Summary
דו ח זה מתאר שיטות מקיפות של הכנת העכבר הקפוא מקטעים רשתית עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC). השיטות שתוארו כוללות ניתוח של הספל האחורי העינית, קיבעון הפרפורמלדהיד, הטבעה של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מדיה ורקמות כיוון, הסרת וכתמים חיסוני.
Abstract
הכנת סעיפים באיכות גבוהה עכבר העין עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC) הוא קריטי להערכת מבנה ותפקוד רשתית ולקביעת מנגנונים המשמשים מחלות רשתית. שמירה על השלמות המבנית לאורך הכנת הרקמה חיונית להשגת נתונים ברשתית שניתן לתחזק, אך יכול להיות מאתגר בשל שבריאת והמורכבות של האדריכלות הרשתית. תיקונים חזקים כמו 10% פורמלין או הפתרון של bouin לשמר בצורה אופטימלית את המבנה הרשתית, הם לעתים קרובות לעכב את ניתוח ihc על ידי שיפור הרקע של זריחה ו/או הפוחתת נוגדן האינטראקציות, תהליך המכונה מיסוך אפירופה. תיקונים מתון יותר, מצד שני, כמו 4% פאראפורמלדהיד, מפחית את הרקע של זריחה ואפירופה-מיסוך, טכניקות הניתוח מוקפד חייב להיות מנוצל כדי לשמר את המבנה הרשתית. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מקיפה כדי להכין את העכבר כוסות האחורי העינית עבור IHC כי הוא מספיק כדי לשמר את האינטראקציות הנוגדן ביותר מבלי לאבד שלמות מבנית ברשתית. אנו כוללים נציג IHC עם נוגדנים שונים סוג תא סמנים ברשתית כדי להמחיש שימור רקמות וכיוון בתנאים מיטביים ותת אופטימלית. המטרה שלנו היא לייעל את מחקרי IHC של הרשתית על ידי מתן פרוטוקול מלאה מתוך ניתוח הספל האחורי העינית ל-IHC.
Introduction
אימונוהיסטוכימיה (ihc) היא טכניקה רבת-עוצמה לאיתור חלבונים ומבני סלולר ספציפיים ברקמות באתרו1,2,3. שיטות קיבעון בלתי הולמים והפחתה תת-אופטימלית של רקמות מורכבות יכול לשבש את מבנה הרקמה, ליצור כתמים ברקע גבוה או להפחית נוגדן-אפירופה אינטראקציות, וכתוצאה מכך מכתים חפצים והסוגר וטעה של נתוני IHC4. כמו הרשתית בעלי החוליות הוא איבר עצבי מורכב ומאורגן מאוד מורכב משכבות של פוטוטורקטורים מחוברים, הביננוירונים ותאים גנגליון, זה שברירי מאוד ניתן לשבש בקלות במהלך הניתוח והפריית. פרוטוקול מפורט, מתוקננת, ומאומת מפני הפחתת עין העכבר והתמצאות לכתמים מסייעים להפחית באופן משמעותי את הממצאים של IHC, ובכך להגדיל את האמינות של התוצאות ולאפשר נתונים השוואתיים יותר מדויקים ניתוח.
ישנם פרוטוקולים רבים עבור הכנת רקמות עבור IHC, עם זאת, לא כל מתאים לרקמות רשתית. תיקונים חזקים כמו 10% פורמלין או הפתרון של bouin לשמר את המבנה הרשתית במהלך הניתוח והאפשרות5. למרבה הצער, תיקונים חזקים מובילים לעיתים קרובות לאור הזריחה המשופרת והמסיכה כתוצאה משינוי כימי של אפיסקופים6. מצד שני, תיקונים מתון יותר, כמו 4% פאראמפורמלדהיד (בתחתית) יכולים להקל על כמה מהחפצים האלה, אבל דורשים לעבור ניתוח קפדני והקפדה כדי לשמר את המבנה הרשתית האופטימלי. הכדורגלן חודר במהירות לרקמות, אבל מצמצמים את החלבונים מאוד לאט, ומפחיתים את הסיכון של הסוואה. מאז הדגירה התחתית זמן קצר היא קיבעון קל יחסית, רקמות לעתים קרובות דורשים קיפאון מהיר כדי לשמר אנטיגנים. חשוב להימנע היווצרות גביש הקרח במהלך הקפאת רקמות כפי שהם לעוות ולפגוע היושרה של תאים ורקמות7.
כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים וסטנדרטיים עבור ניתוח, קיבעון, הגנה על ההקפאה של כוסות העכבר האחורי העינית התשואה נתונים IHC עקבית ואמין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן בוצעו בהתאמה קפדנית עם ההמלצות של המכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה שסופקו על ידי המכון למשאבי בעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש של אוניברסיטת פנסילבניה.
כל הכלים והציוד עבור השיטות מוצגים באיור 1 ומפורטים בטבלת החומרים.
1. העין העכבר enucleation, העין לנתיחה, והטבעה
- המתת חסד של עכברים עם פחמן דו חמצני (CO2) ואחריו עריפת ראש (עכברים לפני הלידה P0-P11) או פריקה צוואר הרחם (למבוגרים > P11 עכברים). עבור עכברים P0-P14, העיניים מכוסות בעור. הקפידו להסיר את העור לפני הצעדים הבאים.
- סמן את החלק הזמני של העין (איור 2 א) על ידי שריפת הקרנית מעט באמצעות הזנב צורב. הימנע בוער חור בקרנית ידי נגיעה בקרנית בקלילות מאוד וללא יותר משבריר שנייה עם הצורב.
- מיד עוקרים את עיני העכבר באמצעות מעוקל דומונט5/45 מלקחיים. מודרת עבור 15 דקות ב 1.5 mL שפופרת קריוצינור עם 1 מ ל של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב-פוספט מאגור מלוחים (PBS) על קרח.
- לאחר 15 דקות ב 4% כלגון, להעביר את העין הקבועה באמצעות מלקחיים מעוקל דומונט5/45 כדי שונה 35 מ"מ צלחת הניתוח (ראה טבלת חומרים ואיור 1c) מלא PBS ו מקום תחת מיקרוסקופ.
- לעשות חתך קטן על סימן הכוויה, בניצב אל וקצת מעל לימבוס (הגבול של הקרנית) באמצעות סכין מיקרו.
- הכנס את המספריים המעוקל לתוך החתך ולבצע חתך מעוקל של הקרנית בעקבות לימבוס (איור 2B).
- הסר את הקרנית ולחלץ את העדשה עם דק5 מלקחיים דומונט, (איור 2B) ולהרים אותו בעדינות הרחק מהחלק האחורי של העין. הגוף אינדקטור, ג'ל ברור הממלא את החלל בין העדשה ואת הרשתית, תצא עם העדשה (איור 2b) ואת הרשתית יהיה גלוי כמו משטח לבן המכסה את החלק הפנימי של העין האחורי של הספל. ודא כי אין נזק גלוי לעין הרשתית, כגון חורים או דמעות (איור 2C).
- שטוף את כוסות העיניים פעמיים ב 1 מ ל של PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הקפאה של כוסות העין על ידי השתלטות עליהם בתמיסה של 15% סוכרוז ב-PBS לילה ב-4 ° צ' עד לכיורי העיניים
- להעביר את כוסות העין כדי 30% סוכרוז ב-PBS עבור 2-3 h עד כיורי העין שוקעת.
- להטביע את כוסות העין ב OCT ב 10 x 10 מילימטר cryomolds (איור 3a). באמצעות מיקרוסקופ מבתר, כוון את העין בקריואוולד לאורך הציר הגוגולי שלה (איור 2D, איור 3a) על ידי סיבוב העין עד סימן הכוויה הוא למעלה, עצב הראייה הוא בצד שמאל, חלק לחתוך את העובש פונה ימינה ( איור 2D). שמור על עצמך להימנע בועות ליד הרקמה.
הערה: כדי לתמרן את גביע העין, להשתמש במקדח טיטניום עשוי חוט טיטניום המצורפת לקצה הפיפטה. - כדי להצמיד הקפאת רקמת הרשתית, לטבול את cryomold לפחות 5 דקות בגביע מתכת המכיל איזופנטאן ולמקם את הגביע בחנקן נוזלי או קרח יבש/100% האתנול אמבטיה (עד 1/3 של גובה גביע המתכת).
הערה: cryomold צריך להיות שקוע איזופנטאן לגדול ממחצית הגובה שלה, אבל לא צריך להיות לגמרי שקוע. - להסיר את הבלוק הקפוא לעטוף אותו רדיד אלומיניום.
- חנות ב-80 ° c.
- סמן את הבלוק הקפוא באמצעות עט או טוש כדי להקליט את כיוון הבלוק (איור 3B).
2. בנייה באמצעות קריוסטט
- לאחר התאמת טמפרטורת הקריוסטט (בין-20 ל-25 ° c), אפשר את התבניות המכילות את כוסות העיניים המוטבעות כדי להתאים את טמפרטורת הקריוסטט ל-1 h.
- התקן את הבלוק עם כיוון dorso-ventral (איור 3c) ולחתוך 10 יקרומטר מקטעים סידוריים עבים. מניחים בזהירות את החלקים הרשתית על שקופיות המיקרוסקופ ממוספרים.
- אחסן שקופיות בתיבות שקופיות ב-20 ° צ' או-80 ° צ' עד להליכי IHC.
3. כתמים פלואורסצנטית באמצעות מתלה השקופיות
הערה: מערכת לארון תקשורת שקופית (למשל, סקונצה) מחזיקה את שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית עם צלחת כיסוי, יצירת פער הנימים ~ 100 μL בין השקופית לצלחת.
- להפשיר את מקטעי ההקפאה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 h כדי 4 h כדי לאפשר להם להתייבש ולצרף לשקופיות מיקרוסקופ.
הערה: ניתן גם לייבש אותם ב 30-37 ° c עבור 30 דקות עד 1 h. - מקם שקופיות בארון תקשורת של השקופיות ושטוף את מקטעי הרשתית פעמיים ב-100-200 μL PBS עבור 2 דקות.
- החדירות סעיפים ברשתית על ידי מודטת אותם ב 0.25% טריטון-X/0.05% נאן3ב PBS עבור 5 דקות ב-RT.
- הוסף 100 μL של חסימת פתרון לשקופיות.
- הוסף 100 μL של הנוגדן העיקרי מדולל בפתרון חסימת לשקופיות.
- מודריטה סעיפים רשתית לילה ב 4 ° c.
הערה: במהלך זמן זה, כסה את מתלה השקופיות כדי למנוע התייבשות של המקטעים. - לשטוף את מקטעי הרשתית 3 פעמים, כל אחד עבור 15 דקות, באמצעות 200 μL PBS.
הערה: התוספת של 0.001-0.002% טריטון-X100 כדי PBS (PBS-T) לאפשר שטיפה מחמירה יותר, אבל יכול לשבש כמה קרומים ומבנים סלולריים. - דגירה סעיפים הרשתית בנוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט עבור 1 h ב RT. . מעתה והלאה, הגן מפני האור
- שטוף את מקטעי הרשתית 3 פעמים, כל אחד עבור 15 דקות.
- מודאת סעיפים ברשתית ב RT עבור 5 דקות עם סמן גרעיני כגון Hoechst 33342 או פתרון DAPI.
- לשטוף את סעיפים הרשתית 1 פעם עבור 15 דקות.
- הניחו שמיכות על גבי מגבת נייר על ספסל המעבדה.
- הוסף 2 טיפות של המדיה הרכבה אנטי נמוגה למרכז הכיסויים.
- הפוך את השקופית כדי שמקטע ההקפאה הרשתית פונה כלפי מטה.
- הבהר בזהירות את הכיסויים, בזווית של ~ 45 °, הקצה את השקופית אל המדיה הנכנסת.
הערה: הימנעות מיצירת בועות בעת הורדת השקופית במקומה. - החלת לחץ אפילו, באמצעות ספר או קטלוג כבדים (ראה להלן), לשילוב שקופית-שקופיות כדי למנוע הרכבה מדיה עודפת.
הערה: כדי להבטיח עקביות בהכנה לדוגמה, השתמש תמיד באותו אובייקט, (כלומר, אותו ספר או קטלוג) כדי להחיל לחץ אפילו על הכיסויים במהלך הרכבת השקופיות. - שמרו על שטוח והניחו את הלילה בחושך בחשיכה. אחסן מגלשות שטוחות ב -4 ° c ללא הגבלת זמן.
- תמונה באמצעות שדה רחב או המיקרוסקופיה פלואורסצנטית (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להמחיש כיצד פרוטוקולים אלה, להבטיח שימור הרשתית אופטימלית עבור ihc, אנו בדקו מקטעים ברשתית מ P28 WT עכברים (C57BL/6n) עם נוגדנים לרודוסין (הסמן תא קולט אור)8, גלוטמית חומצה decarboxylase 65 (Gad65, תא אמקרין marker)9, גלוטמין הבורסה (GS, מסמן תא מולר)10, ו calbindin (סמן תא אופקי)11 (איור 4). IHC מציינים כי הפרוטוקולים שלנו להניב בעקביות באיכות גבוהה ומשומרים היטב סעיפים הרשתית. בעיקר, מקטעים הפנימיים והחיצוניים עשיר הרודופסין נשארים אנכיים ושלמים עם מעט ללא הפרדה מאשר על האפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) (איור 4A). בנוסף, תאים מולר נשארים היטב משומרים עם סומה כראוי מיושר ותהליכים cytoplasmic כי בטווח של שכבת התאים גנגאריה (GCL) אל השכבה הגרעינית החיצונית (גרת) (איור 4B).
Interneurons, כגון בתאי אמקרין חיובי, גם להישאר באופן תקין בתוך inl ושכבת plexiform הפנימי (IPL) (איור 4ב) בעוד תאים אופקיים מוגדרים היטב הם לזיהוי ב inl והחיצוני plexiform שכבה (OPL) גבול (איור 4ג). באופן קולקטיבי, נתונים אלה מדגימים כי השיטה שלנו שומרת על התאים הרשתית ואת שלמות הרקמה, מ photoreceptors כדי גנגליון תאים
כדי להקל על הסדר הרוחבי, חשוב להתמצא בקפדנות את הספל האופטי בתבנית ההקפאה לפני הקיפאון. רשתית מוטעית, שיטה בעלת הגזרה הירודה או בנייה עם סכינים משעממות או פגומות עלולים לגרום לחפצים כגון דמעות של רקמה רשתית, עיוותים ותזוזה תאית, כמו באיור 4. דוגמאות לממצאים מקטעים מוצגים באיור 4D-F. באיור 4D הציבור המסכן ויישור להוביל העיוות מקטעים פנימיים וחיצוניים (איור 4d) ודמעות רקמה קטנה (איור 4d, חץ). בדוגמה אחרת, כיוון הרקמה המסכנה לפני הסעיף מוביל יישור תת-אופטימלי של תא מולר הסומה ואת התהליכים cytoplasmic איור 4E. איור 4F מראה כיצד הסקר המסכן שנגרם כתוצאה מסכין מיקרוטומה משעממת גרם לתאים אופקיים למרוח באופן מעוות מ-opl ל-gcl. לכן, יש ליישם תשומת לב מדויקת על ביצוע כל שלב המתואר בפרוטוקול כדי להבטיח את האיכות והאפשרות הגבוהה ביותר של נתוני IHC.
הבין מיכל בן : כלים לניתוח עין העכבר, הטבעה, ו-IHC. (א) קאול; (ב) כלים לחיתוך משמאל לימין: דומונט5/45 מלקחיים עקומים, מספריים עקומים ודומונט5 מלקחיים דקים; (ג) 35 ממדי לחיתוך מילימטר (חץ מצביע לחדר מבתר); (ד) מיקרוסקופ מבתר; (ה) הכלים הקפואים משמאל לימין: בידוד קריר, בגביע נירוסטה עבור איזופנטאן אמבטיה, נירוסטה נוזלי N2 אמבטיה; (ו) טיטניום בדיקה; (G) מתלה לשקופיות וכיסוי לכריכה עבור IHC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הבין מיכל השני : עין העכבר כיוון העיניים ותיאור. (א) מיקום סימן כוויות הזמני (חץ אדום) כדי להקל על כיוון העין (dorso = D, והוא = V, הזמני = T, האף = N). (ב) תרשים סכימטי לחיתוך עין העכבר. חתך קטן נעשה בסימן הכוויה, הניצב לתוך הקרנית ובדיוק מעל לימבוס באמצעות אזמל דק (סכין מיקרו). חותכים סביב הקרנית כדי להפריד את החלק הקדמי והאחורי של העין. (ג) גביע העין עם רשתית שלם. (ד) Dorso-כיוון הרוח של עין העכבר עם העצב האופטי (ON), עדשה (L), קרנית (C) לימבוס (OS). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הבין מיכל שלוש : עין העכבר הטבעה. (א) Dorso-עכברים מאוגשים עיניים העין בתוך cryomold מלא עם OCT, (ב) העכבר הקפוא ברשתית הגביע בהקפאה מוערת. (ג) קריוסטט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הבין ד : העכבר הרשתית מתחת אימונוהיסטוכימיה. (A-C) איכות טובה ו-(D-F) באיכות ירודה סעיפים ברשתית מ P28 WT היו תוויות עם נוגדנים הרודוסין (א, ג) GAD65 (ב, E) ואת מילר מסמן תא גלוטמין הבורסה (GS; B, E) ומסמן התא האופקי calbindin (C, F). חיצים לבנים מצביעים על דמעות. של רקמה ומריחת הרקמה החריגה סרגל בקנה מידה, 20 μm. גרעינים המסומנים עם Hoechst 33342 (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לנתיחה הרשתית של העכבר הוא תהליך עדין בשל גודל קטן וצורה של עיניים העכבר ושבריאת הרקמות הרשתית. למרות ביצוע הניתוח באיכות גבוהה הוא עניין של תרגול, בעל פרוטוקול מפורט, מתן שיטות יעילות וטיפים הוא הכרח להשיג חלקים ברשתית ו-IHC. בנוסף לפרוטוקולים המתוארים כאן, קיימים מספר טיפים המאפשרים למקטעי רשתית באיכות גבוהה ועקבית המתאימים ל-IHC.
לפני תחילת הניתוח, חשוב להיות נוח, רגוע ולהגדיר את תאורת החדר לראייה אופטימלית במהלך ניתוח מיקרו העכבר עין. כדי לשמור על צורת העיניים של העכבר בזמן מבתר את העין, אנו ממליצים לשמור על העיניים השקועים ב-PBS בתוך מנות מותאמות אישית שנעשו מצופי שעווה. אנו מציעים ציפוי מיכל לחיתוך 35 מ מ עם שעווה ורודה בהיר בצבע שיניים (איור 1c). אכן, צבע ורוד קל של שעווה שיניים מספק ניגודיות נאותה כדי לראות מבנים עיניים בקלות תחת היקף הניתוח, הרשמים בגודל העין בשעווה, שנעשו על ידי לחיצה על הבסיס של צינורות microfuge לתוך השעווה, ישמור את גביע העין במקום בעוד המאפשר סיבוב מתאים של כלים סביב העין במהלך הקרע. בנוסף, חשוב להסיר כמו נוזל אינדקטור הרבה מגביע העין ככל האפשר תוך הסרת העדשה, כמו נוזל אינדקטור שיורית נוטה ליצור רקמת הקרח הנזק רקמות במהלך בלוק רקמות הקפאת צעד. בדרך כלל אנו משתמשים בנייר טישו ומניחים אותו לגבול של הגביע הגזור, כדי להסיר בזהירות את כל נוזל אינדקטור שנותרו על ידי נימי מבלי להפריע רקמת הרשתית. במקרה מצער שבו כמות קטנה של נוזל שיורית ויטראז ' עדיין נוכח בגביע העין, הערות צריך להיעשות ב-20 ° c כדי להפחית את הטרנספורמציה של הקרח ולכן לשמר את החדות של הלהב ואת האיכות של המיקום .
שיטות קיבוע והטבעה יש גם השפעה גדולה על איכות הסעיפים ו-IHC. למרות פורמאלין קבוע-פרפין מקטעים מוטבעים התשואה שלמות מבנית אופטימלית של רקמת העין, פורמלין מכיל מתנול שיכול לשפר את הרקע של זריחה. כדי למנוע את הממצאים האלה, אנו ממליצים על שימוש ב-EM כיתה טרייה (ברמה הרביעית) כדי להגביל את הרקע ואת הקרינה האוטומטית הנגרמת על ידי מתנול או תחמוצת הרמה4,5,6. אנו ממליצים על תנאי קיבעון קלים המתוארים בפרוטוקול שלנו תיקון העין עם 4% פאראמפורמלדהיד עבור 15 דקות על הקרח. מאז ה, הכדורגלן חודר במהירות לרקמות, אבל החוצה מקשרים בין חלבונים מאוד לאט, תנאים אלה מספיקים כדי לשמר את השלמות המבנית ברשתית במהלך הניתוח ולשמר את האנטיגניות של אנטיגנים ברשתית משותף ללא צורך אנטיגן שיטות אחזור4. אם המבנה הרשתית לא נשמר היטב, את משך הקיבעון הכליתית יכול להיות מוגבר, אולם חשוב להיות מודע כי הרקמות מעל-fixating ישפר את הרקע שאינו מוגדר מסוים והוא יכול להוביל לתוך מיסוך אפיפי, בעוד תחת-fixating רקמות עלול לפגוע בשלמות מבנית של הרקמה ולגרום לאובדן של אנטיגנים מסוימים נוטה השפלה פרוטחרדה. מאז הדגירה הראשונה זמן קצר הכליים הוא קיבעון קל יחסית, אנו ממליצים גם הרשתיות הקפאת שאיפה על ידי לטבול את העין מוטבע OCT, הכלול cryomold (10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ), באמבט איזופנטאן שקוע חנקן נוזלי. הקפאת רקמות שימור אנטיגנים, בעוד הפתרון סוכרוז ו OCT לפעול כמו הגנה ההקפאה. שיטה זו תפחית את עיוות הרקמה בשל היווצרות גבישי הקרח, אשר יכול לגרום כביכול גבינה שוויצרית סוג של נזק לרקמות. הcryomold לא צריך להיות טבל ישירות בחנקן נוזלי או שהוא יתחיל לרתוח, יצירת מחסום אדים, אשר יאט את תהליך ההקפאה, וכתוצאה מכך קיבעון הטרוגנית שימור. יתר על כן, רקמות ו-OCT במגע עם חנקן נוזלי יכול לפצח, ובכך להשפיע על שלמות העין7. אנחנו, לכן, ממליצים לטבול את cryomold (10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ) בתוך לא יותר 5 מ"מ איזופנטאן עמוק באמצעות בגביע פלדת אל-חלד קטנה, עצמו טבל בגביע מפלדת אל-חלד גדול יותר (100 מ"מ מינימום רחב) המכיל חנקן נוזלי. כדי למנוע אידוי מהירה של חנקן נוזלי במהלך הכנת דגימות מספר, אנו שומרים שני אמבטיות בצידנית מבודדים. יש לציין כי הקפאה רקמות באוקטובר הוא לא שיטת שימור ארוכת טווח, בשל היווצרות גבישי הקרח ברקמה לאורך זמן אשר יכול לשנות את מורפולוגיה subcellular ו/או מספר אנטיגנים. כתוצאה מכך, יש לאחסן בלוקי רקמה ומקטעים קפואים ב-20 ° c לאחסון לטווח קצר ולאחסון ב80 ° c לטווח ארוך.
הרשתית של היונקים היא איבר אסיאני עם התפלגות מרחבית ספציפית של התאים לאורך הצירים הטמפורלית-האף והמדורביים. לדוגמה, אצטרובלים של M ו-S-opsin מסודרים במעבר הדרגתי מסוים מדרגה 12. לכן, חיוני להבטיח כיוון תקין של העין במהלך הכנת הרקמה והיערכות בכדי לבצע IHC השוואתי. אנו משתמשים בצרוב כדי למקם סימן התייחסות על העין לפני הניתוח (איור 2A, D) כך שנוכל לכוון את גביע העין לאורך הציר הגייתי-הגשלה במהלך שלב ההטבעה, ולכן השגת מקטעים רוחבי לחלוטין. אנו מניחים את סימן הכוויה על החלק החצי-זמני של העין, על ידי נגיעה בקרנית לשבריר שנייה עם הצורב. זה יאפשר מעט לצרוב את הקרנית תוך הימנעות פירסינג חור לתוכו. במהלך הניתוח של העין, אנו עושים חתך קטן, בסימן הכוויה, הניצב לגבול הקרנית, באמצעות סכין מיקרו (איור 2B). כדי להקל על כיוון dorso-הגחוני של בלוק ולמזער התאמות התמצאות במהלך הביקורת, אנו ממליצים לצמצם את הספל העין האחורי של cryomold, עם סימן הכוויה מול החלק התחתון של cryomold ואת הפתיחה של קרנית באופן מושלם במקביל לצד הימני של הקריומואולד (איור 3 א, ב). הבלוק הקפוא יותקן עם החלק התחתון של הבלוק הפונה לכיוון הלהב בקריוסטט, את גביע העין הניצב אל הלהב, בכיוון דורסו-הגחוני (איור 3 ג).
הרשתית אמין IHC מתחיל בניתוח אופטימלי, מותאם, ועיבוד רקמות. השיטה המתוארים כאן בצורה אופטימלית שומרת על המבנה והיושרה הרשתית תוך הפחתת מיסוך פלורסנט ואפירטית שעלולים לפגוע ב-IHC הפלורסצנט. בעקבות פרוטוקול זה תבטיח שאתה מקבל נתונים באיכות גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין הגילויים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי קרנות מ-NIH (RO1-GMO97327) והקרן לחקר האוניברסיטה (UPenn). אנו מודים במיוחד לסווטלנה סאוינה על עזרתה בפיתוח פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה, גורדון רותל (אונ' פנסילבניה) וליבת ההדמיה של פן וטרינר לסיוע במיקרוסקופיה ולסלי קינג, Ph.D. לקריאה קריטית של כתב היד .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
| Aluminum foil | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
| Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
| Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
| Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
| Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives - Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
| Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
| Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
| Styrofoam box | For insulated cooler | ||
| Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
| Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
| Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
| Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
| Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
| Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
| Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
| anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |
References
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113 (1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
