoppe før en CL ændring identificeres og grupperes, og alle andre er ikke analyseret; og single Beat -dette svarer til at anvende alle segmentering med nPeaks = 1, og så ingen gruppering eller ensemble gennemsnit (Se 4,5) anvendes. Dette kan anvendes ved at vælge single Beat -knappen. Anvend brugerdefineret segmentering af signalet ved at zoome ind på en tid af interesse og vælge segment signal. Dette vil tilføje en ekstra indstilling med titlen zoomet afsnit til sektions listeboks, svarende til de valgte tidspunkter. Resultaterne af segmentering vil blive vist i listen-boksen støder op til det gennemsnitligt væv signal, og vil vise sektionsnummer og den anslåede CL. Alle segmenterede tids sektioner er angivet med forskellige farver. Vælg et segment fra listefeltet for at fremhæve den pågældende sektion med rødt. Dette vil også automatisk udløse analyser af dette afsnit, som om knappen producer kort blev valgt (Se afsnit 5). Analyser af grupperede toppe vil blive udført på “ensemble gennemsnit” data. Dette indebærer gennemsnit af toppe i et segment sammen, med reference tiderne er de toppe identificeret i trin 4,2. Opdater tidsvinduet til gennemsnit ved at ændre før -og efter -input og trykke på segment signalet. 5. aktionspotentiale/calcium forbigående varighed og lednings hastighed analyse Når billederne er blevet behandlet, vil knappen producer kort blive aktiv. Tryk på producer Maps for at anvende aktions potentiel varighed (APD), aktiveringstidspunkt, lednings hastighed og SNR-analyse. Som standard vil analysen blive anvendt på det første signal segment. Vælg andre segmenter fra listefeltet vil anvende analyse på det valgte segment.Bemærk: resultaterne af analysen vises i resultattabellen, herunder middelværdi, standardafvigelse, standardfejl, varians og 5th til 95th percentilanalyse. Varighed kort kaldes ‘ APD ‘ kort men, calcium signaler behandlet ved hjælp af de samme indstillinger vil måle calcium forbigående varighed. Vælg Hent pixeloplysninger for at se en detaljeret visning af signalet fra en vilkårlig pixel i billedet, og Sammenlign pixel for at afbilde signaler på samme tid fra op til 6 placeringer. Brug panelet signal behandling til at justere indstillingerne for varigheds analyse. Disse er: varighed -tid af procent repolarisering/forfald at måle fra Peak; ‘ APD ‘ baseline -tidsperiode for signal, der er defineret som referencebase line for amplitude målinger; og ‘ APD ‘ starttid -starttidspunkt for varigheds målinger. Disse er de samme muligheder for at beslutte aktiveringstiden for isochronal Maps (diskuteret nedenfor) og kaldes: Start (d2F/dt2Max), upstroke (DF/dtMax), depolariserings midtpunkt (tid på 50% amplitude), Peak (tidspunkt for maksimal amplitude). Disse definitioner, der anvendes på handlings potentialerne for mus og marsvin, er vist i figur 2a.Bemærk: Hvis du ændrer nogen af disse indstillinger, opdateres varigheds oversigten og resultattabellen automatisk. Kort skalering og outlier fjernelse muligheder er også tilgængelige. Lednings hastigheden måles også automatisk inden for den primære software grænseflade. Dette opnås ved hjælp af multi vektor metoden i Bayly et al26 fra det isochronale kort, der er defineret af den valgte aktiveringsforanstaltning (omtalt i trin 5,4). Tryk på aktiverings punkter for at gengive en 3D-repræsentation af aktiverings kortet. Den multi-vektor lednings hastighed måling metode rumligt segmenter isochronal kort i regioner af n x n pixels. Indstil værdien af n ved hjælp af den lokale vinduesstørrelse input, og Indstil intervallet af aktiverings tider for at anvende analyse til at bruge tilpasningen aktiverings tider indgange.Bemærk: for hver lokal region, en polynomium overflade, f, er monteret, der bedst beskriver forholdet mellem Aktiveringstid og rumlig position, (x,y). Gradient vektor, CVlokale, af denne overflade beregnes derefter som:1hvor betegner den todimensionale kartesiske rumlige differentialoperatør26. For hver pixel i isochronal map beregnes en lokal vektor, der repræsenterer hastighed og retningen af ledning. Vælg Isochronal map med vektorer i rullemenuen Vis for at se denne analyse. SNR beregnes som forholdet mellem den maksimale amplitude sammenlignet med standardafvigelsen for signalet ved baseline. Denne analyse udføres efter alle behandlingstrin. Tryk på SNR-beregning i den øverste menu for at redigere indstillingerne for den periode af signalet, der er defineret som oprindelig plan. 6. lednings analysemodul Tryk ledning for at få adgang til mere detaljeret analyse af lednings hastigheden. Dette åbner et separat modul, hvor ledning kan kvantificeres ved hjælp af Bayly multi-vektor metode som i hovedgrænsefladen, enkelt vektor metoder, og som en aktiverings kurve. Tryk på en enkelt vektor for at analysere ledning ved hjælp af den enkelte vektor metode, hvor CV beregnes ud fra forsinkelsen i aktiveringstiden mellem to punkter. Dette kan gøres ved hjælp af automatiske eller manuelle metoder, vælges under den enkelte vektor knap. For automatisk enkelt vektor metode skal du vælge en distance og et startpunkt, hvorfra der skal måles ledning. Softwaren vil derefter udføre en 360-graders Sweep fra det valgte punkt, måling af tidsforsinkelsen og beregning af den tilhørende lednings hastighed langs alle retninger i 1-graders intervaller. Resultaterne af denne analyse vises i grafen ved siden af kortet, og retningen af den langsomste ledning vises med rødt. For manuel enkelt vektor metode skal du vælge både et start-og slutpunkt fra isochronal-kortet for at beregne lednings hastigheden. Tryk på Ryd startpunktfor at vælge et nyt startpunkt. Tryk på lokal vektor for at anvende multi vektor metoden, hvor indstillingerne svarer til dem fra hovedgrænsefladen. Inden for lednings modulet kan fordelingen af lednings hastigheder samt vinkel fordelingen af beregnede vektorer og den kantede afhængighed af lednings hastigheden vises. Tryk på aktiverings kurven for at afbilde den procentdel af vævet, der er aktiveret som en funktion af tiden. Tid til 100% aktivering vises automatisk, mens brugerdefinerede værdier for minimum (blå) og maksimum (rød) aktiverings procenter, der skal måles, kan også vælges. 7. yderligere analyser og moduler Bortset fra automatisk udførte varighed og lednings hastighed analyser, flere andre parametre kan kvantificeres ved hjælp af Elektromap. Disse analyser er valgbare fra rullemenuen over display kortet. Vælg en af disse muligheder for at udføre analysen, og resultaterne vises i den 4. række i resultattabellen: 1) diastolisk interval – tid fra 90% repolarisering til aktiveringstidspunkt for det næste aktionspotentiale; 2) dominerende frekvens -frekvensspektrum af hver pixel beregnes ved hjælp af fast Fourier transformation, og frekvensen med den mest magt er defineret som den dominerende frekvens. Avancerede indstillinger for rækkevidde og vindue til dominerende frekvens analyse er tilgængelige ved at vælge frekvens tilknytning. 3) tid til peak -stigningen tid mellem to brugervalgte procenter (standard 10 til 90%) af den depolariserings fase af aktionspotentialet eller frigivelsen af calcium. Procentværdier kan ændres ved at vælge TTP-indstillinger. og 4) afslapning konstant (τ)-afslapning konstant beregnes ved at montere en mono-eksponentiel forfald af formen af formen:2Hvis fluorescens niveauet på tidspunktet t afhænger af den maksimale fluorescens, F0, og det efterfølgende forfald (C er en konstant)27. Værdien mellem at passe ligning 2 er valgbar inden for de vigtigste elektromagnetisk brugergrænseflader, samt en godhed af pasform udelukkelseskriterier baseret på r2 værdi. Tryk på Enkeltfilanalyse for at åbne et dedikeret modul til varighed af høj gennemløb og lednings analyse af hvert identificeret segment i en fil. Analysen kan udføres på enten hele billedet (varighed, lednings-og aktiveringstidspunkt) eller på udvalgte områder eller interessepunkter (kun i øjeblikket varighed). Resultaterne er forbruges til en. csv-fil.Bemærk: for APD-værdier fra hele billedet er den første kolonne i. csv-filen middelværdien, mens den anden kolonne er standardafvigelsen. Tryk på alternans for at starte et selvstændigt modul til dedikeret analyse og kortlægning af Beat-to-beat variabilitet. Se O’Shea et al. 201913 for detaljer om alternans forarbejdning og analyse muligheder. Specifikt, dette modul er designet til at identificere to perioden svingninger, kendt som alternans. Både varighed og amplitude alternans beregnes og outputted.Bemærk: varighed alternans måles ved at sammenligne varigheds målingen fra en top til den næste; Hvis henholdsvis peak en og to og APD1 og APD2 , så varigheden ALTERNAN (δapd) beregnes som3Varigheds målingen udføres ved hjælp af indstillingerne i hovedgrænsefladen. I mellemtiden kan amplitude alternans kvantificeres og kortlægges på tværs af multi cellulære præparater som absolut ændring (defineret som en procentdel, hvor 0% = samme amplitude mellem et beat og det næste). Desuden kan virkningerne af fænomener som calcium belastning yderligere undersøges ved at måle og sammenligne belastning og frigive alternans, som det tidligere er rapporteret28. Hvis L er defineret som peak amplitude af de store beats (dvs. hvor amplituden er større end den foregående Beat), S amplituden af de små beats, ogD den diastoliske belastning af de små beats, frigivelsen alternans ( ) defineres som:4Omvendt er last alternans () defineret som:5Alternans målinger kan foretages på tværs af hele vævet, og resultaterne af analysen vises i nederste højre af modulet. Når du først bruger modulet, udføres analysen på tværs af hele eksperimentel filen, og de viste resultater er en gennemsnitlig Beat-Beat-forskel på tværs af hele filen. Analysen kan dog begrænses til bestemte tidspunkter i filen ved at vælge hold zoom, zoome ind på et bestemt tidsrum og vælge Analysér zoomet afsnit. Dette opdaterer resultatpanelet, så det viser analysen fra den valgte tidsperiode. Vælg Afspil for at vise en Beat-to-beat-video af alternans-analysen. Derudover skal du vælge Opret gennemsnitlig kort for at eksportere et kort over alternans adfærd i gennemsnit fra valg af tidspunkter, som er indstillet i pop-up-menuen, når du bruger denne funktion. Tryk på fase kort for at starte fase tilknytnings modulet. En Hilbert transformation udføres for at beregne den øjeblikkelige fase (mellem-π og + π) af signalerne på hvert tidspunkt. Tryk på Afspil eller træk skyderen for at visualisere fase adfærden over tid, og klik på en pixel for at gengive et fase diagram. 8. eksport af data Data eksporteres fra Elektromap i forskellige former. Tryk på Eksportér værdier for at gemme værdierne for det aktuelt viste kort i den primære anvendte grænseflade. Målte værdier kan gemmes som enten et kort (bevarer pixel placeringer) eller komprimeres til en enkelt liste og kan gemmes som. csv,. txt eller. MAT filer. Tryk på Eksporter kort for at få vist et pop op-billede med det aktuelt viste kort, som derefter kan gemmes i forskellige billedformater. Visningsindstillinger for kortet styres ved at vælge Kortindstillinger , men kan også redigeres, når Eksporter kort er blevet valgt. For eksempel kan en farvebjælke tilføjes ved at vælge dette ikon fra den øverste menu, og skalaen kan indstilles ved at vælge rediger ≫ colormap. Tryk på aktiverings video for at gengive en animation af aktiverings sekvensen, som kan gemmes som en animeret. gif-fil. Tryk på segment video for at gemme en. avi-videofil af den aktuelt viste parameter for hvert identificeret segment.