Ici, nous présentons un protocole eCLIP pour déterminer les principales cibles d’ARN des candidats du RBP dans les testicules.
La spermèse définit un processus hautement ordonné de différenciation des cellules germinales mâles chez les mammifères. Dans le testis, la transcription et la traduction sont découplées, soulignant l’importance de la régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique orchestrée par les RPB. Pour élucider les rôles mécanistes d’un RBP, la méthodologie d’immunopréprécipitation croisée (CLIP) peut être utilisée pour capturer ses cibles d’ARN directes endogènes et définir les sites d’interaction réels. Le CLIP amélioré (eCLIP) est une méthode nouvellement développée qui offre plusieurs avantages par rapport aux CLIPs conventionnels. Cependant, l’utilisation de eCLIP a jusqu’à présent été limitée aux lignées cellulaires, appelant à des applications élargies. Ici, nous avons employé eCLIP pour étudier MOV10 et MOV10L1, deux hélicases connues de liaison d’ARN, dans des testicules de souris. Comme prévu, nous constatons que MOV10 se lie principalement à 3 ‘régions non traduites (UTRs) de mRNA et MOV10L1 se lie sélectivement aux transcriptions des précurseurs de l’ARN en interaction piwi (piRNA). Notre méthode eCLIP permet la détermination rapide des principales espèces d’ARN liées par divers RPB par le séquençage à petite échelle des sous-clones et donc la disponibilité des bibliothèques qualifiées, comme un mandat pour procéder à un séquençage profond. Cette étude établit une base applicable pour eCLIP dans les testicules des mammifères.
Le testicules de mammifères représente un excellent modèle de développement dans lequel un programme complexe de différenciation cellulaire s’exécute cycliquement pour produire de nombreux spermatozoïdes. Une valeur unique de ce modèle réside dans l’émergence de l’inactivation transcriptionnelle à certains stades de la spermèse, typiquement lorsque l’inactivation des chromosomes sexuels méiotiques (MSCI) se produit1,2 et lorsque les spermatides ronds subissent compactage nucléaire drastique pendant la spermiogenèse3. Ces événements transcriptionnels inconsécutifs nécessitent une régulation génique post-transcriptionnelle, dans laquelle les protéines liant l’ARN (RPB) jouent un rôle crucial, formant le transcriptome et conservant la fertilité masculine.
Pour identifier les cibles d’ARN de bonne foi d’un RBP individuel in vivo, la méthode de réticulation par immunoprécipitation (clip) a été développée4,5, basée sur mais au-delà de l’immunopreprécipitation à l’ARN ordinaire (RIP)6,7 , par incorporation d’étapes clés, y compris la réticulation ultraviolette (UV), un transfert de gel et de lavage rigoureux pour améliorer la spécificité du signal. L’application avancée du CLIP combinée à un séquençage à haut débit a suscité un grand intérêt pour le profilage de l’interaction protéine-ARN aux niveaux8de l’ensemble du génome. En plus des études génétiques sur la fonction RBP, ces méthodes biochimiques qui identifient l’interaction directe de la protéine endogène et de l’ARN ont été indispensables pour élucider avec précision les rôles de régulation de l’ARN des RPB. Par exemple, MOV10L1 est une hélicase d’ARN spécifique aux testicules requise pour la fertilité masculine et la biogenèse9de l’ARN en interaction piwi (Pirna). Son paralogue MOV10 est connu comme une hélicase d’ARN façon ubiquitaire exprimée et multifonctionnelle avec des rôles dans de multiples aspects de la biologie de l’ARN10,11,12,13,14 , le 15 , le 16 , le 17 , 18. en employant le clip-SEQ conventionnel, nous avons constaté que MOV10L1 lie et régule les précurseurs de Pirna primaires pour initier le traitement de Pirna précoce19,20, et que MOV10 lie mRNA 3 ‘utrs et aussi bien que l’ARN de non codantes cellules germinales testiculaires (données non illustrées).
Néanmoins, CLIP est à l’origine une procédure laborieuse et radioactive suivie par la préparation de la bibliothèque de séquençage avec une perte remarquable de balises CLIP. Dans le CLIP conventionnel, une bibliothèque d’ADNc est préparée à l’aide d’adaptateurs ligés aux deux extrémités de l’ARN. Après la digestion des protéines, les polypeptides courts réticulé demeurent attachés à des fragments d’ARN. Cette marque de réticulation bloque partiellement la progression de la transcriptase inverse (RTase) pendant la synthèse de l’ADNc, ce qui entraîne des cDNAs tronqués qui représentent environ 80% de la bibliothèque de l’ADNc21,22. Ainsi, seuls les fragments d’ADNc résultant de RTase contournant le site de réticulation (lecture-à travers) sont séquencés. Récemment, diverses approches de CLIP, telles que PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP et uvCLAP, ont été employées pour identifier les sites de Crosslink des RBPs dans les cellules vivantes. PAR-CLIP implique l’application de 365 nm de rayonnement UV et d’analogues de nucléotides photoactivables et est donc exclusif à la culture des cellules vivantes, et l’incorporation d’analogues nucléosidiques dans les transcriptions nouvellement synthétisées est sujette à la production de biais où l’ARN interagit physiquement avec la protéine23,24. Dans iCLIP, un seul adaptateur est ligné à l’extrémité 3 ‘des fragments d’ARN réticulés. Après la transcription inversée (RT), les cDNAs tronqués et lus-through sont obtenus par circularisation intramoléculaire et relinéarisation, puis par amplification de la polymérase en chaîne (PCR)25,26. Cependant, l’efficacité de la circularisation intramoléculaire est relativement faible. Bien que les protocoles CLIP plus anciens ont besoin d’étiquetage de l’ARN réticulé avec un radio-isotopes, la réticulation ultraviolette et la purification d’affinité (uvCLAP), avec un processus de purification d’affinité tandem stricte, ne repose pas sur la radioactivité27. Néanmoins, uvCLAP est limitée aux cellules cultivées qui doivent être transftées avec le vecteur d’expression portant la balise 3x FLAG-HBH pour la purification d’affinité en tandem.
Dans eCLIP, les adaptateurs ont été lignés d’abord à l’extrémité 3 ‘de l’ARN suivie de RT, et ensuite à l’extrémité 3 ‘des cDNAs en mode intermoléculaire. Par conséquent, eCLIP peut capturer tous les cDNA28tronqués et lus. En outre, il n’est ni limité à l’étiquetage radioactif, ni à l’utilisation de lignées cellulaires en fonction de son principe, tout en conservant une résolution mono-nucléotide.
Ici, nous fournissons une description étape par étape d’un protocole eCLIP adapté pour les testicules de souris. Brièvement, ce protocole eCLIP commence par une réticulation UV des tubules testiculaires, suivie d’une digestion partielle de la RNase et d’une immunopréprécipitation à l’aide d’un anticorps spécifique aux protéines. Ensuite, l’ARN lié aux protéines est déphosphorylé, et l’adaptateur est ligné à son extrémité 3 ‘. Après l’électrophorèse sur gel protéique et le transfert gel-membrane, l’ARN est isolé en coupant la zone membranaire d’une fourchette de taille attendue. Après RT, l’adaptateur d’ADN est ligné à l’extrémité 3 ‘de l’ADNc suivi de l’amplification par PCR. Le filtrage des sous-clones avant le séquençage à haut débit est considéré comme un contrôle de qualité de bibliothèque. Ce protocole est efficace pour identifier les principales espèces d’ARN lié aux protéines des RPB, illustré par les deux hélicases d’ARN exprimant le testif MOV10L1 et MOV10.
Avec une meilleure compréhension du rôle universel des RPB dans les contextes biologiques et pathologiques, les méthodes d’agrafe ont été largement utilisées pour révéler la fonction moléculaire du rbps20,32,33, 34,35. Le protocole décrit ici représente une application adaptée de la méthode eCLIP à la souris testis.
<p class="jove_content"…The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Eric L Van Nostrand et Gene W Yeo pour les conseils utiles avec le protocole original. K.Z. a été appuyé par le programme national clé R & D de la Chine (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), et la Fondation nationale des sciences naturelles de la Chine (31771653). L.Y. a été soutenu par la National Natural Science Foundation de la Chine (81471502, 31871503) et le programme novateur et entrepreneurial de la province de Jiangsu.
Antibodies | |||
Anti-mouse MOV10 antibody | Proteintech, China | 10370-1-AP | |
Anti-mouse MOV10L1 antibody | Zheng et al.20109 | polyclonal antisera UP2175 | provided by P. Jeremy Wang lab(University of Pennsylvania) |
HRP Goat Anti-Rabbit IgG | ABclonal | AS014 | |
Rabbit IgG | Beyotime, China | A7016 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242R | |
Digital sonifier | BRANSON,USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen,USA | 12321D | |
Mini Blot Module | Invitrogen,USA | B1000 | |
Mini Gel Tank | Invitrogen,USA | A25977 | |
Shaking incubator | Eppendorf, Hamburg, Germany | Thermomixer comfort | |
Tissue Grinder, Dounce | PYREX, USA | 1234F35 | only the "loose" pestle is used in this protocol |
TProfessional standard 96 Gradient | Biometra, Germany | serial no.: 2604323 | |
Tube Revolver | Crystal, USA | serial no.: 3406051 | |
UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
Materials | |||
TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
Microtubes tubes | AXYGEN , USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
Reagents | |||
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol | Solarbio, China | P1011 | 25:24:01 |
AffinityScript Enzyme | Agilent, USA | 600107 | |
Antioxidant | Invitrogen,USA | NP0005 | |
DH5α competent bacteria | Thermo Scientific, USA | 18265017 | these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction. |
DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D8418 | |
DNA Ladder | Invitrogen, USA | 10416014 | |
dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
Dynabeads Protein A | Invitrogen, USA | 10002D | |
ECL reagent | Vazyme, China | E411-04 | |
EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | |
EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | add fresh |
Exo-SAP-IT | Affymetrix, USA | 78201 | PCR Product Cleanup Reagent |
FastAP enzyme | Thermo Scientific, USA | EF0652 | |
LDS Sample Buffer | Thermo Scientific, USA | NP0007 | |
MetaPhor Agarose | lonza, Switzerland | 50180 | |
MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | |
MiniElute gel Extraction | QIAGEN, Germany | 28604 | column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14) |
MyONE Silane beads | Thermo Scientific, USA | 37002D | nucleic acids extraction magnetic beads |
NaCl | Invitrogen,USA | AM9759 |
|
NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen, USA | NP0336BOX | 4%–12%,1.5 mm, 15-well |
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit | Invitrogen, USA | NP0050 | |
PBS | Gibco, USA | 10010023 | |
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube | TIANGEN, China | WM5-2302831 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems, USA | A25742 | |
proteinase K | NEB, New England | P8107S | |
Q5 PCR master mix | NEB, New England | M0492L | |
RLT buffer | QIAGEN, Germany | 79216 | RNA purification lysis buffer |
RNA Clean & Concentrator-5 columns | ZYMO RESEARCH, USA | R1016 | RNA purification and concentration columns |
RNase I | Invitrogen, USA | AM2295 | |
RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
RQ1 DNase | Promega,USA | M610A | |
Sample Reducing Agent | Invitrogen,USA | NP0009 | |
SDS Solution | Invitrogen, USA | 15553027 | 10% |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich, USA | 30970 | protect from light |
T4 PNK enzyme | NEB, New England | M0201L | |
T4 RNA ligase 1 high conc | NEB, New England | M0437M | |
TA/Blunt-Zero Cloning Mix | Vazyme, China | C601-01 | |
TBE | Invitrogen,USA | AM9863 | |
Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | |
Triton X-100 | Sangon Biotech, China | A600198 | |
Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 | |
Urea | Sigma-Aldrich, USA | U5378 | |
X-ray Films | Caresteam, Canada | 6535876 |