Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry
Summary
Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC). Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.
Abstract
De voorbereiding van hoge-kwaliteit muis oog secties voor Immunohistochemistry (IHC) is van cruciaal belang voor de beoordeling van de netvlies structuur en functie en voor het bepalen van de mechanismen ten grondslag liggen aan het netvlies ziekten. Het handhaven van structurele integriteit in het weefsel preparaat is van vitaal belang voor het verkrijgen van reproduceerbare retinale IHC gegevens, maar kan uitdagend zijn als gevolg van de kwetsbaarheid en complexiteit van het netvlies cytoarchitecture. Sterke Fixatieven zoals 10% formaline of de oplossing van Bouin de retinale structuur optimaal te bewaren, belemmeren zij vaak IHC analyse door de achtergrond fluorescentie en/of afnemende antilichaam-epitope interacties, een proces te verbeteren dat als epitope masking wordt bekend. Milder Fixatieven, aan de andere kant, zoals 4% Paraformaldehyde, vermindert de achtergrond fluorescentie en epitope-masking, nauwgezette dissectie technieken moeten worden gebruikt om het netvlies structuur te behouden. In dit artikel presenteren we een uitgebreide methode om muis oculaire achterste cups voor IHC die voldoende is om de meeste antilichaam-epitope interacties te behouden zonder verlies van retinale structurele integriteit te bereiden. Wij omvatten vertegenwoordiger IHC met antilichamen aan diverse retinale cel type tellers om weefsel behoud en richtlijn onder optimale en sub-optimale voorwaarden te illustreren. Ons doel is het optimaliseren van IHC studies van het netvlies door het verstrekken van een compleet Protocol van oculaire posterior Cup dissectie IHC.
Introduction
Immunohistochemistry (IHC) is een krachtige techniek voor het lokaliseren van specifieke eiwitten en cellulaire structuren in weefsels in situ1,2,3. Ongepaste fixatie methoden en sub-optimale afdeling van complexe weefsels kan verstoren weefselstructuur, het genereren van hoge achtergrond vlekken of te verminderen antilichaam-epitope interacties, wat resulteert in vlekken artefacten en daaruit voortvloeiende verkeerde interpretatie van IHC gegevens4. Als de gewervelde Retina is een complex en zeer georganiseerd neuraal orgaan bestaat uit lagen van onderling verbonden fotoreceptoren, interneuronen en ganglioncellen, het is zeer kwetsbaar en kan gemakkelijk worden verstoord tijdens de dissectie en de sectie. Een gedetailleerd, gestandaardiseerd, en gevalideerd Protocol van muis oog dissectie en oriëntatie naar immunokleuring zal helpen aanzienlijk verminderen IHC artefacten, waardoor de betrouwbaarheid van de resultaten en waardoor meer accurate vergelijkende gegevens Analyse.
Er zijn vele protocollen voor weefsel voorbereiding voor IHC, echter, niet zijn allen geschikt voor netvlies weefsel. Sterke Fixatieven zoals 10% formaline of de oplossing van Bouin behouden de netvlies structuur tijdens dissectie en sectioning5. Helaas, sterke Fixatieven vaak leiden tot de versterkte achtergrond fluorescentie en epitope masking als gevolg van de chemische modificatie van epitopes6. Aan de andere kant, mildere Fixatieven, net als 4% Paraformaldehyde (toppunt) kan verlichten sommige van deze artefacten, maar vereisen nauwgezette dissectie en het delen van de optimale retinale structuur te behouden. Het snel doordringen van het gaasweefsel, maar dwars-verbindingen proteïnen zeer langzaam, verminderend het risico van epitope masking. Sinds korte tijd is de incubatie van het middel een vrij milde fixatie, vereisen de weefsels vaak het snelle bevriezen om antigenen te bewaren. Het is belangrijk om te voorkomen dat ijs kristalvorming tijdens het bevriezen van weefsels als ze vervormen en beschadiging van de integriteit van cellen en weefsels7.
Hier beschrijven we gedetailleerde en gestandaardiseerde protocollen voor dissectie, fixatie, en Cryo-bescherming van de muis oculaire achterste cups die consistente en betrouwbare IHC gegevens opleveren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muis Retina dissectie is een delicaat proces te wijten aan de kleine omvang en de vorm van muis ogen en de kwetsbaarheid van het netvlies weefsel. Hoewel het uitvoeren van kwalitatief hoogwaardige dissectie is een kwestie van de praktijk, met een gedetailleerd protocol, het verstrekken van efficiënte methoden en tips is een noodzaak om het netvlies secties en IHC te verkrijgen. In aanvulling op de hier beschreven protocollen, zijn er verschillende tips die het mogelijk maken voor een consistente hoge kwaliteit netvlies …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door fondsen van NIH (RO1-GMO97327) en de Universitaire Stichting van het onderzoek (UPenn). Wij danken Svetlana Savina vooral voor haar hulp bij de ontwikkeling van het Immunohistochemistry protocol, Gordon Ruthel (University of Pennsylvania) en de Penn vet Imaging Core voor hulp bij microscopie en Leslie King, Ph.D. voor kritisch lezen van dit manuscript .
Materials
| 6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
| Aluminum foil | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
| Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
| Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
| Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
| Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives – Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
| Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
| Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
| Styrofoam box | For insulated cooler | ||
| Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
| Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
| Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
| Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
| Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
| Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
| Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
| anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |
References
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113 (1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
