Utarbeidelse av Mouse retinal fryse-seksjoner for immunhistokjemi

Summary

Denne rapporten beskriver omfattende metoder for å forberede frosne mus Retina seksjoner for immunhistokjemi (IHC). Metodene som er beskrevet inkluderer Disseksjon av øye bakre kopp, paraformaldehyde fiksering, innebygging i optimal skjæring temperatur (OCT) Media og vev orientering, snitting og immunostaining.

Abstract

Utarbeidelse av høy kvalitet muse øye seksjoner for immunhistokjemi (IHC) er avgjørende for å vurdere retinal struktur og funksjon og for å bestemme mekanismene underliggende retinal sykdommer. Opprettholde strukturelle integritet gjennom hele vevet forberedelse er avgjørende for å oppnå reproduserbar retinal IHC data, men kan være utfordrende på grunn av skjørhet og kompleksiteten i retinal cytoarchitecture. Sterk fiksativene som 10% formalin eller Bouin løsning optimalt bevare retinal struktur, de ofte hemme IHC analyse ved å forbedre bakgrunnen fluorescens og/eller avtagende antistoff-epitope interaksjoner, en prosess som kalles epitope maskering. Mildere fiksativene, på den annen side, som 4% paraformaldehyde, reduserer bakgrunnen fluorescens og epitope-maskering, grundige disseksjon teknikker må benyttes for å bevare retinal struktur. I denne artikkelen presenterer vi en omfattende metode for å forberede musen øye bakre kopper for IHC som er tilstrekkelig til å bevare de fleste antistoff-epitope interaksjoner uten tap av retinal strukturelle integritet. Vi inkluderer representative IHC med antistoffer mot ulike typer Netthinne celle markører for å illustrere vevs bevaring og-orientering under optimale og under optimale forhold. Vårt mål er å optimalisere IHC studier av netthinnen ved å tilby en komplett protokoll fra disseksjon til IHC.

Introduction

Immunhistokjemi (IHC) er en kraftig teknikk for lokalisere av spesifikke proteiner og cellulære strukturer i vev i situ^1,2,3. Upassende fiksering metoder og sub-optimal snitting av komplekse vev kan forstyrre vev struktur, generere høy bakgrunn farging eller redusere antistoff-epitope interaksjoner, noe som resulterer i flekker gjenstander og påfølgende feil tolkning av IHC data⁴. Som virveldyr Retina er et komplekst og svært organisert neural organ bestående av lag av sammenkoblede fotoreseptorene, interneurons og Ganglion celler, er det svært skjøre og kan lett forstyrres under disseksjon og snitting. En detaljert, standardisert og validert protokoll fra mus øye disseksjon og orientering til immunostaining vil bidra til å redusere IHC-artefakter betraktelig, og dermed øke påliteligheten til resultatene og gi mer nøyaktige sammenlignings data Analyse.

Det er mange protokoller for vev forberedelse for IHC, men ikke alle er egnet for retinal vev. Sterk fiksativene som 10% formalin eller Bouin ' s løsning bevare retinal struktur under disseksjon og skjæring⁵. Beklageligvis, kraftig fiksativene ofte føre til det forsterket miljøet fluorescens og epitope maske på grunn av det kjemikalie modifisering av epitopes⁶. På den annen side, mildere fiksativene, som 4% paraformaldehyde (PFA) kan lindre noen av disse gjenstandene, men krever grundige disseksjon og snitting for å bevare den optimale retinal struktur. PFA penetrerer raskt vev, men kryss-koblinger proteiner svært langsomt, redusere risikoen for epitope maskering. Siden kort tid PFA inkubasjons er en relativt mild fiksering, vev ofte krever rask frysing å bevare antigener. Det er viktig å unngå iskrystall formasjon under vev frysing som de forvrenge og skade integriteten av celler og vev⁷.

Her beskriver vi detaljerte og standardiserte protokoller for disseksjon, fiksering, og fryse beskyttelse av musen øye bakre kopper som gir konsistente og pålitelige IHC data.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her ble utført i nøye samsvar med anbefalingene i National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr levert av Institutt for laboratorium Animal Resources og ble godkjent av Institusjonelle Animal Care og bruk komité ved University of Pennsylvania.

Alle verktøy og utstyr for metodene er vist i figur 1 og listet i materialfortegnelsen.

1. Mus øye utskraping, Eye Cup disseksjon, og embedding

1. Euthanize mus med karbondioksid (CO₂) etterfulgt av enten halshogging (postnatal mus p0-P11) eller cervical forvridning (voksen > P11 mus). For p0-P14 mus, øyne er dekket av huden. Sørg for å fjerne huden før påfølgende trinn.
2. Merk den timelige delen av øyet (figur 2a) ved å brenne litt på hornhinnen ved hjelp av en hale cauterizer. Unngå å brenne et hull i hornhinnen ved å berøre hornhinnen veldig lett og for ikke mer enn et brøkdels sekund med cauterizer.
3. Umiddelbart enucleate musen øyne ved hjelp av buede Dumont #5/45 tang. Ruge i 15 min i et 1,5 mL cryotube rør med 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA) i fosfat-bufret saltvann (PBS) på is.
4. Etter 15 min i 4% PFA, overføre det faste øyet ved hjelp av buet tang Dumont #5/45 til en modifisert 35 mm disseksjon rett (se tabell over materialer og figur 1C) fylt med PBS og plasser under dissekere mikroskop.
5. Lag et lite snitt på brenne merke, vinkelrett på og like over limbus (grensen av hornhinnen) ved hjelp av mikro kniven.
6. Sett den buede saksen inn i snittet og Utfør et circumferential kutt på hornhinnen etter limbus (figur 2b).
7. Fjern hornhinnen og pakk linsen med en tynn Dumont #5 tang, (figur 2b) og løft den forsiktig bort fra den bakre delen av øyet. Glasslegemet, den klare gelen som fyller rommet mellom linsen og netthinnen, vil komme ut med linsen (figur 2b) og netthinnen vil være synlig som en hvit overflate som dekker innsiden av den bakre øye koppen. Sørg for at det ikke er synlige skader på netthinnen, for eksempel hull eller tårer (figur 2C).
8. Vask øye koppene to ganger i 1 mL PBS i 10 min ved romtemperatur.
9. Cryoprotect øyet koppene ved equilibrating dem i en løsning på 15% sukrose i PBS over natten ved 4 ° c til øyet koppen synker
10. Overfør øye koppene til 30% sukrose i PBS for 2-3 h til øyet koppen synker.
11. Bygg inn øye koppene i OCT i 10 x 10 mm cryomolds (figur 3a). Ved hjelp av et dissekere mikroskop, orientere øyet i cryomold langs sin rygg-ventrale akse (figur 2D, figur 3a) ved å rotere øyet til brennemerket er på toppen, er den optiske nerven på venstre og cut-ut en del av mold vender mot høyre ( Figur 2D). Pass på å unngå bobler i nærheten av vevet.
    Merk: for å manipulere øye koppen, bruk en Titan-sonde laget av en Titan tråd festet til en pipette spissen.
12. Å snap-fryse retinal vev, dyppe cryomold i minst 5 min i et metall beger som inneholder isopentane og plasser begeret i flytende nitrogen eller tørr is/100% etanol bad (opp til 1/3 av høyden av metall begeret).
    Merk: cryomold skal være nedsenket i isopentane til større enn halvparten av sin høyde, men trenger ikke å være helt neddykket.
13. Fjern den frosne blokken og Pakk den i aluminiumsfolie.
14. Store ved-80 ° c.
15. Merk den frosne blokken med en penn eller Sharpie for å registrere retningen på blokken (figur 3b).

2. Snitting ved hjelp av en kryostaten

1. Når du har justert kryostaten temperatur (mellom-20 og-25 ° c), lar du formene som inneholder de innebygde øye koppene, likevekt til kryostaten temperatur i 1 time.
2. Installer blokken med dorso-ventrale orientering (figur 3c) og kutt 10 μm tykke serielle seksjoner. Forsiktig plassere retinal seksjoner på kommenterte og nummererte mikroskop lysbilder.
3. Lagre lysbilder i lysbilde bokser ved-20 ° c eller-80 ° c til IHC prosedyrer.

3. Fluorescens immunostaining ved hjelp av Slide rack

Merk: Slide rack-systemet (f. eks Sequenza) holder glass objekt lysbildene med en dekkplate, og skaper et ~ 100 μL kapillær gap mellom raset og platen.

1. Tin fryse delene ved romtemperatur (RT) i 2 t til 4 timer for å la dem tørke og festes på objektglass.
   Merk: det er også mulig å tørke dem ved 30-37 ° c i 30 min til 1 time.
2. Plasser lysbildene i Slide rack og vask retinal seksjoner to ganger i 100-200 μL PBS for 2 min.
3. Permeabilize netthinnen seksjoner ved incubating dem i 0,25% Triton-X/0,05% NaN₃i PBS for 5 min på RT.
4. Tilsett 100 μL av blokkerings løsning på lysbildene.
5. Tilsett 100 μL av primær antistoff fortynnet i blokkerende løsning på lysbildene.
6. Ruge Netthinne seksjoner over natten ved 4 ° c.
   Merk: i løpet av denne tiden dekker du lysbilde stativet for å unngå uttørking av delene.
7. Vask retinal seksjoner 3 ganger, hver for 15 min, med 200 μL PBS.
   Merk: tillegg av 0,001-0,002% Triton-X100 til PBS (PBS-T) tillater en strengere vask, men kan forstyrre noen membraner og cellulære strukturer.
8. Ruge retinal seksjoner i fluorescerende-merket sekundære antistoffer for 1 t ved RT. Fra nå av beskytte mot lys.
9. Vask retinal seksjoner 3 ganger, hver for 15 min.
10. Ruge Netthinne seksjonene ved RT i 5 minutter med en kjernefysisk markør som Hoechst 33342 eller DAPI-løsning.
11. Vask Netthinne seksjonene 1 gang i 15 minutter.
12. Plasser en dekkglass på toppen av et papir håndkle på lab benken.
13. Tilsett 2 dråper med anti-filtrert monterings medium til midten av dekkglass.
14. Snu lysbildet over for å få retinal fryse-seksjonen vendt nedover.
15. Monter dekkglass forsiktig langsomt, i en vinkel på ~ 45 °, tipp glidebryteren på monterings mediet.
    Merk: Unngå dannelse av bobler mens du senker lysbildet på plass.
16. Påfør jevnt trykk, ved hjelp av en tung bok eller katalog (se nedenfor), til Slide-dekkglass kombinasjon for å eliminere overflødig montering Media.
    Merk: for å sikre konsekvens i prøve klargjøringen må du alltid bruke samme objekt (dvs. samme bok eller katalog) for å påføre jevnt Trykk på dekkglass under montering av lysbilder.
17. Hold flatt og la det stivne over natten på RT i mørket. Oppbevar lysbildene flatt ved 4 ° c i det uendelige.
18. Bilde via bredt felt eller konfokalmikroskopi fluorescens mikroskopi (Figur 4).

Representative Results

For å illustrere hvordan disse protokollene, sikre optimal Netthinne bevaring for IHC, analysert vi Netthinne seksjoner fra P28 WT mus (C57BL/6N) med antistoffer mot rhodopsin (en foto reseptoren markør)⁸, Glutaminsyre acid decarboksilaza 65 (Gad65, en amacrine celle merke)⁹, glutamin SYNTETASE (GS, en Müller celle markør)¹⁰, og calbindin (en horisontal celle markør)¹¹ (Figur 4). IHC indikerer at våre protokoller konsekvent gir høy kvalitet og godt bevarte Netthinne seksjoner. Spesielt, den rhodopsin indre og ytre segmenter forblir vertikal og intakt med liten eller ingen separasjon fra overliggende retinal pigmentert epitel (RPE) (figur 4a). I tillegg er Müller-celler fortsatt godt bevart med Soma riktig justert og cytoplasmatiske prosesser som spenner fra det Ganglion celle laget (GCL) til det ytre Atom laget (ONL) (figur 4b).

Interneurons, slik som Gad65-positive amacrine celler, også forbli riktig lagdelt innenfor INL og indre plexiform lag (IPL) (figur 4B) mens VELDEFINERTE horisontale celler er synlig på inl og ytre plexiform lag (OPL) kant (figur 4C). Samlet disse dataene viser at vår metode bevarer netthinnen celle og vev integritet, fra fotoreseptorene til Ganglion celler

For å lette tverrgående snitting er det viktig å omhyggelig orientere den optiske koppen i fryse formen før frysing. Misoriented netthinne, dårlig skjære teknikk eller snitting med matte eller skadede mikrotomen kniver kan forårsake artefakter som retinal vev tårer, skjevheter, og cellulær forskyvning, som i Figur 4. Eksempler på del gjenstander er vist i figur 4d-F. I figur 4d dårlig skjæring og justering føre til Foto reseptoren indre og ytre segmenter forvrengning (figur 4d) og små vev tårer (figur 4e, arrow). I et annet eksempel, dårlig vev orientering før § fører til sub-optimal justering av Muller Cell Soma og cytoplasmatiske prosesser figur 4e. Figur 4f viser hvor dårlig snitting sannsynligvis forårsaket av en Matt mikrotomen kniv forårsaket horisontale celler til aberrantly SMØRE fra OPL til GCL. Nøyaktig oppmerksomhet må derfor anvendes på utførelsen av hvert trinn som er skissert i protokollen for å sikre høyest mulig kvalitet og reproduserbarhet av IHC data.

Figur 1 den andre : Verktøy for mus øye disseksjon, embedding, og IHC. (A) Cauterizer; (B) disseksjon verktøy fra venstre til høyre: Dumont #5/45 buet tang, buet saks, og Dumont #5 tynn tang; (C) 35 mm disseksjon parabolen (pilen peker til dissekere kammer); (D) dissekere mikroskop; (E) frosne verktøy fra venstre til høyre: isolert kjøligere, rustfritt stål beger for isopentane bad, rustfritt stål flytende N₂ bad; (F) Titan sonde; (G) Slide rack og Coverplate for IHC. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 andre priser : Mouse Eye Cup orientering og beskrivelse. (A) Temporal brenne merke plassering (rød pil) for å lette øye orientering (dorso = D, ventrale = V, Temporal = T, nasal = N). (B) skjematisk for musen øye disseksjon. Et lite snitt er gjort på brenne merke, vinkelrett inn i hornhinnen og like over limbus ved hjelp av en fin skalpell (Micro kniv). Skjær rundt hornhinnen for å skille den fremre og bakre del av øyet. (C) Eye Cup med en intakt Retina. (D) dorso-ventrale orientering av musen øyet med optisk nerve (ON), linse (L), hornhinnen (C) limbus (OS). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 andre priser : Mouse øye embedding. (A) dorso-ventrale orientert mus Eye Cup i cryomold fylt med OCT, (B) frossen mus retinal kopp i kommenterte cryomold. (C) kryostaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 andre priser : Mus Retina immunhistokjemi. (A-C) god kvalitet og (D-F) dårlig kvalitet retinal seksjoner fra P28 WT ble merket med antistoffer mot rhodopsin (A, C) AMACRINE markør GAD65 (B, E) og Müller celle markør glutamin SYNTETASE (GS; B, E) og calbindin for horisontal celle markør (C, F). Hvite piler peker på vev tårer og avvikende smøre av vevet. Scale bar, 20 μm. kjerner merket med Hoechst 33342 (blå). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Mouse Retina disseksjon er en delikat prosess på grunn av den lille størrelsen og formen på musen øyne og skjørhet av retinal vev. Selv om utføring av høy kvalitet disseksjon er et spørsmål om praksis, har en detaljert protokoll, som gir effektive metoder og tips er en nødvendighet for å få tak i Netthinne seksjoner og IHC. I tillegg til protokollene beskrevet her, er det flere tips som gir konsistent høy kvalitet retinal seksjoner som er egnet for reproduserbar IHC.

Før starter med disseksjon, er det viktig å være komfortabel, avslappet og sette rommet belysning for optimal visjon under musen øye microdissection. For å opprettholde musen øye koppen form mens dissekere øyet, foreslår vi holde øynene neddykket i PBS i skreddersydde voks-belagt disseksjon retter. Vi foreslår belegg en 35mm disseksjon parabolen med lys rosa farget Dental voks (figur 1C). Faktisk gir lys rosa fargen på tann voks tilstrekkelig kontrast for å se lett øye strukturer under en disseksjon omfang, den store inntrykk i voks, laget ved å trykke på undersiden av microfuge rør inn i voks, vil holde øye koppen på plass mens slik at du har riktig rotasjon av verktøyene rundt øye koppen under disseksjon. I tillegg er det viktig å fjerne så mye glasslegemet væske fra øyet koppen som mulig mens du fjerner linsen, som rest glass væske er tilbøyelig til å danne vev skade isen krystaller under vev blokkere frysing trinn. Vi bruker vanligvis en silkepapir og plassere den til grensen av dissekert øyet koppen, å nøye fjerne alle gjenværende glasslegemet væske av kapillær uten å forstyrre Retina vev. I den uheldige saken hvor en liten mengde rester av glasslegemet fortsatt er til stede i øye koppen, bør snitting gjøres ved-20 ° c for å redusere transformasjonen av glasslegemet i isen og dermed bevare skarpheten på bladet og kvaliteten på skjære .

Fiksering og innebygging metoder har også en stor innvirkning på kvaliteten på seksjonene og IHC. Selv om formalin-faste parafin-embedded seksjoner gir optimal strukturell integritet av øye vevet, inneholder formalin metanol som kan forbedre bakgrunns fluorescens. For å unngå disse gjenstandene, anbefaler vi bruk av ferske EM grade paraformaldehyde (PFA) for å begrense bakgrunn og autofluorescence forårsaket av metanol eller oksidert PFA^4,5,6. Vi anbefaler de milde fiksering forholdene beskrevet i vår protokoll fikse øyet med 4% paraformaldehyde i 15 min på isen. Siden PFA raskt penetrerer vevet, men kryss-koblinger proteiner svært langsomt, disse forholdene er tilstrekkelige til å bevare retinal strukturelle integritet under disseksjon og bevare antigenisiteten av felles retinal antigener uten behov for antigen hente metoder⁴. Hvis netthinnen strukturen ikke er godt bevart, varigheten av PFA fiksering kan økes, men det er viktig å være klar over at over-fixating vev vil forbedre ikke-spesifikk bakgrunn fluorescens og kan føre til epitope maskering, mens under-fixating vev kan kompromittere strukturell integritet av vevet og føre til tap av noen antigener utsatt for proteolytiske degradering. Siden kort tid PFA inkubasjons er en relativt mild fiksering, vi anbefaler også snap-frysing Netthinne ved å dyppe den OCT-embedded øye, som finnes i en cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm), i et isopentane bad nedsenket i flytende nitrogen. Snap-frysing vev vil bevare antigener, mens sukrose løsning og OCT fungere som fryse-protectants. Denne metoden vil redusere forvrengningen av vevet på grunn av dannelsen av iskrystaller, som kan forårsake den såkalte sveitsiske osten type vevsskade. Cryomold bør ikke være dyppet direkte i flytende nitrogen eller det vil begynne å koke, danner en dampsperre og som vil bremse fryse prosessen, noe som resulterer i en heterogen fiksering og bevaring. Videre, vev og OCT i kontakt med flytende nitrogen kan sprekke, og dermed påvirker integriteten til øyet⁷. Vi anbefaler derfor å dyppe cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) i mer enn 5 mm dype isopentane ved hjelp av et lite rustfritt stål beger, selv dyppet i et større rustfritt stål beger (100 mm bredt minimum) som inneholder flytende nitrogen. For å unngå den raske fordampning av flytende nitrogen under utarbeidelsen av flere prøver, holder vi begge badene i en isolert kjøligere. Det bør bemerkes at cryopreserving vev i OCT er ikke en langsiktig bevaring metode, på grunn av dannelsen av iskrystaller i vevet over tid som kan endre subcellulære morfologi og/eller denaturere noen antigener. Følgelig bør vevs blokker og frosne seksjoner oppbevares ved-20 ° c for kortvarig lagring og for-80 ° c langtidslagring.

Den pattedyr Retina er et asymmetrisk organ med en bestemt romlig fordeling av cellene over Temporal-nasal og dorso-ventrale akser. For eksempel, M-og S-opsin kjegler er ordnet i en bestemt dorso-ventrale gradient ¹². Derfor er det viktig å sikre riktig orientering av øyet gjennom vev forberedelse og snitting for å utføre komparative IHC. Vi bruker en cauterizer til å plassere et referansemerke på øyet før disseksjon (figur 2a, D) slik at vi kan orientere øyet koppen langs rygg-ventrale akse under embedding fase, og derfor få perfekt tverrgående seksjoner. Vi plasserer brennemerket på dorso-Temporal delen av øyet, ved å berøre hornhinnen for et brøkdels sekund med cauterizer. Dette vil tillate å litt brenne hornhinnen samtidig unngå piercing et hull i den. Under øyet koppen disseksjon, gjør vi et lite snitt, på brenne merke, vinkelrett på grensen av hornhinnen, ved hjelp av mikro kniven (figur 2b). For å lette dorso-ventrale orientering og minimere orientering justeringer under snitting, foreslår vi orientere den bakre øye koppen i cryomold, med brennemerket mot bunnen av cryomold og åpningen av hornhinnen perfekt parallell av cryomold høyre side (figur 3a, B). Den frosne blokken vil bli installert med bunnen av blokken vendt mot bladet i kryostaten, øyet koppen vinkelrett på bladet, i en dorso-ventrale orientering (figur 3c).

Pålitelig Retina IHC starter med optimal, tilpasset og reproduserbar dissections og vevs behandling. Metoden skissert her optimalt bevarer retinal struktur og integritet samtidig minimere autofluorescence og epitope maskering som kan kompromittere fluorescerende IHC. Etter denne protokollen vil sikre at du har reproduserbar høykvalitets data.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods