Burada, testis ‘teki RBP adaylarının büyük RNA hedeflerini belirlemek için bir eCLIP Protokolü sunuyoruz.
Spermatogenesis, memelilerde erkek germ hücresi farklılaşma yüksek sipariş edilen bir süreç tanımlar. Testis, transkripsiyon ve çeviri unoupled, RBPs tarafından düzenlenmiş Gen ifadesinin Post-transcriptional düzenleme önemini vurgulayarak. Bir RBP ‘nin mekanik rollerini yenilemek için, endojen doğrudan RNA hedeflerini yakalamak ve gerçek etkileşim sitelerini tanımlamak için çapraz bağlama immünopresipitasyon (CLIP) metodolojisi kullanılabilir. Gelişmiş CLıP (eCLIP), geleneksel klipler üzerinde çeşitli avantajlar sunan yeni geliştirilen bir yöntemdir. Ancak, eCLIP kullanımı şimdiye kadar genişletilmiş uygulamalar için arama, hücre hatları ile sınırlı olmuştur. Burada, biz MOV10 ve MOV10L1, iki RNA-bağlayıcı helicases, fare testis okumak için eCLIP istihdam. Beklendiği gibi, biz MOV10 ağırlıklı olarak mRNA 3 ‘ tercüme edilmemiş bölgelere (UTRs) bağlar ve MOV10L1 seçmeli olarak Piwi-etkileşim RNA (piRNA) öncüsü transkriptler bağlar bulabilirsiniz. ECLIP yöntemimiz, alt klonların küçük ölçekli sıralaması ve böylece nitelikli kütüphanelerin kullanılabilirliği ile çeşitli RBPs ‘lerin bağlı olduğu büyük RNA türlerinin hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar ve bu da derin sıralamaya devam etmek için bir emir olarak kullanılabilir. Bu çalışma, memeliyen testis içinde eCLIP için geçerli bir temel kurar.
Mammalian testis bir karmaşık hücre farklılaşma programı cyclically çok sayıda spermatozoa verim çalışır burada mükemmel bir gelişimsel model temsil eder. Bu modelin benzersiz bir değeri, genellikle Mayoz bölünmenin seks kromozom inaktivasyonu (MSCI)1,2 ve yuvarlak spermatids geçmesi zaman oluşur spermatogenesis belirli aşamalarında transkripsiyonel inaktivasyonu ortaya çıkması yatıyor spermiogenesis sırasında şiddetli nükleer sıkıştırma3. Bu ardışık transkripsiyonel olaylar, RNA bağlayıcı proteinlerin (rbps) transscriptome şekillendirme ve Erkek fertilitesini sürdürmek için önemli bir rol oynadığı transkripsiyon sonrası gen düzenlemesini gerektirmektedir.
Tek bir RBP in vivo ın bona fide RNA hedeflerini belirlemek için, çapraz immünoprecipitation (klip) yöntemi4,5, dayalı ancak normal RNA immünoprecipitation (RIP), istinaden geliştirilmiştir5/6 , ultraviyole (UV) Crosslinking, sıkı yıkama ve jel transferi dahil olmak üzere önemli adımlar eklenmesi ile sinyal özgüllüğü geliştirmek için. KLIBIN yüksek verimlilik sıralaması ile birlikte gelişmiş uygulaması, genom çapında8düzeylerinde PROTEIN-RNA etkileşiminin profiline büyük ilgi yarattı. RBP fonksiyonunda genetik çalışmalarda ek olarak, endojen proteinin ve RNA ‘nın doğrudan etkileşimlerini belirleyen bu tür biyokimyasal Yöntemler, RBPs ‘in RNA düzenleyici rollerini doğru bir şekilde elükte etmek için vazgeçilmez olmuştur. Örneğin, MOV10L1 erkek fertilite ve Piwi etkileşim RNA (piRNA) biyogenesis9için gerekli olan bir TESTIS özgü RNA helikaz olduğunu. Onun Parme MOV10 RNA biyoloji10,11,12,13,14 birden fazla açıdan roller ile bir her yerde ifade ve çok fonksiyonlu RNA helikazı olarak bilinir , 15 , 16 , 17 , 18. geleneksel klip-Seq istihdam ederek, biz MOV10L1 bağlar ve erken Pirna işleme19,20başlatmak için birincil Pirna öncüleri düzenler ve MOV10 mRNA 3 ‘ utrs ve yanı sıra kodlamayan RNA bağlar bulundu Testis germ hücrelerinde türler (veri gösterilmez).
Yine de, CLıP orijinal bir zahmetli, radyoaktif prosedür KLIPS etiketleri dikkat çekici bir kaybı ile dizi kitaplık hazırlama izledi. Geleneksel KLIPS ‘de, her iki RNA ekstremitesinde birleştirilmiş adaptörler kullanılarak cDNA Kütüphanesi hazırlanır. Protein sindirimi sonrasında, çapraz bağlantılı kısa polipeptit RNA parçalarına bağlı kalır. Bu çapraz işareti kısmen blok ters transkriptaz (rtase) ilerlemesi cDNA sentezi sırasında, yaklaşık 80% cDNA Kütüphanesi21,22temsil eden kesilmiş cdnas sonuçlanan. Bu nedenle, yalnızca cDNA parçaları (okuma-through) çapraz bağlantı sitesi atlayarak RTase kaynaklanan sıralanmış. Son zamanlarda, PAR-CLıP, ıclip, eCLIP ve uvCLAP gibi çeşitli CLıP yaklaşımlar, yaşam hücrelerinde RBPs Crosslink sitelerini tanımlamak için istihdam edilmiştir. PAR-CLıP 365 Nm UV radyasyon ve photoactivatable nüklitid analogları uygulama içerir ve bu nedenle içinde-kültür yaşam hücrelerine özeldir, ve yeni sentezlenmiş transkriptler içine nükliside analogların birleşmesi önyargı üreten eğilimli RNA fiziksel olarak protein23,24ile etkileşime girer. Iclip ‘de, sadece tek bir adaptör, çapraz bağlı RNA parçalarının 3 ‘ ekstremite için bağlanır. Ters transkripsiyon (RT) sonrasında, hem kesilmiş hem de okunan cdnas, intramolecularly döngülü ve yeniden doğruylama ile polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu tarafından elde edilir25,26. Ancak, intramoleküler devre verimliliği nispeten düşüktür. Eski CLIP protokolleri bir radyoizotop ile çapraz bağlı RNA etiketleme gerekir rağmen, ultraviyole çapraz ve yakınlık arıtma (uvclap), sıkı tandem benzeşme arıtma bir süreç ile, radyoaktivite27güvenmez. Yine de, uvclap tandem benzeşimi arıtma için 3x Flag-HBH etiketini taşıyan ifade vektörü ile transfekte olmalıdır kültürlü hücreler ile sınırlıdır.
ECLIP ‘de, adaptörler ilk olarak RNA ‘nın 3 ‘ ekstremite altında RT ‘nin ardından, sonra da cDNAs ‘ın 3 ‘ ekstremite içinde moleküllü bir modda bağlanıldı. Bu nedenle, eCLIP tüm kesilmiş ve okunan cDNA28ile yakalamak mümkün. Ayrıca, ne radyoaktif etiketleme sınırlıdır, ne de kendi ilkesine göre hücre hatları kullanarak, tek nüklemotid çözünürlüğü korurken.
Burada, fare testis için uyarlanmış bir eCLIP protokolünün adım adım açıklamasını sağlıyoruz. Kısaca, bu Eclip protokolü, testis tübüllerin UV çapraz ile başlar, kısmi RNase sindirim ve immünoprecipitation bir protein özgü antikor kullanarak izledi. Sonra, protein bağlı RNA dephosphorylated, ve adaptör 3 ‘ sonuna bağlanır. Protein jeli Elektroforez ve jel-membran transferinden sonra RNA, beklenen bir boyut aralığının membran alanını keserek izole edilir. RT sonra, DNA adaptörü PCR amplifikasyon tarafından izlenen cDNA 3 ‘ sonuna bağlandı. Yüksek verimlilik sıralamasının öncesinde subklonlar taraması Kütüphane kalite kontrolü olarak alınır. Bu protokol, iki testis ifade RNA helikazlar MOV10L1 ve MOV10 tarafından örneklenmiş rbps protein bağlı RNA büyük türlerin belirlenmesi, etkilidir.
Hem biyolojik hem de patolojik bağlamlar altında rbps evrensel rolünü anlamak artan, klip yöntemleri yaygın rbps moleküler fonksiyonunu ortaya çıkarmak için kullanılmıştır20,32,33, 34,35. Burada açıklanan protokol, fare testis için eCLIP yönteminin uyarlanmış bir uygulamasını temsil eder.
Testis içinde Eclip …
The authors have nothing to disclose.
Biz orijinal protokol ile yararlı rehberlik için Eric L Van Nostrand ve gene W Yeo teşekkür ederiz. K.Z. Ulusal anahtar R & D programı Çin (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) ve Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin (31771653) tarafından desteklenmektedir. Ly Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin (81471502, 31871503) ve yenilikçi ve girişimcilik programı Jiangsu Eyaleti tarafından desteklenmektedir.
Antibodies | |||
Anti-mouse MOV10 antibody | Proteintech, China | 10370-1-AP | |
Anti-mouse MOV10L1 antibody | Zheng et al.20109 | polyclonal antisera UP2175 | provided by P. Jeremy Wang lab(University of Pennsylvania) |
HRP Goat Anti-Rabbit IgG | ABclonal | AS014 | |
Rabbit IgG | Beyotime, China | A7016 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242R | |
Digital sonifier | BRANSON,USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen,USA | 12321D | |
Mini Blot Module | Invitrogen,USA | B1000 | |
Mini Gel Tank | Invitrogen,USA | A25977 | |
Shaking incubator | Eppendorf, Hamburg, Germany | Thermomixer comfort | |
Tissue Grinder, Dounce | PYREX, USA | 1234F35 | only the "loose" pestle is used in this protocol |
TProfessional standard 96 Gradient | Biometra, Germany | serial no.: 2604323 | |
Tube Revolver | Crystal, USA | serial no.: 3406051 | |
UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
Materials | |||
TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
Microtubes tubes | AXYGEN , USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
Reagents | |||
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol | Solarbio, China | P1011 | 25:24:01 |
AffinityScript Enzyme | Agilent, USA | 600107 | |
Antioxidant | Invitrogen,USA | NP0005 | |
DH5α competent bacteria | Thermo Scientific, USA | 18265017 | these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction. |
DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D8418 | |
DNA Ladder | Invitrogen, USA | 10416014 | |
dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
Dynabeads Protein A | Invitrogen, USA | 10002D | |
ECL reagent | Vazyme, China | E411-04 | |
EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | |
EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | add fresh |
Exo-SAP-IT | Affymetrix, USA | 78201 | PCR Product Cleanup Reagent |
FastAP enzyme | Thermo Scientific, USA | EF0652 | |
LDS Sample Buffer | Thermo Scientific, USA | NP0007 | |
MetaPhor Agarose | lonza, Switzerland | 50180 | |
MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | |
MiniElute gel Extraction | QIAGEN, Germany | 28604 | column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14) |
MyONE Silane beads | Thermo Scientific, USA | 37002D | nucleic acids extraction magnetic beads |
NaCl | Invitrogen,USA | AM9759 |
|
NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen, USA | NP0336BOX | 4%–12%,1.5 mm, 15-well |
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit | Invitrogen, USA | NP0050 | |
PBS | Gibco, USA | 10010023 | |
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube | TIANGEN, China | WM5-2302831 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems, USA | A25742 | |
proteinase K | NEB, New England | P8107S | |
Q5 PCR master mix | NEB, New England | M0492L | |
RLT buffer | QIAGEN, Germany | 79216 | RNA purification lysis buffer |
RNA Clean & Concentrator-5 columns | ZYMO RESEARCH, USA | R1016 | RNA purification and concentration columns |
RNase I | Invitrogen, USA | AM2295 | |
RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
RQ1 DNase | Promega,USA | M610A | |
Sample Reducing Agent | Invitrogen,USA | NP0009 | |
SDS Solution | Invitrogen, USA | 15553027 | 10% |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich, USA | 30970 | protect from light |
T4 PNK enzyme | NEB, New England | M0201L | |
T4 RNA ligase 1 high conc | NEB, New England | M0437M | |
TA/Blunt-Zero Cloning Mix | Vazyme, China | C601-01 | |
TBE | Invitrogen,USA | AM9863 | |
Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | |
Triton X-100 | Sangon Biotech, China | A600198 | |
Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 | |
Urea | Sigma-Aldrich, USA | U5378 | |
X-ray Films | Caresteam, Canada | 6535876 |