1. optisk kartlegging datainnsamling Utføre hjerte optisk kartlegging ved hjelp av en rekke eksperimentelle modeller, inkludert intakt og isolert hele hjerter6,18, isolert Atria14,19, ventrikkel kiler20, CARDIAC skiver 21 priser og , 22, og Cellular monolagere23. Se tilknyttede referanser for eksperimentelle design for å samle inn rå optisk kartlegging data fra disse forberedelsene. Forutsatt at data innhentet kan konverteres til en TIFF stabel eller lagret i en. MAT-fil, bør den være analyzable ved hjelp av ElectroMap. Dette inkluderer data av varierende dimensjoner (firkantet/rektangulær) og oppløsninger (maksimalt testet for øyeblikket 2048 piksler x 2048 piksler). 2. programvareinstallasjon og oppstart Merk: nedenfor er detaljert de to metodene for å installere og kjøre ElectroMap-enten innenfor MATLAB kjøre fra kilden (. m) kode eller som en frittstående kjørbar fil (. exe for Windows). Det final programvare og dens funksjonaliteten er invariant imellom det to setup valgmulighetene (annet enn et par forskjellene inne adresseliste styringen). Derfor er de viktigste hensyn for å velge versjon å installere er tilgang til MATLAB og nødvendige verktøykasser og om tilgang til kildekoden er ønsket. Der det er mulig, anbefales det å bruke MATLAB-versjonen for raskere oppstart ganger, kortere behandlingstid, og enklere feilrapportering. Oppsett 1: kjører electromap i MATLAB Installere MATLAB. ElectroMap ble designet i MATLAB 2017a, har imidlertid programvare blitt testet for bruk i alle påfølgende utgivelser av MATLAB (opp til 2018b i skrivende stund). Følgende verktøykasser kreves: bildebehandling, signal behandling, statistikk og maskinlæring og kurve montering. Last ned/Klon alle filer fra den siste “kildekoden” utgivelsen av ElectroMap fra GitHub depotet (https://GitHub.com/CXO531/ElectroMap). Unzip det dataoverførte innholdet å en ønsket plasseringen. Åpne MATLAB og naviger til mappeplasseringen vert for ElectroMap kildekoden. Deretter åpner filen ElectroMap. m og trykk Kjør i editoren, eller alternativt skrive ElectroMap i kommandovinduet og trykk Return. Dette vil starte ElectroMap brukergrensesnitt, figur 1a. Oppsett 2: standalone. exe-fil Last ned installasjonsfilen: https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI. Følg instruksjonene i installasjonsprogrammet, som vil laste ned nødvendig MATLAB Runtime fra nettet sammen med ElectroMap programvare. Kjør ElectroMap. exe.Merk: Start opp tid for den frittstående versjonen kan være flere minutter. 3. bilde lasting og pre-prosessering Trykk på Velg mappe og naviger til plasseringen av datafilen (e) som skal analyseres. Denne ville fylle det igjen-hånd liste med alle fil-størrelse innen det adresseliste det er av det korrekt arkiv type (. tif eller. MAT). . MAT-filer må bare inneholde variabelen for bildes takken.Merk: bare mapper og ikke individuelle filer vises når du navigerer gjennom katalog velgeren. Velg filen som skal lastes inn fra grensesnittet, og trykk på Last inn bilder. Når den er lastet inn, vises den første rammen, og den røde disposisjonen vil indikere automatisk terskelverdi av bildet. Hvis nødvendig, laster du tidligere brukte ROIs på nytt ved å velge Lagre/Last inn ROI. I dette tilfellet hopper du over trinn 3,3. Som standard er terskelverdi basert på piksel intensiteten i det første bildet. Hvis ønskelig, endre dette til en terskel basert på signalet tid kurset amplitude ved å endre alternativet i bildet for terskel rullegardinmenyen. Vær oppmerksom på at når terskelverdi er valgt, er det da søkt på hele bildet stabelen. Om ønskelig kan du endre terskel alternativet til manuell, som vil aktivere glidebryteren for å justere bilde terskelen manuelt. I tillegg beskjære bilder (beskjære bilde) og/eller tegne et egendefinert område av interesse (Egendefinert ROI) for analyse ved å velge den aktuelle kryss boksen (e) under terskel alternativer. Note det avansert valgmulighetene for område av begrave utvalg som antallet av arealer er anvendelig fra ROI utvalg fra overdelen meny. Når du har brukt en passende terskel, trykker du Prosessbilder for å bruke behandlingen. Innstillinger for behandling er beskrevet nedenfor (trinn 3.4.1-3.4.5). Nå må du kontrollere at du har angitt riktige kamerainnstillinger. Dette er pikselstørrelse i ΜM (viktig: Dette er bilde pikselstørrelsen, og ikke størrelsen på pikslene som utgjør brikken eller tilsvarende maskinvare i bildeenheten) og bildefrekvens i kHz. For signal inversjon merker du av for Inverter data for å aktivere. Hvis rapportert fluorescerende signal er omvendt proporsjonal med parameter av interesse (som med vanlig brukte potensiometrisk fargestoffer) signalet kan bli invertert. For romlig filtrering velger du Gaussian eller Average fra kjerne menyen. Størrelsen på romlig gjennomsnitt området styres av størrelsen input tilstøtende til kernel dropdown menyen (dvs. 3 resultater i 3 pixel x 3 pixel filter kernel). Når du bruker et Gaussian-filter, kan standardavviket også angis fra Sigma -inndata. For Baseline korreksjon, Velg Top-hat24 eller polynom (4th eller 11th grad) korreksjon25 fra Baseline -menyen. Korreksjon kan brukes på hver piksel individuelt (lang behandlingstid) eller som et gjennomsnitt av hele bildet (raskere, men forutsetter homogene grunn endringer). Topp-hat korreksjon kan også endres ved å sette Top-hat lengde i millisekunder, ved siden av den planlagte valg dropdown menyen. Lengden på Top-hat-kjernen bør være større enn tidsskalaen til den enkelte handling potensialer/kalsium transienter. For midlertidig filtrering velger du filtrering av Savitzky-Goaly eller uendelig impuls (IIR) fra filtrerings menyen.Merk: annet enn for vevet gjennomsnittlig signal som vises i nedre venstre, Temporal filtrering brukes på hver piksel individuelt på tidspunktet for parameter kvantifisering fra ensemble gjennomsnitt bildeområder. Dette er implementert for å redusere behandlingstiden ved å filtrere små deler av data når det kreves i stedet for hele filer. For fjerning av bilder, Legg merke til at hvis alternativet Fjern rammer er valgt, kan store topper med amplitude større enn signalet av interesse fjernes fra bilde settet. Denne kanskje være nyttig inne optisk tempoet datasett som optogenetic pacing der hvor depolarization er innviet av optisk aktivisering av opsins som channelrhodopsin 211,12.Merk: som ramme fjerning vil potensielt innføre unfysiologisk trinn endringer i bildesignaler, kan Temporal filtrering innføre artefakter til data og så er ikke anbefalt her. Merk at signalet vil bli segmentert når prosessen bilder er valgt i henhold til alternativene under Segmentering alternativer, men dette kan raskt endres uten å bearbeide hele datasettet (se avsnitt 4). 4. data segmentering og ensemble snitt Merk: Når filen er behandlet, topper i vevet gjennomsnitt signal (nederst til høyre spor, figur 1a) vil ha blitt oppdaget og merket med røde sirkler. Bare topper over en angitt terskel (blå linje på spor som er angitt av topp terskelverdi) telles. I tillegg er topper bare telles hvis de er tilstrekkelig forsinket i forhold til tidligere topper, satt av min peak Distance inngang. Signalet blir deretter segmentert basert på de oppdagede toppene. Først beregnes effektiv syklus lengde (CL) for hver topp ved å måle tiden mellom den og den neste toppen. Hvis en rekke topper (satt av min antall Peaks input) har lignende CLs (terskel som er satt av minimum grense input) da de er gruppert og gjennomsnittlig CL for de toppene beregnet. For ytterligere segmentering av dataene trykker du på Segment signal. Sub-segmentering alternativer er: ingen -alle topper med samme CL gruppert sammen; Alle -segmenter av nTOPPER innenfor konstant CL ganger (nPeaks er satt av Segment størrelse input) er identifisert; Siste -Final nPEAKS før en CL endring er identifisert og gruppert, og alle andre er ikke analysert; og single beat -dette er det samme som å bruke all segmentering med nPeaks = 1, og så ingen gruppering eller ensemble snitt (se 4,5) er brukt. Dette kan brukes ved å velge single beat -knappen. Bruk egendefinerte segmentering av signalet ved å zoome inn på en tid av interesse og velge Segment signal. Dette vil legge til et ekstra alternativ med tittelen zoomet seksjon til seksjonen listeboks, som tilsvarer de tids punktene som er valgt. Resultatene av segmentering vises i listen-boksen ved siden av vevet gjennomsnitt signal, og vil vise Seksjons nummer og estimert CL. Alle segmentert tid deler er betegnet av annerledes fargene. Velg et segment fra listeboksen for å utheve den aktuelle delen i rødt. Dette vil også automatisk utløse analyser av denne delen, som om Produser kart -knappen ble valgt (se avsnitt 5). Analyser av grupperte topper vil bli utført på ‘ ensemble gjennomsnitt ‘ data. Dette innebærer snitt toppene i et segment sammen, med referanse ganger er toppene identifisert i trinn 4,2. Oppdater tidsvinduet til gjennomsnittet ved å endre før -og etter -inngangene og trykke på Segment signalet. 5. action potensial/kalsium transient varighet og Lednings hastighet analyse Når bildene er behandlet, vil Produser kart -knappen bli aktiv. Trykk på Produser kart for å bruke action potensiell varighet (APD), aktiveringstid, Lednings hastighet og SNR-analyse. Analysen vil som standard bli brukt på det første signal segmentet. Velg andre segmenter fra listen-boksen vil bruke analyse til valgt segment.Merk: resultatene av analysen vises i resultattabellen, inkludert gjennomsnitt, standardavvik, standard feil, avvik og 5 til 95te persentil analyse. Varighet kart er kalt ‘ APD ‘ kart imidlertid, kalsium signaler behandlet ved hjelp av de samme innstillingene vil måle kalsium forbigående varighet. Velg få pikselinformasjon for å se en detaljert visning av signalet fra en hvilken som helst piksel i bildet, og Sammenlign piksler for å plotte signaler samtidig fra opptil seks steder. Bruk panelet signal behandling til å justere innstillinger for varighets analyse. Disse er: varighet – tid med prosent repolarisering/forfall for å måle fra topp; ‘ APD ‘ Baseline -tidsperiode av signal som er definert som referanse Baseline for amplitude målinger; og ‘ APD ‘ starttid – starttid for varighets målinger. Dette er de samme alternativene for å avgjøre aktiveringstiden for isochronal kart (omtalt nedenfor) og er betegnet: Start (d2F/dt2Max), oppstrekningen (dF/dtMax), Depolarisation midtpunkt (tid på 50% amplitude), Peak (tid med maksimal amplitude). Disse definisjonene brukes på mus og marsvin handling potensialer er vist i figur 2a.Merk: Hvis du endrer noen av disse alternativene, oppdateres varighets kartet og resultattabellen automatisk. Det finnes også alternativer for kart skalering og avvikende fjerning. Lednings hastighet måles også automatisk innenfor de viktigste programvaregrensesnitt. Dette oppnås ved hjelp av multi-vektor metode Bayly et al26 fra isochronal kartet definert av den valgte aktiverings tiltak (diskutert i trinn 5,4). Trykk på aktiveringspunkter for å gjengi en 3D-representasjon av aktiverings kartet. Den multi-vektor Lednings hastighet målemetode romlig segmenter isochronal kartet i regioner av n x n piksler. Angi verdien for n ved å bruke den lokale vindusstørrelsen input, og angi intervallet av aktiverings tider til å bruke analyse til å bruke tilpasnings aktiverings ganger innganger.Merk: for hver lokal region er en polynom overflate, f, montert som best beskriver forholdet mellom aktiveringstid og romlig posisjon, (x,y). Den gradient vektor, CVLocal, av denne overflaten er da beregnet som:1der betegner den todimensjonale kartesiske romlige differensial operatør26. For hver piksel i isochronal kartet, en lokal vektor som representerer hastighet og retning av Lednings ledning er beregnet. Velg Isochronal kart med vektorer fra rullegardinmenyen for å vise denne analysen. SNR beregnes som forholdet mellom maksimal amplitude sammenlignet med standardavviket for signalet ved Baseline. Denne analysen er utført postere alle behandlingstrinn. Trykk på SNR-beregning i toppmenyen for å redigere innstillinger for perioden for signalet som er definert som opprinnelig plan. 6. Lednings analyse modul Trykk ledning for å få tilgang til mer detaljert analyse av Lednings hastighet. Dette åpner en egen modul der ledningsnett kan kvantifisert ved hjelp av Bayly multi-vektor metode som i de viktigste grensesnittet, enkelt vektor metoder, og som en aktiverings kurve. Trykk på single Vector for å analysere ledning ved hjelp av enkel vektor-metoden, der CV beregnes fra forsinkelsen i aktiveringstiden mellom to punkter. Dette kan gjøres ved hjelp av automatiske eller manuelle metoder, valgbar under enkelt Vector knappen. For automatisk enkel vektor metode, Velg en avstand og startpunkt for å måle ledning. Programvaren vil da utføre en 360-graders sveip fra det valgte punktet, måle tidsforsinkelsen og beregne tilhørende Lednings hastighet langs alle retninger i 1-graders intervaller. Resultatene av denne analysen vises i grafen ved siden av kartet, og retningen av tregeste ledning er vist i rødt. For manuell enkel vektor metode, velge både en start-og sluttpunkt fra isochronal kartet for å beregne Lednings hastighet. Hvis du vil velge et nytt startpunkt, trykker du Tøm startpunkt. Trykk Local Vector å bruke multi vektor metoden, med innstillingene samsvarer med de fra de viktigste grensesnittet. Innenfor Lednings-modulen, fordelingen av Lednings hastighet, samt kantete fordeling av beregnede vektorer og kantete avhengighet av Lednings hastighet kan vises. Presse aktivisering kurven å plotte prosenten av tissue aktivert som funksjonen av tid. Tid til 100% aktivering vises automatisk, mens egendefinerte verdier for minimum (blå) og maksimum (rød) aktiverings prosenter mellom å måle kan også velges. 7. ytterligere analyser og moduler Bortsett fra automatisk utførte varighet og gjennomføring hastighet analyser, kan flere andre parametre være kvantifisert hjelp ElectroMap. Disse analysene kan velges fra rullegardinmenyen over visnings kartet. Velg ett av disse alternativene for å utføre analysen, og resultatene vil vises i 4th -raden i resultattabellen: 1) diastolisk intervall -tid fra 90% repolarisasjon til aktiveringstiden for neste handling potensial; 2) dominerende frekvens -frekvensspekteret av hver piksel er beregnet ved hjelp av rask Fourier Transform, og frekvensen med mest makt er definert som den dominerende frekvensen. Avansert rekkevidde-og vindusinnstillinger for dominerende frekvens analyse er tilgjengelig ved å velge frekvens kartlegging; 3) tid til topp – oppstigningstiden mellom to bruker valgte prosenter (standard 10 til 90%) av den depolarization fasen av handlingen potensial eller frigjøring av kalsium. Prosentverdier kan endres ved å velge ttp innstillinger; og 4) avslapping konstant (τ)-avslapping konstant beregnes ved å montere en mono-eksponentiell forfall av form av skjemaet:2hvor fluorescens nivået på time t er avhengig av peak fluorescens, F0, og den påfølgende forfall (C er en konstant)27. Verdien mellom å passe ligningen 2 er valgbar innenfor de viktigste ElectroMap brukergrensesnitt, samt en godhet av passform ekskludering kriterier basert på r2 verdi. Trykk enkelt filanalyse for å åpne en dedikert modul for høy gjennomstrømming varighet og Lednings analyse av hvert identifiserte segmentet i en fil. Analysen kan utføres på enten hele bildet (varighet, Lednings-og aktiveringstid) eller på utvalgte regioner eller steder av interesse (foreløpig varighet bare). Resultatene er produseres til en CSV-fil.Merk: for APD verdier fra hele bildet, er den første kolonnen i CSV-filen gjennomsnittet, mens den andre kolonnen er standardavviket. Trykk på alternans for å starte en frittstående modul for dedikert analyse og kartlegging av Beat-to-beat-variasjon. Se O ‘ Shea et al. 201913 for mer informasjon om alternans behandlings-og analyse alternativer. Nærmere bestemt er denne modulen utformet for å identifisere to periode svingninger, kjent som alternans. Både varighet og amplitude alternans beregnes og produseres.Merk: varighets alternans måles ved å sammenligne varighets målingen fra en topp til den neste. det vil si at hvis den høyeste en og to og APD1 og APD2 henholdsvis, vil varigheten alternan (ΔAPD) beregnes som3Varighets målingen utføres ved hjelp av innstillingene i det primære grensesnittet. I mellomtiden kan amplitude alternans være kvantifisert og kartlagt på tvers av multi-cellulære forberedelser som absolutt endring (definert som en prosentandel der 0% = samme amplitude mellom en beat og den neste). Videre kan virkningene av fenomener som kalsium belastning bli ytterligere undersøkt ved å måle og sammenligne Last og Release alternans, som tidligere har blitt rapportert28. Hvis L er definert som topp amplitude av store beats (dvs. hvor amplituden er større enn den forrige beat), S amplituden til de små beats, ogD den diastolisk Load av de små beats, utgivelsen alternans ( ) er definert som:4I motsatt fall er Loadalternans () definert som:5Alternans målinger kan gjøres over hele vevet, og resultatene av analysen vises i nedre høyre i modulen. Når du først bruker modulen, analysen utføres på tvers av hele eksperimentelle filen, og resultatene vises er en gjennomsnittlig beat-beat forskjell over hele filen. Imidlertid kan analysen begrenses til bestemte tider i filen ved å velge Hold zoom, zoome inn på en bestemt tidsperiode og velge analyser zoomet seksjon. Dette vil oppdatere resultatpanelet for å vise analyse fra den valgte tidsperioden. Velg spill for å vise en beat-to-beat-video av den alternans analysen. I tillegg kan du velge Opprett gjennomsnittlig kart for å eksportere et kart over alternans virkemåte i gjennomsnitt fra de valgte tids punktene, som er angitt i hurtigmenyen når du bruker denne funksjonen. Trykk på fase kart for å starte fase tilordnings modulen. En Hilbert Transform er utført for å beregne momentant fase (mellom-π og + π) av signalene ved hver timepoint. Trykk på spill av eller dra glidebryteren for å visualisere fase atferden over tid, og klikk på en piksel for å gjengi et fase diagram. 8. eksportere data Data eksporteres fra ElectroMap i en rekke former. Trykk Eksporter verdier for å lagre verdiene for kartet som vises i det primære brukte grensesnittet. Målte verdier kan lagres enten som et kart (bevare pixel plasseringer) eller kondensert inn i en enkelt liste, og kan lagres som. csv,. txt eller. MAT filer. Trykk på Eksporter kart for å få opp en pop-up som inneholder kartet som vises, som deretter kan lagres i en rekke bildeformater. Visningsalternativer for kartet styres ved å velge Kartinnstillinger , men kan også redigeres når eksport kart er valgt. En fargelinje kan for eksempel legges til ved å velge dette ikonet fra toppmenyen, og skalaen kan angis ved å velge rediger > fargekartet. Trykk på Activation video for å gjengi en animasjon av aktiverings sekvensen, som kan lagres som en animert GIF-fil. Trykk på Segment video for å lagre en AVI-videofil av den gjeldende viste parameteren for hvert identifiserte segment.