Hier stellen wir ein eCLIP-Protokoll vor, um die wichtigsten RNA-Ziele von RBP-Kandidaten in Hoden zu ermitteln.
Die Spermatogenese definiert einen sehr geordneten Prozess der männlichen Keimzelldifferenzierung bei Säugetieren. In den meisten Hoden werden Transkriptionen und Übersetzungen entkoppelt, was die Bedeutung der nachträglichen Regulierung der von RBPs orchestrierten Genexpression unterstreicht. Um die mechanistische Rolle eines RBP zu erklären, kann die Vernetzung der Immunop-(CLIP)-Methodik verwendet werden, um die endogenen direkten RNA-Ziele zu erfassen und die tatsächlichen Interaktionsorte zu definieren. Das erweiterte CLIP (eCLIP) ist ein neu entwickeltes Verfahren, das gegenüber den herkömmlichen CLIPs mehrere Vorteile bietet. Allerdings ist die Nutzung von eCLIP bisher auf Zelllinien beschränkt, was erweiterte Anwendungen fordert. Hier haben wir eCLIP eingesetzt, um MOV10 und MOV10L1, zwei bekannte RNA-bindende Helicases, in Mäusehden zu studieren. Wie zu erwarten, stellen wir fest, dass MOV10 überwiegend an 3 ‘ nicht übersetzte Regionen (UTRs) von mRNA und MOV10L1 selektiv an Piwi-interagierende RNA (piRNA) Vorläuferprotokolle bindet. Unsere eCLIP-Methode ermöglicht die schnelle Bestimmung von großen RNA-Arten, die durch verschiedene RBPs durch kleine Sequenzierung von Subklonen und damit die Verfügbarkeit von qualifizierten Bibliotheken gebunden sind, als Garantie für die Durchführung einer tiefen Sequenzierung. Diese Studie schafft eine anwendbare Grundlage für eCLIP in Säugetierhauszeugen.
Mammalian testis stellt ein hervorragendes Entwicklungsmodell dar, bei dem ein kompliziertes Zelldifferenzierungsprogramm zyklisch läuft, um zahlreiche Spermien zu erzeugen. Ein einzigartiger Wert dieses Modells liegt in der Entstehung der transkriptionalen Inaktivierung in bestimmten Stadien der Spermatogenese, typischerweise wenn die meiotische Geschlechtchromosome-Inaktivierung (MSCI) 1, 2 auftritt und wenn runde Spermien sich unterziehen. Drastische nukleare Verdichtungwährendder Spermiogenese 3. Diese inkonsekutiven transkriptionalen Ereignisse erfordern eine posttranskriptionale Genregulation, bei der RNA-bindende Proteine (RBPs) eine entscheidende Rolle spielen, die Transkriptome prägen und die männliche Fruchtbarkeit erhalten.
Um die echten RNA-Ziele eines einzelnen RBP in vivo zu identifizieren, wurde die vernetzte Immunop-(CLIP) Methode mit 4,5 entwickelt, basierendauf dem regulären RNA-Immunsystem (RIP)6,7 , durch die Einfügung von Schlüsselschritten, einschließlich der ultravioletten (UV) Vernetzung, strenger Wasch-und Gelübertragung, um die Signalspezifik zu verbessern. Die fortschrittliche Anwendung des CLIP in Kombination mit einer Hochdurchsatzsequenzierung hat großes Interesse an der Profi-Protein-RNA-Interaktion auf genomweiten Ebenen8geweckt. Zusätzlich zu genetischen Studien zur RBP-Funktion waren solche biochemischen Methoden, die das direkte Zusammenspiel von endogenem Protein und RNA identifizieren, unverzichtbar, um die RNA-regulatorische Rolle von RBPs genau zu erklären. MOV10L1 ist zum Beispiel eine weitenspezifische RNA-Helicase, die für die männliche Fruchtbarkeit und die Piwi-interagierende RNA (piRNA) Biogenese 9 benötigt wird. Sein paralogue MOV10 ist bekannt als allgegenwärtig ausgedrückte und multifunktionale RNA-HelicasemitRollen in verschiedenen Aspekten der RNA-Biologie 10,11, 12,13 ,14 , 15 , 16 , 17 , 18. Durch den Einsatz der herkömmlichen CLIP-seq, fanden wir, dass MOV10L1 bindet und reguliert primäre PiRNA-Vorläufer, um frühe piRNA-Verarbeitung19,20zu initiieren, und dass MOV10 mRNA 3 ‘ UTRs und sowie nicht-coding RNA Arten in Hodenkeimzellen (Daten nicht abgebildet).
Dennoch ist CLIP ursprünglich ein mühsames, radioaktives Verfahren, gefolgt von der Sequenzierung der Bibliotheksvorbereitung mit einem bemerkenswerten Verlust von CLIP-Tags. In der herkömmlichen CLIP wird eine cDNA-Bibliothek mit Adaptern vorbereitet, die an beiden RNA-Extremitäten ligiert sind. Nach der Proteinverdauung bleiben vernetzte kurze Polypeptide an RNA-Fragmenten befestigt. Diese Vernetzungsmarke blockiert die Reverse Transkriptase (RTase) während der cDNA-Synthese teilweise, was zu verkürzten cDNAs führt, die etwa 80%der cDNA-Bibliothek21,22ausmachen. So werden nur cDNA-Fragmente sequenziert, die aus RTase resultieren, die die Vernetzungsstelle umgehen (Durchlesen). In jüngster Zeit wurden verschiedene CLIP-Ansätze wie PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP und uvCLAP eingesetzt, um Querlink-Standorte von RBPs in lebenden Zellen zu identifizieren. PAR-CLIP beinhaltet die Anwendung von 365 nm UV-Strahlung und photoaktivierbaren Nukleotid-Analogen und ist daher ausschließlich für die In-kulturierende lebende Zellen, und die Einbindung von Nukleosid-Analogen in neu synthetisierte Transkripte ist anfällig für die Produktion von Bias Dort, wo die RNA physischmit dem Protein 23,24interagiert. In iCLIP wird nur ein einziger Adapter an die 3 ‘ Extremität der vernetzten RNA-Fragmente gekoppelt. Nach der umgekehrten Transkription (RT) werden sowohl verkürzte als auch durchlässige cDNAs durch intramolekulare Zirkularisierung und Re-Linearisierung erreicht, gefolgt von einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die 25,26verstärkt. Die Effizienz der intramolekularen Kreislaufisierung ist jedoch relativ gering. Obwohl ältere CLIP-Protokolle eine Kennzeichnung der vernetzten RNA mit einem Radioisotop benötigen, setzt die ultraviolette Vernetzung und Affinitätsreinigung (uvCLAP) bei einem Prozess der strengen Tandemaffinitätsreinigung nicht auf Radioaktivität 27. Dennoch beschränkt sich uvCLAP auf kultivierte Zellen, die mit dem Expressionsvektor, der das 3x FLAG-HBH-Tag zur Tandemaffinitätsreinigung trägt, transferiert werden müssen.
In eCLIP wurden Adapter zuerst an der 3 ‘ Extremität der RNA, gefolgt von RT, und als nächstes an der 3 ‘ Extremität von cDNAs in einem intermolekularen Modus. Damit ist eCLIP in der Lage, alle abgeschnittenen und durchlasen cDNA28zu erfassen. Außerdem beschränkt sie sich weder auf die radioaktive Kennzeichnung, noch auf die Verwendung von Zelllinien nach ihrem Prinzip, während die Auflösung von Nukleotiden beibehalten wird.
Hier finden Sie eine schrittweise Beschreibung eines eCLIP-Protokolls, das für den Mäusehausamser angepasst ist. Kurz gesagt, dieses eCLIP-Protokoll beginnt mit der UV-Vernetzung von Hodenröhrungen, gefolgt von einer teilweisen RNase-Verdauung und Immuntherapie mit einem proteinspezifischen Antikörper. Als nächstes wird die proteingebundene RNA dephosphoryliert, und der Adapter wird bis zu seinem 3 ‘ Ende ligiert. Nach der Protein-Gel-Elektrophorese und der Gel-zu-Membran-Übertragung wird die RNA durch das Schneiden der Membranfläche eines erwarteten Größenbereiches isoliert. Nach RT wird der DNA-Adapter an das 3 ‘ Ende der cDNA ligiert, gefolgt von PCR-Verstärkung. Das Screening von Subklonen vor der Hochdurchsatz-Sequenzierung wird als Qualitätskontrolle der Bibliothek genommen. Dieses Protokoll ist effizient bei der Identifizierung der wichtigsten Arten von proteingebundenen RNA von RBPs, beispielhaft für die beiden Protden-Ausdruck RNA-Helikasen MOV10L1 und MOV10.
Mit zunehmendem Verständnis der universellen Rolle von RBPs unter biologischen und pathologischen Kontexten wurden die CLIP-Methoden weit verbreitet eingesetzt, um die molekulare Funktion der RBPs 20,32,33zu zeigen. 34,35. Das hier beschriebene Protokoll stellt eine angepasste Anwendung der eCLIP-Methode auf Mäusehausweise dar.
E…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Eric L Van Nostrand und Gene W Yeo für die hilfreiche Anleitung mit dem Originalprotokoll. K.Z. wurde unterstützt von National Key R & D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) und der National Natural Science Foundation of China (31771653). L.Y. wurde von der National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) und dem Innovativen und unternehmerischen Programm der Provinz Jiangsu unterstützt.
Antibodies | |||
Anti-mouse MOV10 antibody | Proteintech, China | 10370-1-AP | |
Anti-mouse MOV10L1 antibody | Zheng et al.20109 | polyclonal antisera UP2175 | provided by P. Jeremy Wang lab(University of Pennsylvania) |
HRP Goat Anti-Rabbit IgG | ABclonal | AS014 | |
Rabbit IgG | Beyotime, China | A7016 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242R | |
Digital sonifier | BRANSON,USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen,USA | 12321D | |
Mini Blot Module | Invitrogen,USA | B1000 | |
Mini Gel Tank | Invitrogen,USA | A25977 | |
Shaking incubator | Eppendorf, Hamburg, Germany | Thermomixer comfort | |
Tissue Grinder, Dounce | PYREX, USA | 1234F35 | only the "loose" pestle is used in this protocol |
TProfessional standard 96 Gradient | Biometra, Germany | serial no.: 2604323 | |
Tube Revolver | Crystal, USA | serial no.: 3406051 | |
UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
Materials | |||
TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
Microtubes tubes | AXYGEN , USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
Reagents | |||
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol | Solarbio, China | P1011 | 25:24:01 |
AffinityScript Enzyme | Agilent, USA | 600107 | |
Antioxidant | Invitrogen,USA | NP0005 | |
DH5α competent bacteria | Thermo Scientific, USA | 18265017 | these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction. |
DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D8418 | |
DNA Ladder | Invitrogen, USA | 10416014 | |
dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
Dynabeads Protein A | Invitrogen, USA | 10002D | |
ECL reagent | Vazyme, China | E411-04 | |
EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | |
EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | add fresh |
Exo-SAP-IT | Affymetrix, USA | 78201 | PCR Product Cleanup Reagent |
FastAP enzyme | Thermo Scientific, USA | EF0652 | |
LDS Sample Buffer | Thermo Scientific, USA | NP0007 | |
MetaPhor Agarose | lonza, Switzerland | 50180 | |
MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | |
MiniElute gel Extraction | QIAGEN, Germany | 28604 | column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14) |
MyONE Silane beads | Thermo Scientific, USA | 37002D | nucleic acids extraction magnetic beads |
NaCl | Invitrogen,USA | AM9759 |
|
NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen, USA | NP0336BOX | 4%–12%,1.5 mm, 15-well |
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit | Invitrogen, USA | NP0050 | |
PBS | Gibco, USA | 10010023 | |
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube | TIANGEN, China | WM5-2302831 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems, USA | A25742 | |
proteinase K | NEB, New England | P8107S | |
Q5 PCR master mix | NEB, New England | M0492L | |
RLT buffer | QIAGEN, Germany | 79216 | RNA purification lysis buffer |
RNA Clean & Concentrator-5 columns | ZYMO RESEARCH, USA | R1016 | RNA purification and concentration columns |
RNase I | Invitrogen, USA | AM2295 | |
RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
RQ1 DNase | Promega,USA | M610A | |
Sample Reducing Agent | Invitrogen,USA | NP0009 | |
SDS Solution | Invitrogen, USA | 15553027 | 10% |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich, USA | 30970 | protect from light |
T4 PNK enzyme | NEB, New England | M0201L | |
T4 RNA ligase 1 high conc | NEB, New England | M0437M | |
TA/Blunt-Zero Cloning Mix | Vazyme, China | C601-01 | |
TBE | Invitrogen,USA | AM9863 | |
Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | |
Triton X-100 | Sangon Biotech, China | A600198 | |
Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 | |
Urea | Sigma-Aldrich, USA | U5378 | |
X-ray Films | Caresteam, Canada | 6535876 |