Préparation de la souris Retinal Cryo-sections pour l'immunohistochimie

Summary

Ce rapport décrit des méthodes complètes pour préparer les sections congelées de rétine de souris pour l'immunohistochimie (IHC). Les méthodes décrites incluent la dissection de la tasse postérieure oculaire, la fixation de paraformaldehyde, l'intégration dans la température de coupe optimale (OCT) orientation de médias et de tissu, sectionnement et immunostaining.

Abstract

La préparation de sections oculaires de souris de haute qualité pour l'immunohistochimie (IHC) est essentielle pour évaluer la structure et la fonction rétiniennes et pour déterminer les mécanismes sous-jacents aux maladies rétiniennes. Le maintien de l'intégrité structurelle tout au long de la préparation des tissus est essentiel pour obtenir des données reproductibles du CIH rétinien, mais peut être difficile en raison de la fragilité et de la complexité de la cytoarchitecture rétinienne. Des fixatifs forts comme la formaline de 10 % ou la solution de Bouin préservent de façon optimale la structure rétinienne, ils entravent souvent l'analyse du CiSE en améliorant la fluorescence de fond et/ou en diminuant les interactions anticorps-épitopes, un processus connu sous le nom de masquage épitope. Les fixatifs plus doux, d'autre part, comme le paraformaldéhyde de 4%, réduit la fluorescence de fond et les techniques méticuleuses de dissection d'épitope-masquant doivent être employées pour préserver la structure rétinienne. Dans cet article, nous présentons une méthode complète pour préparer des tasses postérieures oculaires de souris pour IHC qui est suffisante pour préserver la plupart des interactions anticorps-épitope sans perte de l'intégrité structurale rétinienne. Nous incluons le CiPH représentatif avec des anticorps à divers marqueurs de type de cellules rétiniennes pour illustrer la conservation et l'orientation de tissu dans des conditions optimales et sous-optimales. Notre objectif est d'optimiser les études IHC de la rétine en fournissant un protocole complet de la dissection oculaire de tasse postérieure à IHC.

Introduction

L'immunohistochimie (IHC) est une technique puissante pour localiser des protéines spécifiques et des structures cellulaires dans les tissus in situ^1,2,3. Des méthodes de fixation inappropriées et une section sous-optimale de tissus complexes peuvent perturber la structure des tissus, générer une coloration de fond élevée ou diminuer les interactions anticorps-épitopètes, ce qui entraîne la coloration d'artefacts et, par conséquent, une mauvaise interprétation des Données du CSI⁴. Comme la rétine des vertébrés est un organe neuronal complexe et très organisé composé de strates de photorécepteurs interconnectés, d'interneurones et de cellules ganglionnaires, il est très fragile et peut être facilement perturbé lors de la dissection et de la section. Un protocole détaillé, normalisé et validé, de la dissection et de l'orientation des yeux de souris à l'immunostaining, aidera à réduire considérablement les artefacts du CiSE, ce qui augmentera la fiabilité des résultats et permettra d'obtenir des données comparatives plus précises. analyse.

Il existe de nombreux protocoles pour la préparation des tissus pour le CiSE, cependant, tous ne sont pas adaptés pour le tissu rétinien. Des fixatifs solides comme la formaline de 10 % ou la solution de Bouin préservent la structure rétinienne pendant la dissection et la section⁵. Malheureusement, les fixatifs forts mènent souvent à la fluorescence de fond amélioréeet au masquage d'épitope dû à la modification chimique des épitopes 6. D'autre part, des fixatifs plus doux, comme le paraformaldéhyde (PFA) de 4 %, peuvent soulager certains de ces artefacts, mais nécessitent une dissection méticuleuse et des sections pour préserver la structure rétinienne optimale. PfA pénètre rapidement les tissus, mais les protéines transversales très lentement, réduisant le risque de masquage épitope. Étant donné que l'incubation de PFA de courte durée est une fixation relativement légère, les tissus nécessitent souvent une congélation rapide pour préserver les antigènes. Il est important d'éviter la formation de cristaux de glace pendant la congélation des tissus car ils déforment et endommagent l'intégrité des cellules et des tissus⁷.

Ici nous décrivons des protocoles détaillés et normalisés pour la dissection, la fixation, et la cryo-protection des tasses postérieures oculaires de souris qui donnent des données cohérentes et fiables de IHC.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été mises en œuvre dans le strict respect des recommandations du Guide national des instituts de santé pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire fournis par l'Institut des ressources animales de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Pennsylvanie.

Tous les outils et équipements pour les méthodes sont indiqués à la figure 1 et énumérés dans le tableau des matériaux.

1 . Enucleation d'oeil de souris, dissection de tasse d'oeil, et incorporation

1. Euthanasier les souris avec du dioxyde de carbone (CO₂) suivie soit de la décapitation (souris postnatales P0 - P11) ou de la dislocation cervicale (souris adultes .Gt;P11). Pour les souris P0-P14, les yeux sont couverts par la peau. Assurez-vous d'enlever la peau avant les étapes suivantes.
2. Marquer la partie temporelle de l'œil (Figure 2A) en brûlant légèrement la cornée à l'aide d'un cautérisateur pour la queue. Évitez de brûler un trou dans la cornée en touchant la cornée très légèrement et pour pas plus d'une fraction de seconde avec le cautérisateur.
3. Enucleate immédiatement les yeux de souris en utilisant courbé Dumont #5/45 forceps. Incuber 15 min dans un tube cryotube de 1,5 ml avec 1 ml de paraformaldéhyde (PFA) de 4 % dans de la saline tamponnée en phosphate (PBS) sur la glace.
4. Après 15 min en 4 % de PFA, transférez l'œil fixe à l'aide des forceps courbes Dumont #5/45 à un plat de dissection modifié de 35 mm (voir Tableau des matériaux et Figure 1C)rempli de PBS et placez-le sous microscope disséquant.
5. Faire une petite incision à la marque de brûlure, perpendiculaire à et juste au-dessus du limbe (frontière de la cornée) à l'aide du micro couteau.
6. Insérez les ciseaux incurvés dans l'incision et effectuez une coupe circonférence de la cornée après le limbus (Figure 2B).
7. Retirez la cornée et extrayez la lentille avec un mince Dumont #5 forceps, (Figure 2B) et soulevez-la délicatement loin de la partie postérieure de l'œil. Le corps vitré, le gel clair qui remplit l'espace entre la lentille et la rétine, sortira avec la lentille (Figure 2B) et la rétine sera visible comme une surface blanche couvrant l'intérieur de la tasse oculaire postérieure. Assurez-vous qu'il n'y a pas de dommages visibles à la rétine, comme des trous ou des déchirures (figure 2C).
8. Laver les gobelets deux fois en 1 ml de PBS pendant 10 min à température ambiante.
9. Cryoprotégez les tasses pour les yeux en les équilibrant dans une solution de 15% de saccharose en PBS pendant la nuit à 4 oC jusqu'à ce que la tasse pour les yeux coule
10. Transférer les gobelets oculaires à 30% de saccharose en PBS pendant 2-3 h jusqu'à ce que la tasse d'oeil coule.
11. Intégrez les gobelets en OCT dans des cryomolds de 10 x 10 mm (Figure 3A). À l'aide d'un microscope à disséquer, orientez l'œil dans le cryomold le long de son axe dorsal-ventral (Figure 2D, Figure 3A) en tournant l'œil jusqu'à ce que la marque de brûlure soit sur le dessus, le nerf optique est sur la gauche et la partie découpée du moule fait face à la droite ( Figure 2D). Prenez soin d'éviter les bulles près du tissu.
    REMARQUE : Pour manipuler la tasse d'oeil, utilisez une sonde de titane faite d'un fil de titane attaché à une pointe de pipette.
12. Pour congeler le tissu rétinien, immerger le cryomold pendant au moins 5 min dans un bécher métallique contenant de l'isopentane et placer le bécher dans de l'azote liquide ou de la glace sèche/100% de bain d'éthanol (jusqu'à 1/3 de la hauteur du bécher en métal).
    REMARQUE : Le cryomold doit être immergé dans l'isopentane à plus de la moitié de sa hauteur, mais ne doit pas être complètement submergé.
13. Retirer le bloc congelé et l'envelopper dans du papier d'aluminium.
14. Conserver à -80 oC.
15. Marquez le bloc gelé à l'aide d'un stylo ou d'un sharpie pour enregistrer l'orientation du bloc (Figure 3B).

2 . Sectionàr à l'aide d'un cryostat

1. Après ajustement de la température du cryostat (entre -20 et -25 oC), laissez les moules contenant les gobelets pour les yeux intégrés à l'équilibre à la température du cryostat pendant 1 h.
2. Installez le bloc avec l'orientation dorso-ventrale (figure 3C) et coupez 10 sections de série d'épaisseur de 10 m. Placez soigneusement les sections rétiniennes sur des lames de microscope annotées et numérotées.
3. Conservez les diapositives dans des boîtes à glissière à -20 oC ou à 80 oC jusqu'aux procédures du CSI.

5 h Immunostaining de fluorescence utilisant le glissière

REMARQUE : Le système slide Rack (p. ex. Sequenza) tient les lames de microscope en verre avec une plaque de couverture, créant ainsi un espace capillaire de 100 livres et un trou entre la glissière et la plaque.

1. Décongeler les cryosections à température ambiante (RT) de 2 h à 4 h pour les laisser sécher et les attacher aux lames de microscope.
   REMARQUE : Il est également possible de les sécher à 30-37 oC pendant 30 min à 1 h.
2. Placez les glissières dans slide Rack et lavez les sections rétiniennes deux fois en 100-200 L PBS pendant 2 min.
3. Perméabilisez les sections rétiniennes en les incubant dans 0.25% Triton-X / 0.05% NaN₃dans PBS pendant 5 min à RT.
4. Ajouter 100 l de solution de blocage aux diapositives.
5. Ajouter 100 l d'anticorps primaires dilués dans la solution de blocage des diapositives.
6. Incuber les sections rétiniennes pendant la nuit à 4 oC.
   REMARQUE : Pendant ce temps, couvrez le slide Rack pour éviter la dessiccation des sections.
7. Laver les sections rétiniennes 3 fois, chacune pendant 15 min, à l'aide de 200 L DEPBS.
   REMARQUE: L'ajout de 0,001- 0,002% Triton-X100 à PBS (PBS-T) permettent un lavage plus rigoureux, mais peut perturber certaines membranes et les structures cellulaires.
8. Incuber les sections rétiniennes dans des anticorps secondaires fluorescents pendant 1 h à RT. Dorénavant, protégez-vous de la lumière.
9. Laver les sections rétiniennes 3 fois, chacune pendant 15 min.
10. Incuber les sections rétiniennes à RT pendant 5 min avec un marqueur nucléaire tel que Hoechst 33342 ou la solution DAPI.
11. Laver les sections rétiniennes 1 fois pendant 15 min.
12. Placez un bordereau sur une serviette en papier sur le banc du laboratoire.
13. Ajouter 2 gouttes de supports de montage anti-fading au centre de la couverture.
14. Retournez la glissière pour que la cryosection rétinienne soit orientée vers le bas.
15. Montez soigneusement la glissière de couverture lentement, à un angle de 45 degrés, faites pencher la glissière sur le support de montage.
    REMARQUE : Éviter de former des bulles lorsque vous abaissez la glissière en place.
16. Appliquer une pression uniforme, à l'aide d'un livre ou d'un catalogue lourd (voir ci-dessous), sur la combinaison slide-coverslip pour éliminer l'excès de supports de montage.
    REMARQUE : Pour assurer la cohérence dans la préparation de l'échantillon, utilisez toujours le même objet (c.-à-d. le même livre ou catalogue) pour appliquer une pression uniforme sur la glissière pendant le montage de la diapositive.
17. Garder à plat et laisser durcir toute la nuit à RT dans l'obscurité. Stockez les toboggans à plat à 4 oC indéfiniment.
18. Image via un champ large ou une microscopie à fluorescence confocale (figure 4).

Representative Results

Pour illustrer comment ces protocoles, assurer la conservation rétinienne optimale pour IHC, nous avons sondé les sections rétiniennes des souris P28 WT (C57BL/6N) avec des anticorps à la rhodopsine (un marqueur photorécepteur)⁸, décarboxylase d'acide glutamique 65 (Gad65, cellule amacrine marqueur)⁹, la glutamine synthetase (GS, un marqueur cellulaire de M-ller)¹⁰, et la calbindine (un marqueur cellulaire horizontal)¹¹ (Figure 4). IHC indiquent que nos protocoles donnent constamment des sections rétiniennes de haute qualité et bien conservées. Notamment, les segments intérieurs et externes riches en rhodopsine restent verticaux et intacts avec peu ou pas de séparation de la sous-couche de l'épithélium pigmenté rétinien (RPE) (Figure 4A). En outre, les cellules de la marque restent bien conservées avec des processus soma correctement alignés et cytoplasmiques qui s'étendent de la couche cellulaire ganglionnaire (GCL) à la couche nucléaire externe (ONL) (Figure 4B).

Les interneurones, tels que les cellules amacrine séropositives Gad65, restent également correctement stratifiés dans la couche INL et la couche plexiforme interne (IPL) (Figure 4B) tandis que les cellules horizontales bien définies sont détectables à l'INL et au plexiforme externe bordure de couche (OPL) (figure 4C). Collectivement, ces données démontrent que notre méthode préserve l'intégrité des cellules et des tissus rétiniens, des photorécepteurs aux cellules ganglionnaires

Pour faciliter la section transversale, il est important d'orienter méticuleusement la tasse optique dans le cryo-moule avant la congélation. Les rétines mal orientées, la mauvaise technique de sectionnement ou le sectionnement avec des couteaux microtomes ternes ou endommagés peuvent causer des artefacts tels que des déchirures de tissu rétinien, des distorsions et le déplacement cellulaire, comme dans la figure 4. Des exemples d'artefacts de section sont montrés dans Figure 4D-F. Dans la figure 4D, une mauvaise section et un alignement entraînent une distorsion des segments intérieurs et externes des photorécepteurs (figure 4D) et de petites déchirures tissulaires (figure4E, flèche). Dans un autre exemple, une mauvaise orientation tissulaire avant la section conduit à un alignement sous-optimal du soma cellulaire Muller et des processus cytoplasmiques Figure 4E. La figure 4F montre comment une mauvaise section probablement causée par un couteau microtome terne a causé des cellules horizontales à un frottis aberrant de la BPO à la LCM. Ainsi, une attention précise doit être accordée à l'exécution de chaque étape décrite dans le protocole afin d'assurer la plus haute qualité et la reproductibilité des données du CIS.

Figure (en) 1 Fois : Outils pour la dissection des yeux de souris, l'intégration et le CSI. (A) Cautérisateur; (B) Outils de dissection de gauche à droite : forceps courbes Dumont #5/45, ciseaux courbés et #5 de minces forceps; (C) plat de dissection de 35 mm (points de flèche à la chambre de dissection); (D) Microscope disséquer; (E) Outils congelés de gauche à droite : refroidisseur isolé, bécher en acier inoxydable pour bain isopentane, bain liquide en acier inoxydable N 2; (F) sonde en titane; (G) Slide Rack et Coverplate pour IHC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure (en) 2 (en) : Orientation et description de tasse d'oeil de souris. (A) Emplacement de la marque de brûlure temporelle (flèche rouge) pour faciliter l'orientation des yeux (dorso et D, ventral, V, temporel, T, nasal et N). (B) Schéma tique pour la dissection des yeux de souris. Une petite incision est faite à la marque de brûlure, perpendiculaire dans la cornée et juste au-dessus du limbe à l'aide d'un scalpel fin (Micro couteau). Couper autour de la cornée pour séparer la partie antérieure et postérieure de l'œil. (C) Coupe pour les yeux avec une rétine intacte. (D) Orientation dorso-ventrale de l'œil de souris avec le nerf optique (ON), lentille (L), cornée (C) le limbus (OS). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure (en) 3 (en) : L'encastrement des yeux de souris. (A) Coupe d'oeil orientée dorso-ventral de souris dans le cryomold rempli de CUC, (B) tasse rétinienne congelée de souris dans le cryomold annoté. (C) Cryostat. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure (en) 4 ( en plus) : Immunohistochimie de rétine de souris. (A-C) Des sections rétiniennes de bonne qualité et (D-F) de mauvaise qualité de P28 WT ont été étiquetées avec des anticorps au marqueur d'amacrine de rhodopsine (A, C) GAD65 (B, E) et à la synthétase de glutamine de marqueur cellulaire de M-ller (GS ; B, E), et la calbindin eillitale de marqueur cellulaire horizontal (C, F). Les flèches blanches pointent vers les déchirures de tissu et le frottis aberrant du tissu. Barre à l'échelle, 20 m. Nuclei étiqueté avec Hoechst 33342 (bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

La dissection de la rétine de la souris est un processus délicat en raison de la petite taille et la forme des yeux de souris et de la fragilité du tissu rétinien. Même si la dissection de haute qualité est une question de pratique, avoir un protocole détaillé, fournir des méthodes et des conseils efficaces est une nécessité pour obtenir des sections rétiniennes et IHC. En plus des protocoles décrits ici, il y a plusieurs bouts qui tiennent des sections rétiniennes cohérentes de haute qualité qui conviennent au CiSE reproductible.

Avant de commencer avec la dissection, il est important d'être confortable, détendu et de régler l'éclairage de la pièce pour une vision optimale pendant la microdissection des yeux de souris. Pour maintenir la forme de tasse d'oeil de souris tout en disséquant l'oeil, nous suggérons de garder des yeux immergés dans PBS dans les plats faits faits sur commande de dissection cire-enduite. Nous vous suggérons d'enrober un plat de dissection de 35mm avec de la cire dentaire de couleur rose clair (Figure 1C). En effet, la couleur rose clair de la cire dentaire offre un contraste adéquat pour voir facilement les structures oculaires sous une portée de dissection, les impressions de la taille des yeux dans la cire, faite en appuyant sur la base de tubes de microfuge dans la cire, gardera la tasse d'oeil en place tandis que permettant la rotation appropriée des outils autour de la tasse d'oeil pendant la dissection. En outre, il est important d'enlever autant de liquide vitré de la tasse d'oeil que possible tout en enlevant la lentille, car le fluide vitreux résiduel est enclin à former des cristaux de glace de tissu endommageant pendant l'étape de congélation de bloc de tissu. Nous utilisons généralement un papier de soie et le plaçons à la bordure de la tasse disséquée d'oeil, pour enlever soigneusement tout le fluide vitreux restant par capillaire sans déranger le tissu de rétine. Dans le cas malheureux où une petite quantité de liquide vitré résiduel est encore présente dans la tasse pour les yeux, la section doit être effectuée à -20 oC afin de réduire la transformation du vitré dans la glace et donc de préserver la netteté de la lame et la qualité de la sectionnement .

Les méthodes de fixation et d'intégration ont également un impact majeur sur la qualité des sections et du CSI. Bien que les sections paraffines fixées paraffines de formaline donnent l'intégrité structurale optimale du tissu d'oeil, la formaline contient le méthanol qui peut augmenter la fluorescence de fond. Pour éviter ces artefacts, nous recommandons d'utiliser le paraformaldéhyde frais de qualité EM (PFA) pour limiter le fond et l'autofluorescence causées par le méthanol ou la PFA oxydée^4,5,6. Nous recommandons les conditions douces de fixation décrites dans notre protocole fixant l'oeil avec le paraformaldehyde de 4% pendant 15 min sur la glace. Puisque pfA pénètre rapidement le tissu, mais les protéines de croisement très lentement, ces conditions sont suffisantes pour préserver l'intégrité structurale rétinienne pendant la dissection et préserver l'antigénicité des antigènes rétiniens communs sans besoin d'antigène méthodes de récupération⁴. Si la structure de la rétine n'est pas bien préservée, la durée de fixation de pfA peut être augmentée, cependant il est important d'être conscient que les tissus sur-fixant augmenteront la fluorescence de fond non spécifique et peuvent mener au masquage d'épitope, tout en sous-fixant les tissus peuvent compromettre l'intégrité structurale du tissu et causer la perte de certains antigènes enclins à la dégradation protéolytique. Étant donné que l'incubation de PFA de courte durée est une fixation relativement légère, nous recommandons également des rétines qui gèlent en trempant l'œil intégré à l'OCT, contenu dans un cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm), dans un bain d'isopentane immergé dans de l'azote liquide. Les tissus de congélation de Snap préserveront les antigènes, tandis que la solution de saccharose et l'OCT agiront comme cryo-protecteurs. Cette méthode permettra de réduire la distorsion du tissu due à la formation de cristaux de glace, ce qui peut causer le type de fromage suisse de dommages aux tissus. Le cryomold ne doit pas être trempé directement dans de l'azote liquide ou il va commencer à bouillir, formant une barrière de vapeur et qui ralentira le processus de congélation, résultant en une fixation hétérogène et la préservation. En outre, le tissu et l'OCT en contact avec l'azote liquide peuvent se fissurer, affectant ainsi l'intégrité de l'œil⁷. Nous recommandons donc de tremper le cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) dans un isopentane de plus de 5 mm de profondeur à l'aide d'un petit bécher en acier inoxydable, lui-même trempé dans un plus grand bécher en acier inoxydable (100 mm de large minimum) contenant de l'azote liquide. Pour éviter l'évaporation rapide de l'azote liquide lors de la préparation de plusieurs échantillons, nous gardons les deux bains dans une glacière isolée. Il convient de noter que la cryoconservation des tissus dans oct n'est pas une méthode de préservation à long terme, en raison de la formation de cristaux de glace dans le tissu au fil du temps qui peut modifier la morphologie subcellulaire et / ou dénaturer certains antigènes. Par conséquent, les blocs de tissus et les sections congelées doivent être entreposés à -20 oC pour un stockage à court terme et pour un stockage à long terme de -80 oC.

La rétine mammifère est un organe asymétrique avec une distribution spatiale spécifique des cellules à travers les axes temporal-nasal et dorso-ventral. Par exemple, les cônes M- et S-opsin sont disposés dans un gradient dorso-ventral spécifique ¹². Par conséquent, il est essentiel d'assurer une bonne orientation de l'œil tout au long de la préparation des tissus et de la section afin d'effectuer un CiSE comparatif. Nous utilisons un cautérisateur pour placer une marque de référence sur l'œil avant la dissection (Figure 2A, D) afin que nous puissions orienter la tasse d'oeil le long de son axe dorsal-ventral pendant la phase d'intégration, et donc obtenir des sections parfaitement transversales. Nous plaçons la marque de brûlure sur la partie dorso-temporelle de l'œil, en touchant la cornée pendant une fraction de seconde avec le cautérisateur. Cela permettra de brûler légèrement la cornée tout en évitant de percer un trou en elle. Pendant la dissection de la tasse oculaire, nous faisons une petite incision, à la marque de brûlure, perpendiculaire à la bordure de la cornée, à l'aide du micro couteau (Figure 2B). Pour faciliter l'orientation dorso-ventrale du bloc et minimiser les ajustements d'orientation pendant le sectionnement, nous vous suggérons d'orienter parfaitement la tasse oculaire postérieure dans le cryomold, avec la marque de brûlure faisant face au fond du cryomold et l'ouverture de la cornée parfaitement parallèle du côté droit du cryomold (Figure 3A, B). Le bloc gelé sera installé avec le fond du bloc orienté vers la lame dans le cryostat, la coupe oculaire perpendiculaire à la lame, dans une orientation dorso-ventrale (Figure 3c).

La rétine fiable IHC commence par des dissections optimales, adaptées et reproductibles et le traitement des tissus. La méthode décrite ici préserve de façon optimale la structure et l'intégrité de la rétine tout en minimisant l'autofluorescence et le masquage épitope qui peuvent compromettre le Ci-Dessus fluorescent. Le respect de ce protocole vous permettra d'avoir des données reproductibles de haute qualité.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods