Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Улучшенный перекрестное связывание иммунология (eCLIP) метод эффективной идентификации белка связаны РНК в яичной яичка

doi: 10.3791/59681 Published: May 10, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы представляем протокол eCLIP, чтобы определить основные цели РНК кандидатов RBP в яички.

Abstract

Сперматозогенез определяет весьма упорядо, процесс дифференциации мужских половых клеток у млекопитающих. В семенных цех транскрипция и перевод являются несопряжениями, подчеркивая важность посттранскрипционного регулирования экспрессии генов, организованного РБП. Чтобы разъяснить механистические роли RBP, перекрестно-связывающая иммунологическая (клип) методология может быть использована для захвата его эндогенных прямых целей РНК и определить фактические сайты взаимодействия. Улучшенный клип (eCLIP) является недавно разработанный метод, который предлагает несколько преимуществ по сравнению с обычными клипы. Тем не менее, использование eCLIP до сих пор ограничивается клеточных линий, призывая к расширению приложений. Здесь мы использовали eCLIP для изучения MOV10 и MOV10L1, двух известных РНК-связывающих гелиаз, в яичной мышке. Как и ожидалось, мы находим, что MOV10 в основном связывается с 3 ' непереведенные регионы () мРНК и MOV10L1 выборочно связывается с Пиви-взаимодействующие РНК (piRNA) прекурсоров стенограммы. Наш метод eCLIP позволяет быстро определять основные виды РНК, связанные различными РБП, посредством мелкомасштабной последовательности подклонов и, таким образом, наличия квалифицированных библиотек в качестве ордера для продолжения глубокой секвенирования. Это исследование устанавливает применимое основание для eCLIP в млекопитающих Семенов.

Introduction

Млекопитающего семенника представляет собой отличную модель развития которой сложная программа дифференциации ячейки проходит циклически приносить многочисленные сперматозомы. Уникальное значение этой модели заключается в появлении транскрипционной инактивации на определенных этапах сперматозоиды, как правило, при инактивирования половых хромосом (MSCI), возникающее1,2 и когда круглые сперматиды подвергаются резкое ядерное уплотнение во время спермиогенеза3. Эти непоследовательные транскрипционные события обусловливают необходимость посттранскрипционного гена, в котором РНК-связывающие белки (РБП) играют решающую роль, формируя транскриптом и поддерживая мужскую фертильность.

Для выявления добросовестных целей РНК отдельных РБП в естественных условиях, перекрестные иммунорецидивицион (клип) метод был разработан4,5, на основе, но за пределами регулярных РНК иммуноопципиции (RIP)6,7 , путем включения ключевых шагов, включая ультрафиолетовые (УФ) перекрестки, строгие мытье и гель передачи для улучшения специфики сигнала. Современное применение КЛИПА в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования вызвало большой интерес к профилированию белка-РНК взаимодействия на уровне генома8. В дополнение к генетическим исследованиям по функции RBP, такие биохимические методы, которые определяют прямое взаимодействие эндогенного белка и РНК, были незаменимы для точного прояснению регуляторных ролей РБП. Например, MOV10L1 является семенным специфические РНК гелиазы, необходимые для мужской плодовитости и Пиви-взаимодействующие РНК (piRNA) биогенеза9. Его MOV10 известен как повсеместно выраженный и многофункциональный РНК гелиаза с ролями в нескольких аспектах РНК биологии10,11,12,13,14 , 15 , в 16 лет , 17 , 18. путем использования обычного клипа-Seq, мы обнаружили, что MOV10L1 связывает и регулирует первичные прекурсоров Pirna инициировать раннее Pirna обработки19,20, и что MOV10 связывает мРНК 3 ' и, а также некодирующих РНК видов в зародышевых клетках яичка (данные не показаны).

Тем не менее, клип первоначально трудоемкий, радиоактивные процедуры следуют последовательности подготовки библиотеки с замечательной потерей Теги клип. В обычном клипе, Библиотека cDNA готовится с помощью адаптеров, лигирован на обеих РНК конечностей. После переваривания белка, пересекаемый короткие полипептиды остаются прикрепленными к фрагментам РНК. Это связывание Марк частично блокирует обратную транскриптазы (ритазы) прогрессии во время синтеза кДНК, в результате чего усеченные кдснк, которые составляют около 80% от cDNA библиотека21,22. Таким образом, только фрагменты кДНК, возникающие в результате Ритазы, минуя узел связывания (прочитаны), упорядочены. В последнее время различные подходы клип, такие как пар-клип, Icлипа, Ecлипа и УВВ, были использованы для выявления перекрестных сайтов РБП в живых клетках. ПАР-клип включает в себя применение 365 Нм УФ-излучения и фотоактизационные нуклеотидных аналогов и, следовательно, исключительно в-культивирования живых клеток, и включение аналогов нуклеозидов в недавно синтезированных стенограммы склонен к производству смещения где РНК физически взаимодействует с белком23,24. В iclip, только один адаптер лигирован 3 ' оконечности пересекаемыми РНК фрагментов. После обратной транскрипции (RT), как укороченные, так и просчитаны, получаются интрааминомолекулинно-циркуляризация и реполяризации, сопровождаемая полимеразной цепной реакцией (КЦР) усиление25,26. Однако эффективность внутримолекулярной циркуляризации относительно низка. Хотя более старые протоколы КЛИПА нуждаются в маркировке пересекающей РНК с радиоизотопом, ультрафиолетовым перекрестком и очищением сродства (УВВ), с процессом очищения сродства тандем, не полагается на радиоактивность27. Тем не менее, уввх ограничивается культивируемых клеток, которые должны быть преобразовано с вектором выражения, перевозящих 3x флаг-тег ХБГ для тандем очистки сродства.

В eclip, адаптеры были лигирован сначала на 3 ' оконечности РНК следуют RT, а затем на 3 ' оконечности ДКД в межмолекулярном режиме. Таким образом, eCLIP может захватить все усеченные и прочитаны cDNA28. Кроме того, он не ограничен ни радиоактивными маркировкой, ни использованием клеточных линий, основанных на его принципе, сохраняя при этом однонуклеотидное разрешение.

Здесь мы предоставляем пошаговое описание протокола eCLIP, адаптированного для яички мыши. Кратко, этот протокол eCLIP начинается с УФ-скрещивания тестикулярных канальцев, а затем частичное пищеварение Нрсэ и иммунорецепции с использованием белка-специфического антитела. Далее, связанная с белками РНК является дефосфорилированной, и адаптер линируется к его концу 3. После белка гель электрофорез и гель-мембраны передачи, РНК изолирована путем разрезания мембраны области ожидаемого размера диапазона. После RT, ДНК адаптер лигирован в 3 ' конец cDNA с последующим усилением поцр. Скрининг подклонов до последовательности высокой пропускной способности принимается как контроль качества библиотеки. Этот протокол эффективен при выявлении основных видов белок-привязных РНК РБП, примером которых являются два семенного выражения РНК гелиаз MOV10L1 и MOV10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все выполненные эксперименты на животных были одобрены Комитетом медицинского университета Нанкина. У мужчин C57BL/6 мышей держали под контролем фотопериода и снабжали пищей и водой.

1. сбор тканей и УФ-перекрестки

  1. Эвтаназии 2 взрослых мышей, использующих углекислый газ (CO2) для 1-2 мин или до остановки дыхания. Далее, выполните шейки дислокации на каждой мыши.
  2. Урожай около 100 мг яичек от мышей соответствующего возраста (один взрослый семенников в этом исследовании) для каждого иммунорецепцирования эксперимент, и поместить ткани в ледяной фосфат буферизованные физиологический раствор (PBS).
  3. Осторожно удалите тунику альбузбишай с одной парой щипчиков с тонкой наконечником.
  4. Добавить 3 мл ледяной PBS в ткань шлифовальный станок и и ткани мягкой механической силой с помощью сыпучих стекла Тресл (типа a стеклянный пестом).
    Примечание: Цель этого шага состоит не в том, чтобы лизнуть клетки, а в том, чтобы разобрать ткань. Важно сохранить жизнеспособность и целостность клеток.
  5. Перенесите суспензию ткани в тарелку культуры клеток (диаметром 10 см) и добавьте ледяной PBS до 6 мл.
  6. Встряхнуть пластины быстро, так что жидкость покрывает дно блюдо равномерно. Если ткань заземлу правильно, равномерно распределенные семенные канальцы будут видны, а наличие тканевых сгустков указывает на то, что дисперсия тканей является субоптимальным.
  7. Перекрестное подвеска три раза с 400 МЮ/cm2 на 254 Нм на льду. Смешайте подвеску между каждым облучением.
    Примечание: Для каждого нового эксперимента, перекрестссылок должны быть оптимизированы.
  8. Соберите подвеску в 15 мл конической трубки и гранул на 1 200 x g в течение 5 минут при температуре 4 °c. Удалите supernatant, ресуспензируем гранулы в 1 мл PBS, а затем перенести подвеску к трубе центрифуги 1,5 мл. Спина при температуре 4 ° с и 1 000 x g для 2 мин, и удалить supernatant.
  9. На данный момент, немедленно приступить к остальной части протокола, или оснастки заморозить гранулы в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° c до использования.

2. бусины подготовка

  1. Добавить 125 мкл белка магнитный бисер на образец (гранулы) к свежей трубки центрифуги.
    Примечание: Используйте белок G магнитные Бусины для антител мыши.
  2. Поместите трубку на магнит, чтобы отделить бисер от раствора. После 10 с, удалите supernatant. Промыть бисер дважды с 1 мл льда-холодный буфер лизиса.
    Примечание: Последующее разделение белка магнитная бусинки следует за этим шагом. Лизиза буфер состав 50 mM рис-совместимого, pH 7,5; 100 мм надл; 1% НП-40; 0,1% СДВ; 0,5% дезоксихетные натрия; 1/50 этилендиаминететрацететическая кислота (ЭДТА)-бесплатный ингибитор протеазы коктейль (добавить свежие).
  3. Ресуспензируем бусины в 100 мкл холодного лизиса с 10 мкг антитела eCLIP. Вращать трубы при комнатной температуре в течение 45 мин.
    Примечание: Окончательная концентрация антител при иммунорецепции составляет 10 мкг/мл. Если концентрация антител неизвестна, то количество антитела должно быть оптимизировано.
  4. Промыть бисер дважды с 1 мл льда-холодный буфер лизиса.

3. лизиса тканей и частичное пищеварение РНК

  1. Гранулы ресуспензируем ткани в 1 мл буфера для холодного лизиса (добавьте 22 мкл из 50x (ЭДТА)-свободный протеиновый ингибитор и 11 мкл ингибитора Ннсэ до 1 мл буфера лизиса).
    1. Ресуспензируем два УФ-перекрестные гранулы и два непересекасвязанных гранул на группу экспериментов: УФ-перекрестные-1 гранулы для библиотеки eCLIP (УФ-1); УФ-Кросс-2 гранулы для библиотеки eCLIP (УФ-2); не пересекая-1 гранулы для библиотеки eCLIP в качестве элемента управления (не УФ); не пересекая-2 гранулы для IgG IP, чтобы продемонстрировать специфику антител.
      Примечание: идеальный контроль для eCLIP библиотека УФ-перекрестных широких типа яичках является то, что из УФ-перекрестно-поперечный нокаут яички от мышей же помет.
  2. Держите липеть образцы на льду в течение 15 мин (для предотвращения деградации белка и РНК).
  3. Sonicate в цифровой sonicate на 10% амплитуды в течение 5 минут, в 30 s на/30 s выкл. Всегда Поместите образец на лед и очистите зонд с Нуклеаза-свободной водой между каждым образцом.
  4. Добавьте 4 мкл Днase в каждую трубу и хорошо перемешайте. Инкубировать в течение 10 минут при температуре 37 ° c, встряхивая 1 200 оборотов в минуту.
  5. Добавить 10 мкл разбавленной Нrase I (4 U/мкл Ннсэ I в PBS), и хорошо перемешать. Инкубировать в течение 5 минут при температуре 37 ° c, встряхивая 1 200 оборотов в минуту.
  6. Очистить lyнасыт с помощью центрифугирования при температуре 15 000 x g в течение 20 мин (при температуре 4 °c).
  7. Аккуратно Соберите супернатант. Оставьте 50 мкл lyнасыт и выбросите его с собой.
  8. Сохранить входы образцов, как РРБ (баллотироваться на Вестерн-блот) и RRI (баллотироваться на РНК изоляции). Сэкономьте 20 мкл (2%) УФ-1, УФ-2, non-УФ и IgG образцов в качестве входных данных для загрузки геля РВ. Сэкономьте 20 мкл (2%) УФ-1 или УФ-2 образцов в качестве входных данных для погрузки геля RRI.

4. иммунореспевитация

  1. Добавьте 1 мл лисейта (от шага 3,7) к бисеру (готовится в разделе 2) и поверните пробы при температуре 4 °C в течение 2 ч или на ночь.
  2. Соберите шарики с магнитной подставка и отбросить supernatant. Промыть бисер дважды с 900 мкл высокой соли буфер (50 mM рис-совместимого, pH 7,5; 1 м нав; 1 мм ЭДТА; 1% НП-40; 0,1% СДД; 0,5% деоксицетные натрия), а затем промыть бисер дважды с 900 мкл мытья буфера (20 мм рис-совместимого, pH 7,5; 10 мм MgCl2; 0,2% между-20).
    Примечание: Для образца IgG, приостановить процедуру здесь и хранить на льду в буфер стирки.
  3. Промыть бисер один раз с 500 мкл 1x дефосфорилирования буфер (10 мм рис-совместимого, pH 7,5; 5 мм MgCl2; 100 mm kcl; 0,02% Тритон X-100).

5. дефосфорилирование РНК 3 ' концы

  1. Соберите шарики с магнитной подставка и отбросить supernatant. Удалите остаточную жидкость с помощью тонкой пипетки советы. Добавить 100 мкл дефосфорилирования мастер смеси (10 мкл 10x буфер дефосфорилирования [100 mM рис-совместимого, pH 8,0; 50 mM MgCl2; 1 M kcl; 0,2% Тритон X-100; 1 мг/мл сывороточного альбумина (БСА)]; 78 мкл из ядер-свободной воды; 2 мкл ингибитора Ннсэ; 2 мкл дназы; 8 мкл Аль Kaline фосфатазы) к каждому образцу, и инкубировать в течение 15 минут при температуре 37 ° c, встряхивая при 1 200 оборотов в минуту.
  2. Добавить 300 мкл полинуклеотидной киназы (НПК) Мастер микс (60 мкл из 5x НПК pH 6,5 буфер [350 mM рис-совместимого, pH 6,5; 50 mM MgCl2]; 223 мкл Нуклеаза-Свободная вода; ингибитор 5 мкл нрсэ; 2 мкл дназы; 7 мкКл фермента НПК; 3 мккл 0,1 м дитиотритатол) к каждому образцу , инкубировать в течение 20 минут при температуре 37 ° c, встряхивая при 1 200 оборотов в минуту.
  3. Соберите шарики с магнитной подставка и отбросить supernatant. Вымойте бисер один раз с 500 мкл холодного мытья буфера. Затем промыть бисером один раз с 500 мкл холодного высокого буфера соли. Повторите эти моет еще раз в этом порядке.
  4. Мытье бисером один раз с 500 мкл холодного мытья буфера, а затем дважды с 300 мкл холодного 1x буфер перевязки (без dithiothreitol, 50 mM ТРС-совместимого, pH 7,5; 10 мм MgCl2).

6. перевязки адаптеров РНК 3 ' концы

  1. Выбросьте supernatant, и удалите остаточную жидкость с тонкой пипетки советы. Добавить 25 мкл 3 ' перевязки мастер смеси для каждого образца. Тщательно перемешайте, петтинг. Этот шаг склонен к производству пузырьков.
    Примечание: Смесь мастер перешнуровки содержит 3 мкл 10x буфер перевязки [500 mM рис-совместимого, pH 7,5; 100 mM MgCl2]; 9 мкл воды, свободной от нуклеазы; 0,4 мкл ингибитора Ннсэ; 0,3 мкл 0,1 м ATP; 0,8 мкл диметилсульфиса (ДМСО); 9 мкл 50% Полиэтиленгликоль (ПЭГ) 8000; 2,5 мкл РНК-лигазы [30 U/мкл].
  2. Добавьте 2,5 МКН адаптера РНК X1A (Таблица 1) и 2,5 мкл адаптера X1B (Таблица 1) к каждому образцу. Тщательно перемешать, петтинг или стряхивая, и инкубировать для 75 мин при температуре 25 ° c, щелкая смешать каждые 10 мин.
  3. Вымойте бисер один раз с 500 мкл холодного мытья буфера (возобновить IgG образец здесь).
  4. Вымойте бисер один раз с 500 мкл холодного высокого буфера соли, а затем с 500 мкл холодного мытья буфера. Повторите эти моет еще раз.
  5. Магнитно отдельные бусы, и удалить остаточную жидкость с тонкой пипетки советы.
  6. Ресуспензируем шарики в 100 мкл холодного мытья буфера (пауза IgG образца здесь и хранить на льду в мытье буфера). Перемещение 20 мкл в новые трубы в качестве образцов РРБ. Магнитно отделить оставшиеся 80 мкл в качестве образцов RRI. Удалите супернатант образцов RRI и ресуспензируем шарики в 20 мкл буфера мытья.
  7. Добавить 37,5 мкл 4-х лития додепилсульфата (СПД) образец буфера и 15 мкл из 10x образец сокращения агента IgG образца. Добавьте 7,5 Мкl 4-х образцов буфера СПД и 3 мкл образца 10x, восстановителя для (оставшихся) образцов. (Не смешивайте по пипетит). Инкубировать в течение 10 минут при температуре 70 ° c, встряхивая 1 200 оборотов в минуту. Cool на льду в течение 1 мин, и центрифуга на 1 000 x g для 1 мин при температуре 4 °c.

7. СДВ-страница и мембранная передача

  1. Нагружайте гели.
    1. Для геля RRI (4-12% белково-протеинового геля, 10-well, 1,5 мм) поместите трубы на магнит и отдельный белковый элюсат из бисера. Загрузите 30 мкл образца в колодец. Образцы расположены на расстоянии предварительно окрашенных белка размер маркера.
    2. Для геля РРБ (4-12% белково-протеинового геля, 10-well, 1,5 мм) поместите трубы на магнит и отдельный белковый элюсат из бисера. Загрузите 15 мкл образца в колодец. Сохраните оставшиеся образцы при температуре-20 ° с в качестве резервных копий.
  2. Добавьте 500 мкл антиоксиданта до 500 мл бегуна в буфере 1x. Запустите на 200 V в 1x СДБ работает буфер для 50 мин или до красителя фронт находится на дне.
    Примечание: Антиоксидант содержит N, N-Диметилформимид, бисульфит натрия, который мигрирует с уменьшением белков для предотвращения повторного окисления чувствительных аминокислот, таких как метионин и триптофан.
  3. Перенос белково-РНК комплексов из геля в нитроцеллюлозную мембрану при температуре 10 V за 70 мин в буфере 1xtransfer с 10% метанолом (том/том). Промыть мембраны RRI в холодном PBS, оберните его в полиэтиленовой пленкой, и хранить при температуре-80 ° c.
  4. Блокировать мембрану РРБ в 5% молока в ТБСТ при комнатной температуре в течение 1 ч. промыть мембрану в ТБСТ. Инкубировать с первичным антителом в ТБСТ при 4 °C за ночь. Вымойте дважды с ТБСТ для 5 мин. инкубировать с вторичным антителом (1:5000 HRP козочка анти-кролик IgG) в ТБСТ при комнатной температуре в течение 1 ч. Вымойте три раза с ТБСТ для 5 мин, 10 мин и 15 мин, соответственно.
  5. Смешайте равные объемы электрохемилюлюминесценции (ECL) буфер а и буфер B, добавить в мембрану и инкубировать в течение 1 мин. Обложка мембраны с пластиковой пленкой, и подвергать его рентгеновской пленки при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Затем разработайте фильм.
    Примечание: Пленка с передержкой ясно покажет форму краев мембраны, которой пленку можно выровняли назад к мембране РРБ. Затем выравнивают мембраны РВБ и РРИ на основе позиций маркеров в нем. Слоистые в порядке снизу вверх являются пленки, мембрана РРБ и мембраны RRI в последовательности.

8. РНК изоляция

  1. Вырежьте область от белковой полосы до 75 kDa (около 220 NT РНК) над ним, используя мембрану и пленку РРБ в качестве гидов.
    Примечание: Как белок-защищенное РНК молекула может иметь максимальную длину 225 баз, около 340 Da на базу, разумно сократить область около 75 kDa над группой RBP, чтобы получить все белково-РНК комплексов.
  2. Вырезать иссеченные кусок мембраны в несколько небольших ломтиков, и поместить их в свежем 1,5 мл трубки центрифуги. Добавить 200 мкл протеинезы K (ПК) буфер (100 mM ЭТС-совместимого 7,5; 50 mM Нав; 10 мм ЭДТА) с 40 мкл ПК к мембране штук. Смешайте и инкубировать в течение 20 минут при температуре 37 ° c, встряхивая при 1 200 оборотов в минуту.
  3. Добавить 200 мкл ПК мочевины буфер (100 mM рис-совместимого рН 7,4; 50 mM Нав; 10 мм ЭДТА; 7 м мочевины) для каждого образца. Инкубировать для 20 мин при температуре 37 ° c, встряхивая при 1 200 оборотов в минуту.
  4. Добавить 400 мкл кислотного фенола/хлороформа/изоамиловый спирт (25:24:1), хорошо перемешать и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° c, встряхивая при 1 200 оборотов в минуту.
  5. Поместите 2 mL фазы замка геля (PLG) тяжелую трубку в центрифуге и спина на 15 000 x g для 25 s.
  6. Перенесите все содержимое, кроме фрагментов мембраны, в тяжелую трубку PLG. Инкубировать в течение 5 минут при температуре 37 ° c, встряхивая 1 200 оборотов в минуту.
  7. Вращение при комнатной температуре и 15 000 x g в течение 15 мин. перенести водный слой в новую 15 мл конической трубки.
  8. Используйте столбцы для очищения и концентрации РНК для извлечения РНК.
    1. Добавьте 2 тома (800 мкл) буфера привязки РНК к каждому образцу (от шага 8,7) и смешайте. Добавьте равный объем (1200 мкл) 100% этанола и смеси.
    2. Передача 750 мкл образца (от шага 8.8.1) к РНК очистки и концентрации столбцов в коллекционном трубке и центрифуге при 15 000 x g для 30 с. Выбросьте поток-через.
    3. Повторите шаг 8.8.2, пока все образцы не будут переданы через столбец. Добавьте 400 мкл буфера подготовки РНК к колонне и центрифуге в 15 000 x g для 30 с. Сброс потока, применить 700 мкл из буфера мытья РНК и центрифуга колонке на 15 000 x g для 30 с. Сброс потока через.
    4. Добавить 400 мкл РНК мыть буфер в колонке и центрифуги на 15 000 x g для 2 мин. перенести колонку тщательно в новую трубку 1,5 ml. Добавить 10 мкл Нуклеаза-свободной воды в колонке матрицы, пусть сидят в течение 2 минут, и центрифуга на 15 000 x g для 30 с. хранить образцы eclip на-80 ° c до RT (шаг 11,1).

9. дефосфорилирование входного РНК 3 ' концы

  1. Добавьте 15 мкл мастер смеси дефосфорилирования (2,5 мкл 10x буфер дефосфорилирования [100 mM рис-совместимого, pH 8,0; 50 mM MgCl2; 1 M kcl; 0,2% Тритон X-100; 1 мг/мл БСА]; 9,5 мкл из ядер-свободной воды; 0,5 мкл ингибитора НКРЭ; 2,5 мкл щелочной фосфатазы) до 10 мкл входные образцы (от Step 8.8.4). Инкубировать в течение 15 минут при температуре 37 ° c, встряхивая 1 200 оборотов в минуту.
  2. Добавить 75 мкл от Мастер микс НПК (20 мкл из 5x НПК PH 6,5 буфер [350 mM рис-совместимого, pH 6,5; 50 mM MgCl2]; 44 мкл Нуклеаза-свободной воды; 1 мкл ингибитора нрсэ; 2 мкл дназы; 7 мкКл фермента НПК; 1 мккл 0,1 м дитиотритал) к образцам. Инкубировать для 20 мин при температуре 37 ° c, встряхивая при 1 200 оборотов в минуту.
  3. Очистка входного РНК
    1. Ресуспензируем енуклеиновой кислоты экстракции магнитного бибисин флакон (вихрь для более чем 30 s). Добавьте 20 мкл нуклеиновых кислот извлечения магнитных бусин для каждого образца в новые трубы. Соберите шарики с магнитной подставка и отбросить supernatant.
    2. Промывать бисер один раз с 1 мл РНК-лизиса очистки буфера (RLT буфер). Поместите трубку на магнит в течение 30-х годов и выбросите супернатант.
      Примечание: Последующее разделение нуклеиновых кислот извлечения магнитных бусин последовал этот шаг.
    3. Ресуспензируем бусы с 300 мкл из RLT буфер и добавить в образец. Добавьте 10 мкл 5 м нав и 615 мкл 100% этилового спирта (этох) и смешайте с помощью пипетин. Вращайте при комнатной температуре в течение 15 мин. магнитно отделить бисер и удалить supernatant.
    4. Ресуспензируем бусины в 1 мл 75% от Этон и Трансфер в новую трубку. После 30-х годов, собирать шарики с магнитной подставка и отбросить supernatant. Мыть дважды с 75% Этон, магнитно отдельные бусы, и отказаться от остаточной жидкости с тонкой пипетки советы. Воздух сухой в течение 5 мин (Избегайте чрезмерного высыхания).
    5. Ресуспензируем бисер с 10 мкл Нуклеаза-свободной воды и инкубировать его в течение 5 мин. магнитно отдельных шариков, и переместить 5 мкл супернатант на новую трубку (для 3 ' адаптер перевязки ниже). Оставшаяся РНК может храниться в-80 ° c в качестве резервных копий.

10. перевязки адаптеров РНК для ввода РНК 3 ' концы

  1. Добавьте 1,5 МКН ДМСО и 0,5 мкл адаптера RiL19 (Таблица 1) до 5 мкл входной РНК (из 9.3.5 шага), Инкубируйте в течение 2 минут при 65 °c и положите на лед более 1 мин. Добавить 13,5 мкл 3 ' перевязки Мастер микс для каждого образца , смешать с петтинг, и инкубировать для 75 мин при температуре 25 ° c, с щелкая смешать каждые 15 мин.
    Примечание: Перешнуровка Мастер микс содержит 2 мкл из 10x перевязки буфер [500 mM ТРС-совместимого, pH 7,5; 100 mM MgCl2; 10 мм дитиотритатол]; 1,5 мкл воды, свободной от нуклеазы; 0,2 мкл ингибитора Ннсэ; 0,2 мкл 0,1 м ATP; 0,3 мкл ДМСО; 8 мкл 50% PEG8000; 1,3 мкл РНК-лигазы [30 U/мкл].
  2. Очистка лигирован входного РНК
    1. Магнитно отдельных 20 мкл нуклеиновых кислот извлечения магнитных бусин для каждого образца, и удалить supernatant. Мытье бисером один раз с 1 мл RLT буфера.
    2. Ресуспензируем бусины в 61,6 мкл RLT буфер и перенос подвески для каждого образца. Добавить 61,6 мкл 100% Этон. Используйте пипетку смешать в течение 15 мин каждые 5 мин. магнитно отдельных шариков, и удалить supernatant.
    3. Повторите шаг 9.3.4.
    4. Ресуспензируем бусы с 10 мкл Нуклеаза-свободной воды, и пусть сидят в течение 5 мин. магнитно отделить бусы и передачи 10 мкл супернатант на новую трубку.
      Примечание: Это возможная точка останова (входные образцы могут храниться при температуре-80 ° c до следующего дня).

11. Обратная транскрипция, перевязывание адаптера ДНК к cDNA 3 ' концы

  1. Добавить 0,5 мкл РТ грунтовки (Таблица 1) до 10 мкл входного РНК (от шага 10.2.4) и 10 мкл из клипа РНК (от Step 8.8.4) соответственно, инкубировать в течение 2 мин в предварительно нагретой блоке ЦР при температуре 65 ° с, место на льду более 1 мин.
  2. Добавить 10 мкл из RT Master Mix (2 мкКл RT буфер [500 mM рис-совместимого, pH 8,3; 750 mM KCl; 30 мм MgCl2]; 4 МКСЛ воды, свободной от нуклеазы; 0,3 мкл ингибитора нрсэ; 2 мкл 0,1 м дитиотритул; 0,2 мкл 0,1 m datp; 0,2 мкл 0,1 м Дцстр; 0,2 мкКл 0,1 M dGTP; 0,2 мкл 0,1 м Дттп; 0,9 мкл обратной транскриптазы) к каждому образцу, перемешать, инкубировать при 55 °C для 45 мин на предварительно нагретом блоке ЦР.
  3. Смешайте 20 мкл продукта реакции RT с 3,5 мкл Реагента по очистке продукта от ЦР. Инкубировать в течение 15 минут при температуре 37 ° c.
  4. Добавить 1 мкл 0,5 м ЭДТА, смешать по пипетит. Добавьте 3 мкл 1 м NaOH, смешайте с петтинг, и инкубировать в течение 12 минут при температуре 70 ° c на блоке ЦР для гидролизовать РНК шаблона.
  5. Добавьте 3 мкл 1 M совместимого, пипетки-микс для нейтрализации буфера.
  6. Очистка кДНК
    1. Магнитно отдельных 10 мкл нуклеиновых кислот извлечения магнитных бусин для каждого образца, удалить supernatant. Промыть один раз с 500 мкл RLT буфера.
    2. Ресуспензируем бусины в 93 мкл RLT буфера и переноса подвески на образец. Добавить 111,6 мкл 100% Этон, инкубировать его в течение 5 минут, и пипетки смешать каждые 2 мин. Соберите шарики с магнитной подставка и отбросить supernatant. Ресуспензируем бусы с 1 мл 80%, Этон и перейти на новую трубку.
    3. После 30-х годов, собирать шарики с магнитной подставка и отбросить supernatant. Мыть дважды с 80% Этон. Магнитно отделить и отбросить остаточную жидкость с тонкой наконечник. Воздух сухой в течение 5 мин (Избегайте чрезмерного высыхания). Ресуспензируем бусы в 5 мкл 5 мм рис-совместимого и инкубировать его на 5 мин.
  7. Добавьте 0,8 мкл адаптера ДНК (Таблица 1) и 1 мкл ДМСО к бисеру, Инкубируйте в течение 2 минут при температуре 75 ° с. Место на льду более 1 мин.
  8. Подготовка 12,8 мкл из перевязки Мастер микс (2 мкл из 10x буфер перевязки [500 mM рис-совместимого; 100 mM MgCl2; 10 мм дитиотремитол]; 1,1 мкл Нуклеаза-свободной воды; 0,2 мкл 0,1 M ATP; 9 мкл из 50% PEG8000; 0,5 МККЛ РНК-лигазы [30 U/мкл]) , Флик смешивать, спина кратко в центрифуге, и добавить его к каждому образцу, перемешать образца с пипеткой отзыв медленно.
  9. Добавьте еще 1 мкл лигазы РНК [30 U/мкл] к каждому образцу и Флик, чтобы перемешать. Инкубировать для 30 s при 25 °C, встряхивая на 1 200 оборотов в минуту. Инкубировать при температуре 25 °C в одночасье. Флик смешать слегка 5 до 6 раз, один раз в час.
  10. Очистка лигирован cDNA
    1. Магнитно отдельных 5 мкл нуклеиновых кислот извлечения магнитных бусин для каждого образца, и удалить supernatant.
    2. Промыть один раз с 500 мкл RLT буфер.
    3. Ресуспензируем бусины в 60 мкл RLT буфер для бисера и передачи подвески для каждого образца. Добавить 60 Мкl 100% Этон, инкубировать его в течение 5 минут и пипетки смешать каждые 2 мин. магнитно отдельно, отменить supernatant.
    4. Повторите шаг 9.3.4.
    5. Ресуспензируем бусины с 27 мкл 10 мм рис-совместимого, инкубировать его на 5 мин. магнитно отдельно, и переместить 25 мкл образца в новую трубку. Разбавить 1 мкл либированных cDNA с 9 мкл Нуклеаза-свободной воды в новой трубе. Храните оставшиеся образцы при температуре-20 °C до 13,1.

12. Количественная оценка кДНК в режиме реального времени количественное ЦР (КЦР)

  1. Добавьте 9 мкл мастер-микса qPCR (5 мкл 2-х мастер-микса; 3,6 мкл Нуклеаза-свободной воды; 0,4 мкл смеси грунтовки [10 мкм ЦР-F-D50X и 10 мкм ЦР-R-D70X]) до пластины qPCR 96-well. Добавьте 1 мкл 1:10 разбавленный (в H2O) cDNA (от шага 11.10.5), печать и перемешать.
  2. Запустите программу qPCR в Термоциклер: 2 мин при температуре 50 ° c; 2 мин при температуре 95 ° c; 3 s на 95 ° c следуют 30 s при 68 °C для 40 циклов; 15 с на 95 ° c следуют 60 s при 68 ° c следуют 15 s при 95 ° c для 1 цикла. Примечание CT (пороговое значение цикла).

13. усиление СЦР в кДНК

  1. Обойтись 35 мкл мастер-микса (25 мкл 2x мастер-микса); 5 мкл Нуклеаза-свободной воды; 5 мкл смеси грунтовки [20 мкм ЦР-F-D50X и 20 мкм ЦР-R-D70X]) на 8-хорошо полоски. Для группы клип добавьте 12,5 мкл образца КЛИПА + 2,5 мкл H2O; для группы входов, добавьте 10 мкл входов + 5 мкл H2O. Смешайте хорошо и спина кратко в центрифуге.
  2. Запустите программу ЦР: 30 s при температуре 98 ° c; 15 с на 98 ° c следуют 30 с на 68 ° c следуют 40 s при 72 ° c для 6 циклов; 15 s при 98 °C следуют 60 s при 72 °C для N циклов = (значения qPCR-3)-6; 60 s при 72 °C; 4 °C удерживайте.
    Примечание: Лучше выполнять от 1 до 2 дополнительных циклов ЦР для первой пары клипов.

14. гель очистка

  1. Нагрузка образцов на 3% с высоким разрешением агарозы гель. Оставляя 1 пустой колодец между образцами, и использовать лестницу с обеих сторон геля. Запустите на 100 V для 75 min в 1x рис-Бората-ЭДТА (TBE) буфер.
  2. Под синим светом освещение, вырезать гель ломтики 175-350 BP использованием свежих бритвенных лезвий для каждого образца. Поместите их в 15 мл конических труб.
    1. Взвешивание геля ломтик, и елют гель с помощью геля извлечения комплекта.
    2. Добавить 6X томов геля растворения буфера, чтобы растопить гель (100 мг гель = 600 мкл геля растворения буфера). Растворить гель при комнатной температуре. (Встряхнуть, чтобы смешать каждые 15 минут, пока гель ломтик полностью растворяется). Добавить 1 гель объемом 100% изопропанол и хорошо перемешать.
    3. Передача 750 мкл образца (от Step 14.2.2) к колонне в сборочной трубе и центрифуге при 17 900 x g для 1 мин. проток сброса.
    4. Повторите шаг 14.2.3, пока все образцы прошли через колонку, мыть один раз с 500 мкл геля растворения буфера.
    5. Добавьте 750 мкл буфера мытья (из комплекта извлечения геля) к колонне и центрифуге при 17 900 x g в течение 1 мин. Сброс потока, спина на 17 900 x g в течение 2 мин. Поместите столбец в новую трубку 1,5 ml.
    6. Удалите все оставшиеся буфер стирки из пластиковых фиолетовый обода колонны. Воздух сухой в течение 2 мин. Добавить 12,5 мкл Нуклеаза-свободной воды в центр мембраны. Пусть колонка стоять в течение 2 минут при комнатной температуре, и спина на 17 900 x g в течение 1 мин (для Улучшенный выход, повторите этап революции).

15. TOPO клон продукта КЦР

  1. Подготовьте смесь реакции клонирования TOPO (1 мкл продукта КЦР от 14.2.6 шага; 1 мкл клонирования смешивают; 3 мкл стерильной воды). Смешайте осторожно и инкубировать в течение 5 минут при температуре 20-37 ° c. Круто на льду.
  2. Оттаивание химически компетентных бактерий E. coli на льду. Добавьте 5 мкл клонирования TOPO продукта до 100 мкл компетентных бактерий29. Аккуратно перемешайте. Инкубировать на льду в течение 30 мин.
  3. Тепло-шок для 60 s при 42 °C. Затем охладиться на льду в течение 2 мин. Добавить 900 мкл из лизогенеза бульона (LB) среды, инкубировать при 37 ° c для 1 ч, встряхивая при 225 оборотов в минуту. Спин на 1 000 x g в течение 1 мин, а затем удалить 900 мкл supernatant. Ресуспензируем остальные решения.
  4. Пластины преобразованные бактерии на 1,5% LB агар пластин, содержащих ампициллина (100 мкг/мл), и инкубировать ночь при 37 ° c.
  5. Подготовьте по крайней мере 20 1,5 mL центрифуг трубы для каждой конструкции. Заполните один комплект с 500 мкл из LB среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Используйте стерильные пипетки отзыв, чтобы поцарапать одну бактериальную колонию случайным образом и перемешать (по pipetting) с 500 мкл из LB среды. Инкубировать при температуре 37 ° c для 5 ч, встряхивая при 225 оборотов в минуту.
  6. Последовательность вставки фрагмент с использованием обратном M13 грунтовка: КАГАААКАГЦИТАКК на Сэнгер секвенирование30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Процедура и результаты eclip проиллюстрированы на рисунке 1, рисунке 2, рисунке 3, рисунке 4. Мышей усыпляли двуокись углерода и небольшой разрез был сделан в нижней части живота с помощью хирургических ножниц (рис. 2A,б). Мыши яички были удалены, отсоединились, а затем УФ-Кросси после измельчения (Рисунок 2C-I). Репрезентативные результаты eCLIP с использованием двух известных РНК-связывающих гелиаз в яичной ткани изображены на рисунке 3 и 4. Мы выполнили MOV10 Эклиб в яичках взрослых мышей дикого типа, с общей концентрацией 40 U/mL Верхняя панель рисунка 3A показывает, что целевой белок размером около 114 kDa был успешно обогащен. Западная помарка из иммунорецептированных белков MOV10L1 была выполнена с двумя концентрациями (5 или 40 U/mL) в процессе eCLIP (рис. 3). На рисунке 3b показаны КЦР с использованием 1:10 разбавленной кДНК (уже лигирован с адаптером ДНК) от MOV10 и MOV10L1 УФ-кроссосоединенный, непересекаются, и сопряженный размер сопряженного ввода (sminput) образца. Непересекасвязанные образцы показывают снижение восстановления РНК. Мы отметили, что значения КТ не пересекаемой группы, как правило, в 5 раз больше, чем группы, пересекаемой с УФ-излучениям. Рисунок 4A отображает усиление и выделение ОЦР через электрофорез геля агарозы (Cut 175-350 BP). Грунтовка-dimer продукт появляется около 140 BP. Рисунок 4b показывает UCSC геном браузера зрения двух репрезентативных последовательностей последовательности. MOV10-связаны теги eCLIP, как установлено, находится в пределах 3 ' UTR гена FTO; Приблизительный тариф 3 ' UTR целевых показателей составляет 75% (Рисунок 4C), в соответствии с большинством MOV10 целей в HEK293 клеток10 и в яичках (данные не показаны). В противоположность этому, метки MOV10L1, связанные с eCLIP, находятся в кластере piRNA с указанием MOV10L1 целевых прекурсоров piRNA. Приблизительная ставка целевых показателей на прекурсоры piRNA составляет 42% (рис. 4E), что отражает тренд от нашего предыдущего обычного клипа-эксперимента20. MOV10L1 eCLIP с 40 U/mL Нrase я пищеварение дает относительно больше последовательностей с менее чем 20 BP (рис. 4D).

Figure 1
Рисунок 1 : Схематическое представление eCLIP. УФ-пересекая мышь полуносные канальцы (шаг 1) являются лизированные в лизиса буфера eCLIP и sonicated (шаг 2). Lyнасыт обрабатывают rrase I для фрагмента РНК, после чего комплексы белково-РНК являются иммудорецидивами с использованием антител анти-РБП (шаг 3-4). Выполняется дефосфорилирование фрагментов РНК и перевязки 3 ' РНК-адаптера (шаг 5-6). Белково-РНК комплексы работают на гель ГДС-Пэйдж и передаются на нитроцеллюлозные мембраны (шаг 7). РНК восстанавливается из мембраны путем переваривания белка с протеинеза K и мочевины, которая оставляет короткий полипептид, оставшихся на поперечной красться сайта. Дефосфорилирование РНК фрагментов входных образцов и перевязки 3 ' РНК-адаптера выполняется (шаг 8). Выполните RT РНК и перевязки 3 ' ДНК адаптера (шаг 9-10). Выполните ЦР-амплификация библиотеки кДНК, извлечение геля и тупое-конец клонирования в качестве предварительного контроля качества библиотеки (шаг 11). Наконец, выполните секвенирование с высокой пропускной способностью (шаг 12). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Сбор урожая ткани и УФ-перекрестки. (A) воздействия на живот мыши. (B) 0,5 см разрез в брюшной стенке подвергая брюшины. (C) пара яичек взяты из потянув жира колодки. (D) тестикулярная ткань удаляется и помещается в небольшое блюдо, содержащее лед-холодный PBS. (E) аккуратно удалите тунику альбузин. (F) нажмите на сыпучих песл, чтобы и ткани в ткань шлифовальный станок. G) распределенные семеносодержащих канальцы в 10 см пластины. (H) УФ-скрещиывания с 400 МЮ/cm2 энергии. I) перекрестки образцов собраны в 1,5 мл труб центрифуг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Репрезентативные результаты MOV10 и MOV10L1 eCLIP. (A) утверждение вестерна-блот MOV10 и MOV10L1 иммунорецеппитатов. (B) КЦР на 1:10 Разводненная eclip библиотек MOV10 и MOV10L1, с реплицирует для УФ, не УФ-и парных образцов SMInput. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : подготовка библиотеки Eclip и оценка качества. A) показаны гелевые изображения усиления ЦР. Звездочка указывает на грунтовку dimer. Красная пунктирная линия указывает на регионы, вырезаные для КЦР продукт cDNA, где-то между 175 и 350 BP. (B) UCSC геном браузер зрения двух репрезентативных последовательностей31последовательности. (C) мелкомасштабное подклон секвенирования анализа MOV10. (D) Теги с привязками к MOV10L1 отображают различные шаблоны распределения длины при обработке двумя различными концентрациями Нрсэ. (E) мелкомасштабного анализа секвенирования СУБКЛОНОВ MOV10L1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Название последовательности Информация о последовательности Описание
РНК-адаптеры
РНК X1A /5фоссагагггаггугагогагегагагагагегагогагагегагогагогагегигагогагегаg запас на 200 мкм; работает на 20 мкм
РНК X1B /5Фосс/Aauagкангнанагагаггагугагугаггагегагагекгагаgguag/3spc3/ запас на 200 мкм; работает на 20 мкм
RiL19 /5Фоссаагаггагугуггугуггагуггугуггаg3/ запас на 200 мкм; работа в 40 мкм
Адаптер ДНК
Rand103tr3 /5Фоссагагцкктг/3Pc3/ запас на 200 мкм; работа в 80 мкм
RT грунтовка
AR17 АКАКГАЦГТСКЕТГА запас на 200 мкм; работает на 20 мкм
Праймеры по ЦР

ЦР-F-D 501
AATGATACGGCCКАЧАКТАКАТАГАЦКЦКЦККТКТАККЦТCTATT запас на 100 мкм; работает на 20 мкм
ЦР-R-D 701 КААГКАГААГАКГГКАТАКГАГАТКГАГТААТГТГАКТГГАГТТКАГАКГТГТГКТКТТККГАТК запас на 100 мкм; работает на 20 мкм
(См. письмо с обслуживанием клиентов Лаборатория Noritsu D502-508, D702-712)

Таблица 1: последовательности адаптеров и грунтовки. Адаптер содержит в строке случайных мер (либо N5 или N10), чтобы определить, является ли две идентичные последовательности читает указать два уникальных фрагментов РНК или ЦР-дубликаты одного и того же фрагмента РНК. "5 Фос" обозначает 5 ' фосфорилирование, которое необходимо, если олиго используется в качестве субстрата для ДНК/РНК лигазы. "3SpC3" выступает за 3 ' С3 спейсер, который может предотвратить перевязки между переходники.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

С увеличением понимания универсальной роли одпс как в биологическом, так и в патологическом контекстах, методы клипа широко использовались для выявления молекулярной функции РБП20,32,33, 34,35. Описанный здесь протокол представляет собой адаптированное применение метода eCLIP к мышелу-яику.

Одна из проблем в выполнении eCLIP в Семенов является поддержание жизнеспособности и целостности свежих клеток яичка, что также имеет важное значение для эффективного скрещивания. Стрижка семенником с мягкой механической силой с помощью сыпучих песта может предотвратить лизиса клеток32,36. Правильное переваривание РНК также имеет решающее значение для успешных анализов eCLIP. Фрагменты РНК может быть более конвергентных после пищеварения, но длина менее 20 БП могут быть удалены с помощью предварительной обработки библиотеки читает. Для того, чтобы принять идеальную дозировку RBP для кандидата от РБП, мы предлагаем предварительный тест, основанный на результатах субклона секвенирования библиотек eCLIP, которые могут быть подготовлены путем лечения Нрнк с концентрацией от 0 вы до 40 U (на миллилитр лизина). Для надежного анализа качества библиотеки в нашем методе eCLIP рекомендуется использовать мелкомасштабный анализ последовательности подклонов. Во-первых, процент вставок меньше 20 БП не должен быть слишком высоким, или, последующая Предварительная обработка библиотеки eCLIP вызовет дорогостоящую потерю считывает. Во-вторых, следует проверить эффективность корректной перевязки обоих адаптеров. Некачественные образцы могут быть устранены без глубокой последовательности, чтобы обеспечить успешное глубокое секвенирование, результаты которого обычно занимают гораздо больше времени для анализа.

Хотя осуществимость Эклипа в мышеловке по-прежнему ограничена спецификой антитела для этапа иммуноопципиции, eCLIP выгодно по сравнению с обычными методами КЛИПА в нескольких аспектах. Во-первых, это нерадиоактивный метод. По eCLIP, РНК целей Одбп непосредственно захватили в естественных условиях без необходимости прибегать к трудоемких методов с использованием радиоактивных материалов. Во-вторых, метод меньше времени интенсивно. Вся процедура занимает всего 4 дня через подготовку библиотеки eCLIP. В-третьих, последовательность разнообразия. По сравнению с обычным унифицированным циклом усиления 25-35 циклов, eclip ссылается на КТ значения КЦР, чтобы установить количество циклов ЦР конкретно. Наконец, он обеспечивает более сильное соотношение сигнал-шум. Размер подобранный ввод служит подходящим фоном для подлинных целей.

В итоге, наши результаты eCLIP консолидировали выводы, что MOV10 и MOV10L1 имеют обязывающее предпочтение к прекурсоры мРНК 3 ' UTR и piRNA, соответственно. Протокол, описанный нами в настоящем документе, представляет собой первую работу метода eCLIP в области воспроизводства, область, в которой знания о взаимодействии РНК-РБП довольно недостаточны, хотя генетические исследования предоставили исчерпывающие сведения о биологических ролях РБП. Визуализация этого протокола eCLIP может помочь в руководстве его широкого применения в более широких областях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Эрика л Ван Ностранд и Джин в ё за полезное руководство с исходным протоколом. К.З. был поддержан национальной ключевой R & D программа Китая (2016YFA0500902, 1003500), и Национальный фонд естественных наук Китая (31771653). Л.И. была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81471502, 31871503) и инновационной и предпринимательской программой провинции Цзянсу.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-mouse MOV10  antibody Proteintech, China 10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibody Zheng et al.20109 polyclonal antisera UP2175 provided by P. Jeremy Wang lab, University of Pennsylvania
HRP Goat Anti-Rabbit IgG  ABclonal AS014
Rabbit IgG Beyotime, China A7016
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany 5242R
Digital sonifier BRANSON,USA BBV12081048A 450 Watts; 50/60 Hz
DynaMag-2 Magnet Invitrogen,USA 12321D
Mini Blot Module Invitrogen,USA B1000
Mini Gel Tank Invitrogen,USA A25977
Shaking incubator Eppendorf, Hamburg, Germany Thermomixer comfort 
Tissue Grinder, Dounce PYREX, USA 1234F35 only  the "loose" pestle is used in this protocol
TProfessional standard 96 Gradient Biometra, Germany serial no.: 2604323
Tube Revolver  Crystal, USA serial no.: 3406051
UV-light cross-linker UVP, USA CL-1000
Materials
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430167 100 mm 
Tubes Corning, USA 430791 15 mL
Microtubes tubes AXYGEN , USA MCT-150-C 1.5 mL 
Reagents 
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol  Solarbio, China P1011 25:24:01
AffinityScript Enzyme Agilent, USA 600107
Antioxidant Invitrogen,USA NP0005
DH5α competent bacteria Thermo Scientific, USA 18265017 these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction.
DMSO Sigma-Aldrich, USA D8418
DNA Ladder Invitrogen, USA 10416014
dNTP Sigma-Aldrich, USA DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A  Invitrogen, USA 10002D
ECL reagent Vazyme, China E411-04
EDTA Invitrogen, USA AM9260G
EDTA free protease inhibitor cocktail Roche, USA 04693132001 add fresh
Exo-SAP-IT Affymetrix, USA 78201 PCR Product Cleanup Reagent 
FastAP enzyme Thermo Scientific, USA EF0652
LDS Sample Buffer Thermo Scientific, USA NP0007
MetaPhor Agarose  lonza, Switzerland 50180
MgCl2 Invitrogen, USA AM9530G
MiniElute gel Extraction QIAGEN, Germany 28604 column store at 4 ?; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)
MyONE Silane beads Thermo Scientific, USA 37002D nucleic acids extraction magnetic beads
NaCl Invitrogen,USA AM9759
 
NP-40 Amresco, USA M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels Invitrogen, USA NP0336BOX 4%–12%,1.5 mm, 15-well
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit  Invitrogen, USA NP0050
PBS Gibco, USA 10010023
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube   TIANGEN, China WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems, USA A25742
Proteinase K NEB, New England  P8107S
Q5 PCR master mix  NEB, New England  M0492L
RLT buffer QIAGEN, Germany 79216 RNA purification lysis buffer 
RNA Clean & Concentrator-5 columns  ZYMO RESEARCH, USA R1016 RNA purification and concentration columns
RNase I  Invitrogen, USA AM2295
RNase Inhibitor Promega, USA N251B
RQ1 DNase Promega,USA M610A
Sample Reducing Agent Invitrogen,USA NP0009
SDS Solution Invitrogen, USA 15553027 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich, USA 30970 protect from light
T4 PNK enzyme NEB, New England  M0201L
T4 RNA ligase 1 high conc NEB, New England  M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning Mix Vazyme, China C601-01
TBE Invitrogen,USA AM9863
Tris-HCI Buffer Invitrogen, USA 15567027
Triton X-100 Sangon Biotech, China A600198 
Tween-20 Sangon Biotech, China A600560
Urea Sigma-Aldrich, USA U5378
X-ray Films Caresteam, Canada 6535876

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids. Developmental Cell. 10, (4), 521-529 (2006).
  2. Turner, J. M. A. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134, (10), 1823-1831 (2007).
  3. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434, (7033), 583-589 (2005).
  4. Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, (5648), 1212-1215 (2003).
  5. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, (4), 376-386 (2005).
  6. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, (8), 1071-1082 (1999).
  7. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97, (26), 14085-14090 (2000).
  8. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, (7254), 479-486 (2009).
  9. Zheng, K., et al. Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107, (26), 11841-11846 (2010).
  10. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54, (4), 573-585 (2014).
  11. Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation. Neuron. 64, (6), 871-884 (2009).
  12. Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition. Nucleic Acids Research. 46, (4), 1912-1926 (2018).
  13. Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. Jr MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells. PLoS Genetics. 8, (10), e1002941 (2012).
  14. Haussecker, D., et al. Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication. Nature Structural & Molecular Biology. 15, (7), 714-721 (2008).
  15. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, (5), 1729-1741 (2014).
  16. Messaoudi-Aubert, S. E., et al. Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor. Nature Structural & Molecular Biology. 17, (7), 862-868 (2010).
  17. Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data. Nucleic Acids Research. 40, (20), e160 (2012).
  18. Skariah, G., et al. Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain. BMC Biology. 15, (1), 54 (2017).
  19. Zheng, K., Wang, P. J. Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity. PLoS Genetics. 8, (11), e1003038 (2012).
  20. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29, (6), 617-629 (2015).
  21. Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions. Nucleic Acids Research. 46, (21), 11553-11565 (2018).
  22. Huppertz, I., et al. iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65, (3), 274-287 (2014).
  23. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, (1), 129-141 (2010).
  24. Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  25. Konig, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17, (7), 909-915 (2010).
  26. Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  27. Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins. Nature Communications. 9, (1), 1142 (2018).
  28. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13, (6), 508-514 (2016).
  29. Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnology. 11, 24 (2011).
  30. Breunig, C. T., et al. A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR). Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
  31. Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. The UCSC genome browser and associated tools. Briefings in Bioinformatics. 14, (2), 144-161 (2013).
  32. Vourekas, A., et al. Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis. Nature Structural & Molecular Biology. 19, (8), 773-781 (2012).
  33. Preitner, N., et al. APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly. Cell. 158, (2), 368-382 (2014).
  34. Meyer, C., et al. The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression. Molecular Cell. 69, (4), 622-635 (2018).
  35. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15, (12), 829-845 (2014).
  36. Vourekas, A., Mourelatos, Z. HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins. Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).
Улучшенный перекрестное связывание иммунология (eCLIP) метод эффективной идентификации белка связаны РНК в яичной яичка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Q., Wang, C., Ling, L., Yue, Q., Liu, M., Zhang, S., Fu, K., Ye, L., Zheng, K. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. J. Vis. Exp. (147), e59681, doi:10.3791/59681 (2019).More

Xu, Q., Wang, C., Ling, L., Yue, Q., Liu, M., Zhang, S., Fu, K., Ye, L., Zheng, K. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. J. Vis. Exp. (147), e59681, doi:10.3791/59681 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter