Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Summary

Dieser Bericht beschreibt umfassende Methoden zur Vorbereitung von gefrorenen Mausnetzteilen für die Immunhistochemie (IHC). Die beschriebenen Methoden umfassen die Zerlegung des okularen posterioren Bechers, die Paraformaldehydfixierung, die Einbettung in die Medien der optimalen Schnitttemperatur (OCT) und die Gewebeorientierung, die Schnitt- und Immunfärbung.

Abstract

Die Vorbereitung hochwertiger Mausaugenabschnitte für die Immunhistochemie (IHC) ist entscheidend für die Beurteilung der Netzhautstruktur und -funktion und für die Bestimmung der Mechanismen, die Netzhauterkrankungen zugrunde liegen. Die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität während der gesamten Gewebepräparation ist für die Gewinnung reproduzierbarer retinaler IHC-Daten von entscheidender Bedeutung, kann aber aufgrund der Fragilität und Komplexität der retinalen Zytoarchitektur eine Herausforderung darstellen. Starke Fixative wie 10% Formalin oder Bouins Lösung bewahren die Netzhautstruktur optimal, sie behindern oft die IHC-Analyse, indem sie die Hintergrundfluoreszenz und/oder die abnehmenden Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen verbessern, ein Prozess, der als Epitopmaskierung bekannt ist. Milderfixative hingegen, wie 4% Paraformaldehyd, reduziert Die Hintergrundfluoreszenz und Epitopmaskierung, sorgfältige Seziertechniken müssen verwendet werden, um die Netzhautstruktur zu erhalten. In diesem Artikel stellen wir eine umfassende Methode zur Vorbereitung von Maus-Okularbechern für IHC vor, die ausreicht, um die meisten Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen ohne Verlust der strukturellen Integrität der Netzhaut zu erhalten. Wir schließen repräsentative IHC mit Antikörpern gegen verschiedene Netzhautzelltypmarker ein, um die Gewebeerhaltung und -orientierung unter optimalen und suboptimalen Bedingungen zu veranschaulichen. Unser Ziel ist es, IHC-Studien der Netzhaut zu optimieren, indem wir ein komplettes Protokoll von der okularen hinteren Bechersektion bis zum IHC bereitstellen.

Introduction

Immunohistochemistry (IHC) ist eine leistungsfähige Technik zur Lokalisierung spezifischer Proteine und zellulärer Strukturen in Geweben in situ^1,2,3. Ungeeignete Fixierungsmethoden und suboptimale Schnitte komplexer Gewebe können die Gewebestruktur stören, eine hohe Hintergrundfärbung erzeugen oder Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen verringern, was zu Färbeartefakten und daraus resultierender Fehlinterpretation von IHC-Daten⁴. Da die Netzhaut des Wirbeltiers ein komplexes und hochorganisiertes neuronales Organ ist, das aus Schichten miteinander verbundener Photorezeptoren, Interneuroner und Ganglienzellen besteht, ist es sehr zerbrechlich und kann leicht während der Zerlegung und Schnitte gestört werden. Ein detailliertes, standardisiertes und validiertes Protokoll von der Mausaugensektion und -orientierung bis zur Immunfärbung wird dazu beitragen, IHC-Artefakte deutlich zu reduzieren, wodurch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse erhöht und genauere Vergleichsdaten möglich sind. analyse.

Es gibt viele Protokolle für die Gewebevorbereitung für IHC, jedoch sind nicht alle für Netzhautgewebe geeignet. Starke Fixative wie 10% Formalin oder Bouin-Lösung bewahren die Netzhautstruktur während der Zerlegung und Schnittung⁵. Leider führen starke Fixative oft zur verstärkten Hintergrundfluoreszenz und Epitopmaskierung aufgrund der chemischen Modifikation von Epitopen⁶. Auf der anderen Seite können mildere Fixative, wie 4% Paraformaldehyd (PFA), einige dieser Artefakte lindern, erfordern aber eine sorgfältige Zerlegung und Schnitte, um die optimale Netzhautstruktur zu erhalten. PFA dringt schnell in Gewebe ein, aber Kreuz-Links-Proteine sehr langsam, wodurch das Risiko der Epitopmaskierung reduziert wird. Da die PFA-Inkubation in kurzer Zeit eine relativ milde Fixierung ist, benötigen Gewebe oft schnelles Einfrieren, um Antigene zu erhalten. Es ist wichtig, die Bildung von Eiskristallen beim Einfrieren des Gewebes zu vermeiden, da sie die Integrität von Zellen und Geweben verzerren und schädigen⁷.

Hier beschreiben wir detaillierte und standardisierte Protokolle für Sezieren, Fixierung und Kryoschutz von Maus-Okularbechern, die konsistente und zuverlässige IHC-Daten liefern.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt, der vom Institut für Labortierressourcen zur Verfügung gestellt wurde, und wurden von der Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania.

Alle Werkzeuge und Geräte für die Methoden sind in Abbildung 1 dargestellt und in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

1 . Mausaugenenukleation, Augenbechersezieren und Einbetten

1. Euthanisieren Sie Mäuse mitKohlendioxid (CO2 ), gefolgt von enthaupteten (postnatale Mäuse P0 - P11) oder zervikale Dislokation (Erwachsene >P11 Mäuse). Bei P0-P14-Mäusen sind die Augen von Haut bedeckt. Stellen Sie sicher, dass die Haut vor den nachfolgenden Schritten entfernt wird.
2. Markieren Sie den zeitlichen Teil des Auges (Abbildung 2A), indem Sie die Hornhaut leicht mit einem Schwanzkauterisierer verbrennen. Vermeiden Sie es, ein Loch in der Hornhaut zu verbrennen, indem Sie die Hornhaut sehr leicht und für nicht mehr als eine Sekunde mit dem Kauterizer berühren.
3. Entführen Sie sofort Mausaugen mit gebogenen Dumont #5/45 Zangen. 15 min in einem 1,5 ml Kryoröhrenrohr mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Salin (PBS) auf Eis inkubieren.
4. Nach 15 min in 4% PFA das fixierte Auge mit den gekrümmten Zangen Dumont #5/45 auf eine modifizierte 35 mm Sezierschale (siehe Materialtabelle und Abbildung 1C) mit PBS gefüllt und unter sezierendes Mikroskop platzieren.
5. Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Brennzeichen, senkrecht zu und knapp über dem Limbus (Grenze der Hornhaut) mit dem Mikromesser.
6. Setzen Sie die gekrümmte Schere in den Schnitt ein und führen Sie einen Umfangsschnitt der Hornhaut nach dem Limbus durch (Abbildung 2B).
7. Entfernen Sie die Hornhaut und extrahieren Sie die Linse mit einem dünnen Dumont #5 Zange , (Abbildung 2B) und heben Sie es zart weg von der hinteren Teil des Auges. Der Glaskörper, das klare Gel, das den Raum zwischen der Linse und der Netzhaut füllt, wird mit der Linse herauskommen (Abbildung 2B) und die Netzhaut wird als weiße Oberfläche sichtbar sein, die die Innenseite der hinteren Augentasse bedeckt. Stellen Sie sicher, dass keine sichtbaren Schäden an der Netzhaut, wie Löcher oder Risse (Abbildung 2C) vorhanden sind.
8. Waschen Sie die Augenbecher zweimal in 1 ml PBS für 10 min bei Raumtemperatur.
9. Kryoschützen Sie die Augenbecher, indem Sie sie in einer Lösung von 15% Saccharose in PBS über Nacht bei 4 °C ausgrenzen, bis die Augentasse sinkt
10. Übertragen Sie die Augenbecher auf 30% Saccharose in PBS für 2-3 h, bis die Augentasse sinkt.
11. Die Augenmuscheln in OCT in 10 x 10 mm Kryomolden einbetten (Abbildung 3A). Mit einem Sezieren Mikroskop, orientieren Sie das Auge in der Kryomold entlang seiner dorsal-ventralen Achse (Abbildung 2D, Abbildung 3A) durch Drehen des Auges, bis die Brandmarke auf der Oberseite ist, der Sehnerv ist auf der linken Seite und der ausgeschnittene Teil der Form zeigt sich nach rechts ( Abbildung 2D). Achten Sie darauf, Blasen in der Nähe des Gewebes zu vermeiden.
    HINWEIS: Um den Augenbecher zu manipulieren, verwenden Sie eine Titansonde aus einem Titandraht, der an einer Pipettenspitze befestigt ist.
12. Um Netzhautgewebe zu einfrieren, tauchen Sie den Kryomold mindestens 5 min in ein Metallbecher mit Isopentan ein und legen Sie das Becherglas in flüssigen Stickstoff oder Trockeneis/100% Ethanolbad (bis zu 1/3 der Höhe des Metallbechers).
    HINWEIS: Der Kryomold sollte in Isopentan emittan e,Isopentane bis zur Hälfte seiner Höhe eingetaucht werden, muss aber nicht vollständig untergetaucht werden.
13. Entfernen Sie den gefrorenen Block und wickeln Sie ihn in Aluminiumfolie.
14. Bei -80 °C lagern.
15. Markieren Sie den eingefrorenen Block mit einem Stift oder Sharpie, um die Ausrichtung des Blocks aufzuzeichnen (Abbildung 3B).

2 . Schnitt mit einem Kryostat

1. Nach der Einstellung der Kryostattemperatur (zwischen -20 und -25 °C) lassen Sie die Formen, die die eingebetteten Augenbecher enthalten, 1 h auf die Kryostattemperatur ausgrenzen.
2. Installieren Sie den Block mit dorso-ventraler Ausrichtung (Abbildung 3C) und schneiden Sie 10 m dicke serielle Abschnitte. Platzieren Sie die Netzhautabschnitte vorsichtig auf kommentierten und nummerierten Mikroskopdias.
3. Lagern Sie Dias in Diaboxen bei -20 °C oder -80 °C, bis IHC-Verfahren durchgeführt werden.

3 . Fluoreszenz-Immunostainierung mit dem Slide Rack

HINWEIS: Das Slide Rack-System (z. B. Sequenza) hält die Glasmikroskop-Dias mit einer Abdeckplatte, wodurch ein Kapillarspalt von 100 L zwischen dem Schlitten und der Platte entsteht.

1. Die Kryo-Sektionen bei Raumtemperatur (RT) für 2 h bis 4 h auftauen, damit sie trocknen und an Mikroskopschlitten befestigen können.
   HINWEIS: Es ist auch möglich, sie bei 30-37 °C für 30 min bis 1 h zu trocknen.
2. Legen Sie Dias in Slide Rack und waschen Sie die Netzhautabschnitte zweimal in 100-200 L PBS für 2 min.
3. Permeabilisieren Sie die Netzhautabschnitte, indem Sie sie in 0,25% Triton-X / 0,05% NaN₃in PBS für 5 min bei RT inkubieren.
4. Fügen Sie den Folien eine Blockierlösung mit 100 L hinzu.
5. Fügen Sie den Dias 100 L primärer Antikörper hinzu, der in einer Blockierenden Lösung verdünnt wird.
6. Retinalabschnitte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Während dieser Zeit decken Sie das Slide Rack ab, um eine Austrocknung der Abschnitte zu vermeiden.
7. Waschen Sie die Netzhautabschnitte 3 Mal, jeweils für 15 min, mit 200 L PBS.
   HINWEIS: Die Zugabe von 0,001- 0,002% Triton-X100 zu PBS (PBS-T) ermöglicht eine strengere Wäsche, kann aber einige Membranen und zelluläre Strukturen stören.
8. Inkubieren Sie Netzhautabschnitte in fluoreszierend-markierten sekundären Antikörpern für 1 h bei RT. Von nun an vor Licht schützen.
9. Waschen Sie die Netzhautabschnitte 3 mal, jeweils für 15 min.
10. Inkubieren Sie die Netzhautabschnitte bei RT für 5 min mit einem Kernmarker wie Hoechst 33342 oder DAPI-Lösung.
11. Waschen Sie die Netzhautabschnitte 1 Mal für 15 min.
12. Legen Sie einen Deckelaufschlag auf ein Papiertuch auf die Laborbank.
13. Fügen Sie 2 Tropfen anti-fading Montagemedien in die Mitte des Coverslip.
14. Drehen Sie die Rutsche um, um den Retina-Kryo-Abschnitt nach unten zu haben.
15. Montieren Sie den Deckelrutsch vorsichtig langsam, in einem Winkel von 45°, kippen Sie den Schlitten auf das Montagemedium.
    HINWEIS: Vermeiden Sie das Bilden von Blasen, wenn Sie die Folie an Ort und Stelle senken.
16. Tragen Sie mit einem schweren Buch oder Katalog (siehe unten) gleichmäßigen Druck auf die Slide-Coverslip-Kombination, um überschüssige Montagemedien zu vermeiden.
    HINWEIS: Um die Konsistenz bei der Probenvorbereitung zu gewährleisten, verwenden Sie immer dasselbe Objekt (d. h. dasselbe Buch oder denselben Katalog), um während der Schiebemontage gleichmäßigen Druck auf den Deckelzuschlag auszuüben.
17. Flach halten und bei RT im Dunkeln über Nacht aushärten lassen. Dias bei 4 °C auf unbestimmte Zeit flach lagern.
18. Bild über Weitfeld- oder konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 4).

Representative Results

Um zu veranschaulichen, wie diese Protokolle eine optimale Netzhautkonservierung für IHC gewährleisten, untersuchten wir Netzhautabschnitte von P28 WT-Mäusen (C57BL/6N) mit Antikörpern gegen Rhodopsin (ein Photorezeptormarker)⁸, Glutaminsäure-Decarboxylase 65 (Gad65, eine Marker)⁹, Glutamin-Synthetase (GS, ein Müller-Zellmarker)¹⁰und Calbindin (ein horizontaler Zellmarker)¹¹ (Abbildung 4). IHC zeigen, dass unsere Protokolle durchweg qualitativ hochwertige und gut erhaltene Netzhautabschnitte ergeben. Bemerkenswert ist, dass die rhodopsinreichen inneren und äußeren Segmente vertikal und intakt bleiben, ohne dass sich das retinale pigmentierte Epithel (RPE) von der Überlage des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) trennt (Abbildung 4A). Darüber hinaus bleiben Müller-Zellen gut erhalten mit soma richtig ausgerichteten und zytoplasmatischen Prozessen, die sich von der Ganglienzellschicht (GCL) bis zur äußeren Kernschicht (ONL) erstrecken (Abbildung 4B).

Interneuronen, wie Gad65-positive Amacrinzellen, bleiben auch innerhalb der INL- und inneren Plexiformschicht (IPL) (Abbildung 4B) ordnungsgemäß geschichtet, während gut definierte horizontale Zellen an der INL- und äußeren Plexiform nachweisbar sind. (OPL) Rahmen (Abbildung 4C). Zusammen zeigen diese Daten, dass unsere Methode die Integrität von Netzhautzellen und Geweben bewahrt, von Photorezeptoren bis hin zu Ganglienzellen

Um das Querschnitt zu erleichtern, ist es wichtig, den optischen Becher in der Kryoform vor dem Einfrieren akribisch zu orientieren. Fehlorientierte Netzhaut, schlechte Schnitttechnik oder Schnitte mit stumpfen oder beschädigten Mikrotommessern können Artefakte wie Netzhautgeweberisse, Verzerrungen und Zellverschiebung verursachen, wie in Abbildung 4. Beispiele für Schnittartefakte sind in Abbildung 4D-Fdargestellt. In Abbildung 4D führen schlechte Schnitte und Ausrichtung zu Photorezeptor-Innen- und Außensegmentverzerrungen (Abbildung 4D) und kleinen Geweberissen (Abbildung 4E, Pfeil). In einem anderen Beispiel führt eine schlechte Gewebeorientierung vor dem Abschnitt zu einer suboptimalen Ausrichtung des Muller-Zellsomas und der zytoplasmatischen Prozesse Abbildung 4E. Abbildung 4F zeigt, wie eine schlechte Schnittung, die wahrscheinlich durch ein stumpfes Mikrotommesser verursacht wird, dazu führte, dass horizontale Zellen von der OPL in die GCL abschmierten. Daher muss genau auf die Ausführung jedes im Protokoll beschriebenen Schritts geachtet werden, um die höchste Qualität und Reproduzierbarkeit der IHC-Daten zu gewährleisten.

Abbildung 1 : Werkzeuge für Mausaugenssektion, Einbettung und IHC. (A) Cauterizer; (B) Sezierwerkzeuge von links nach rechts: Dumont #5/45 gekrümmte Zangen, gekrümmte Scheren und Dumont #5 dünne Zangen; (C) 35 mm Sezierschale (Pfeil zeigt auf Sezierkammer); (D) Sezieren des Mikroskops; (E) Gefrorene Werkzeuge von links nach rechts: Isolierter Kühler, Edelstahlbecher für Isopentanbad, Edelstahlflüssigkeit N₂ Bad; (F) Titansonde; (G) Schiebeträger und Deckplatte für IHC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2 : Maus-Augenbecher-Orientierung und -Beschreibung. (A) Zeitliche Brennmarkierungsposition (roter Pfeil), um die Augenorientierung zu erleichtern (dorso = D, ventral = V, temporal = T, nasal = N). (B) Schemafür die Mausaugensektion. Ein kleiner Schnitt wird an der Brandmarke gemacht, senkrecht in die Hornhaut und knapp über dem Limbus mit einem feinen Skalpell (Mikromesser). Um die Hornhaut schneiden, um den vorderen und hinteren Teil des Auges zu trennen. (C) Augenbecher mit intakter Netzhaut. (D) Dorso-ventrale Ausrichtung des Mausauges mit dem Sehnerv (ON), Linse (L), Hornhaut (C) dem Limbus (OS). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3 : Einbettung von Mausaugen. (A) Dorso-ventral orientierte Mäuse Augentasse in Kryomold gefüllt mit OCT, (B) Gefrorene Maus Netzhautbecher in annotierten Kryomold. (C) Cryostat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4 : Maus-Retina-Immunhistochemie. (A-C) Gute Qualität und (D-F) minderwertige Netzhautabschnitte von P28 WT wurden mit Antikörpern gegen den Rhodopsin (A, C) Amacrine Marker GAD65 (B, E) und den Müller-Zellmarker Glutaminsynthetase (GS; B, E) und horizontale Zellmarker-Calbindin (C, F). Weiße Pfeile weisen auf Geweberisse und abnorme Abstriche des Gewebes hin. Schuppenstange, 20 m. Kerne mit Hoechst 33342 (blau) beschriftet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Maus Netzhaut-Sektion ist ein empfindlicher Prozess aufgrund der geringen Größe und Form der Mausaugen und die Fragilität der Netzhautgewebe. Auch wenn die Durchführung von qualitativ hochwertigen Sezierungen eine Frage der Praxis ist, ist es eine Notwendigkeit, mit einem detaillierten Protokoll effiziente Methoden und Tipps zu erhalten, um Netzhautabschnitte und IHC zu erhalten. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Protokollen gibt es einige Tipps, die konsistente hochwertige Netzhautabschnitte ermöglichen, die für reproduzierbare IHC geeignet sind.

Vor Beginn der Sezieren, ist es wichtig, komfortabel, entspannt zu sein und die Raumbeleuchtung für optimale Sesien während der Maus Auge Mikrosektion einstellen. Um die Form der Mausaugentasse zu erhalten, während das Auge seziert wird, empfehlen wir, die Augen in PBS in maßgeschneiderten, wachsbeschichteten Sezierschalen unterWasser zu halten. Wir empfehlen, eine 35mm Sezierschale mit hellrosa gefärbtem Zahnwachs zu beschichten (Abbildung 1C). In der Tat bietet die hellrosa Farbe des Zahnwachses einen ausreichenden Kontrast, um leicht Augenstrukturen unter einem Sezierbereich zu sehen, die augengroßen Eindrücke im Wachs, die durch Drücken der Basis von Mikrofugenröhren in das Wachs gemacht werden, halten die Augentasse an Ort und Stelle, während die Augenschale an Ort und Stelle gehalten wird, während die entsprechende Drehung der Werkzeuge um den Augenbecher während der Zerlegung. Darüber hinaus ist es wichtig, so viel Glaskörperflüssigkeit wie möglich aus der Augentasse zu entfernen, während die Linse entfernt wird, da Restglasflüssigkeit dazu neigt, gewebeschädigende Eiskristalle während des Gewebeblockgefrierschritts zu bilden. Wir verwenden in der Regel ein Gewebepapier und legen es an den Rand der sezierten Augentasse, um alle verbleibenden Glaskörperflüssigkeiten sorgfältig durch Kapillare zu entfernen, ohne das Netzhautgewebe zu stören. In dem unglücklichen Fall, in dem noch eine geringe Menge an Glaskörperflüssigkeit im Augenbecher vorhanden ist, sollte bei -20 °C geschnitten werden, um die Umwandlung des Glaskörpers in Eis zu reduzieren und somit die Schärfe der Klinge und die Qualität des Schnittes zu erhalten. .

Befestigungs- und Einbettungsmethoden haben auch einen großen Einfluss auf die Qualität der Abschnitte und des IHC. Obwohl formalfixierte Paraffin-eingebettete Abschnitte eine optimale strukturelle Integrität des Augengewebes ergeben, enthält Formalin Methanol, das die Hintergrundfluoreszenz verbessern kann. Um diese Artefakte zu vermeiden, empfehlen wir die Verwendung von frischem Paraformaldehyd (PFA) in EM-Klasse, um Hintergrund- und Autofluoreszenz zu begrenzen, die durch Methanol oder oxidiertes PFA^4,5,6verursacht werden. Wir empfehlen die milden Fixationsbedingungen, die in unserem Protokoll beschrieben sind und das Auge mit 4% Paraformaldehyd für 15 min auf Eis fixieren. Da PFA schnell in das Gewebe eindringt, aber Proteine sehr langsam kreuzt, reichen diese Bedingungen aus, um die strukturelle Integrität der Netzhaut während der Zerlegung zu erhalten und die Antigenität von häufigen retinalen Antigenen zu erhalten, ohne dass Antigen benötigt wird. Abrufmethoden⁴. Wenn die Netzhautstruktur nicht gut erhalten ist, kann die Dauer der PFA-Fixierung erhöht werden, aber es ist wichtig zu beachten, dass überfixierende Gewebe die unspezifische Hintergrundfluoreszenz verbessern und zu Epitopmaskierung führen können, während unterfixiert wird. Gewebe können die strukturelle Integrität des Gewebes beeinträchtigen und den Verlust einiger Antigene verursachen, die anfällig für proteolytische Degradation sind. Da die kurzfristige PFA-Inkubation eine relativ milde Fixierung ist, empfehlen wir auch das Einfrieren von Netzhaut durch Tauchen des OCT-eingebetteten Auges, das in einem Kryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) enthalten ist, in einem isopentane Bad, das in flüssigen Stickstoff getaucht ist. Snap-Freezing-Gewebe bewahren Antigene, während Saccharose-Lösung und OCT als Kryo-Schutzmittel wirken. Diese Methode reduziert die Verzerrung des Gewebes durch die Bildung von Eiskristallen, die die sogenannte Swiss Cheese Art von Gewebeschäden verursachen können. Das Kryomold sollte nicht direkt in flüssigen Stickstoff getaucht werden, oder es beginnt zu kochen, bilden eine Dampfbarriere und das wird den Gefrierprozess verlangsamen, was zu einer heterogenen Fixierung und Konservierung führt. Darüber hinaus können Gewebe und ÜLG in Kontakt mit flüssigem Stickstoff reißen, wodurch die Integrität des Auges^{beeinträchtigt wird 7}. Wir empfehlen daher, den Kryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) in nicht mehr als 5 mm tiefes Isopentan mit einem kleinen Becher aus Edelstahl zu tauchen, der selbst in einen größeren Edelstahlbecher (mindestens 100 mm breit) getaucht ist, der flüssigen Stickstoff enthält. Um eine schnelle Verdunstung des flüssigen Stickstoffs bei der Herstellung mehrerer Proben zu vermeiden, halten wir beide Bäder in einem isolierten Kühler. Es sollte beachtet werden, dass kryokonservierende Gewebe in OCT keine langfristige Konservierungsmethode sind, aufgrund der Bildung von Eiskristallen im Gewebe im Laufe der Zeit, die subzelluläre Morphologie verändern und/oder einige Antigene denaturieren können. Daher sollten Gewebeblöcke und gefrorene Abschnitte bei -20 °C zur kurzfristigen Lagerung und zur Langzeitlagerung von -80 °C gelagert werden.

Die Säugetier-Retina ist ein asymmetrisches Organ mit einer spezifischen räumlichen Verteilung der Zellen über die temporal-nasalen und dorso-ventralen Achsen. Beispielsweise sind M- und S-Opsin-Kegel in einem bestimmten dorso-ventralen Gradienten ¹²angeordnet. Daher ist es wichtig, eine korrekte Orientierung des Auges während der Gewebevorbereitung und -sektion zu gewährleisten, um vergleichende IHC durchzuführen. Wir verwenden einen Kauteriser, um vor der Zerlegung eine Referenzmarkierung auf das Auge zu setzen (Abbildung 2A, D), damit wir den Augenbecher entlang seiner dorsal-ventralen Achse während der Einbettphase ausrichten können und somit perfekt quergeschnittene Abschnitte erhalten. Wir legen das Brandzeichen auf den dorso-zeitlichen Teil des Auges, indem wir die Hornhaut für eine Bruchsekunde mit dem Kauterizer berühren. Dies ermöglicht es, die Hornhaut leicht zu verbrennen, während ein Loch in sie zu vermeiden. Während der Augenbecher-Sektion machen wir einen kleinen Schnitt, an der Brennzeichen, senkrecht zur Grenze der Hornhaut, mit dem Mikromesser (Abbildung 2B). Um die dorso-ventrale Ausrichtung des Blocks zu erleichtern und Orientierungsanpassungen während des Schnitts zu minimieren, empfehlen wir, den hinteren Augenbecher im Kryomold auszurichten, wobei die Brennzeichen auf den Boden des Kryomolds und die Öffnung der Hornhaut perfekt gerichtet sind. parallel zur rechten Seite des Kryomolds (Abbildung 3A, B). Der gefrorene Block wird mit der Unterseite des Blocks in Richtung der Klinge im Kryostat, der Augenbecher senkrecht zur Klinge, in einer dorso-ventralen Ausrichtung installiert (Abbildung 3c).

Zuverlässige Netzhaut-IHC beginnt mit optimalen, angepassten und reproduzierbaren Sezierungen und Gewebeverarbeitung. Die hier skizzierte Methode bewahrt optimal die Netzhautstruktur und -integrität und minimiert gleichzeitig Die Autofluoreszenz und Epitopmaskierung, die fluoreszierenden IHC gefährden können. Wenn Sie dieses Protokoll befolgen, stellen Sie sicher, dass Sie über reproduzierbare, qualitativ hochwertige Daten verfügen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods