Подготовка крио-секций мышиной подвздошной сыки для иммуногистохимии

Summary

В настоящем докладе описаны комплексные методы подготовки замороженных секций сетчатки мыши для иммуногистохимии (IHC). Описанные методы включают вскрытие глазной задней чашки, параформальдегидная фиксация, встраивание в оптимальную температуру резки (OCT) носителей и ориентации тканей, секционирование и иммуностоирование.

Abstract

Подготовка высококачественных секций глаз мыши для иммуногистохимии (IHC) имеет решающее значение для оценки структуры и функции сетчаточной системы и для определения механизмов, лежащих в основе заболеваний сетчаточной железы. Поддержание структурной целостности на протяжении всей подготовки ткани имеет жизненно важное значение для получения воспроизводимых данных IHC сетчатого, но может быть сложной задачей из-за хрупкости и сложности цитоархитектуры сетчаточной системы. Сильные фиксаторы, как 10% формалин или решение Буин оптимально сохранить структуру сетчатки, они часто препятствуют анализУ IHC путем повышения фоновой флуоресценции и / или уменьшение антител-эпитопов взаимодействий, процесс, известный как эпитоп маскировки. Мягкие фиксаторы, с другой стороны, как 4% параформальдегида, снижает фоновой флуоресценции и эпитоп-маскировки, тщательные методы вскрытия должны быть использованы для сохранения структуры сыворотки. В этой статье мы представляем комплексный метод подготовки мыши глазной задней чашки для IHC, что достаточно, чтобы сохранить большинство антител-эпитоп взаимодействия без потери структурной целостности сетчатых. Мы включаем представительный IHC с антителами к различным маркерам типа сетчаточных клеток, чтобы проиллюстрировать сохранение тканей и ориентацию в оптимальных и неоптимальных условиях. Наша цель заключается в оптимизации IHC исследований сетчатки путем предоставления полного протокола от глазной задней чашки вскрытия IHC.

Introduction

Иммуногистохимия (IHC) является мощным методом для локализации конкретныхбелков и клеточных структур в тканях на месте 1,^2,3. Неуместные методы фиксации и субоптимальное сечение сложных тканей могут нарушить структуру тканей, генерировать высокие фоновые окрашивания или уменьшать антитела-эпитопные взаимодействия, что приводит к окрашиванию артефактов и последующему неправильному толкованию Данные IHC⁴. Поскольку позвоночную сетчатку является сложным и высокоорганизованным нервным органом, состоящим из слоев взаимосвязанных фоторецепторов, интернейронов и ганглия-клеток, она очень хрупкая и может быть легко нарушена во время вскрытия и секции. Подробный, стандартизированный и проверенный протокол от вскрытия глаз мыши и ориентации на иммуно-стоикирование поможет значительно уменьшить iHC артефакты, тем самым повышая надежность результатов и позволяя более точные сравнительные данные Анализа.

Есть много протоколов для подготовки тканей для IHC, однако, не все подходят для ткани сетчатины. Сильные фиксаторы, такие как 10% формалин или решение Bouin сохранить структуру сытины во время вскрытия и секции⁵. К сожалению, сильные фиксаторы часто приводят к усиленной фоновой флуоресценции и маскировке эпитопов из-за химической модификации эпитопов^6. С другой стороны, более мягкие фиксаторы, как 4% параформальдегида (PFA) может облегчить некоторые из этих артефактов, но требуют тщательного вскрытия и сечения, чтобы сохранить оптимальную структуру сетчатого глаза. ПФА быстро проникает в ткани, но перекрестные белки очень медленно, снижая риск маскировки эпитопа. Поскольку короткое время инкубации ПФА является относительно мягкой фиксации, ткани часто требуют быстрого замораживания для сохранения антигенов. Важно, чтобы избежать образования кристалла льда во время замораживания тканей, как они искажают и повреждения целостности клеток и тканей⁷.

Здесь мы описываем подробные и стандартизированные протоколы для вскрытия, фиксации и криозащиты мыши глазных задних чашек, которые дают последовательные и надежные данные IHC.

Protocol

Все описанные здесь методы были выполнены в строгом соответствии с рекомендациями Национального руководства по охране здоровья по уходу и использованию лабораторных животных, предоставленными Институтом лабораторных ресурсов животных, и были одобрены Институциональный комитет по уходу за животными и использованию Университета Пенсильвании.

Все инструменты и оборудование для методов показаны на рисунке 1 и перечислены в таблицематериалов.

1 . Мышь глаз энуклеации, рассечение чашки глаз, и встраивание

1. Эвтаназия мышей суглекислым газом (CO 2), а затем либо обезглавливание (послеродовые мыши P0 - P11) или вывих шейки матки (взрослые мыши и p11). Для мышей P0-P14 глаза покрыты кожей. Убедитесь, что удалить кожу до последующих шагов.
2. Отметьте височной части глаза(рисунок 2A) слегка сжигая роговицу с помощью хвостового каутеризатора. Избегайте сжигания отверстия в роговицы, касаясь роговицы очень легко и не более чем на долю секунды с cauterizer.
3. Немедленно энуклират ные глаза мыши с помощью изогнутых Дюмон #5/ 45 щипцы. Инкубировать в течение 15 минут в 1,5 мл криотрубки с 1 мл 4% параформальдегида (PFA) в фосфат-буферированном сольнике (PBS) на льду.
4. После 15 мин в 4% PFA, передача фиксированного глаза с помощью изогнутых щипцы Дюмон #5/45 в измененном 35 мм вскрытия блюдо (см. Таблица материалов и Рисунок 1C) заполнены PBS и место под рассекречивающим микроскопом.
5. Сделайте небольшой разрез на ожоговой отметке, перпендикулярно и чуть выше лимба (граница роговицы) с помощью микро-нож.
6. Вставьте изогнутые ножницы в разрез и выполните окружной разрез роговицы после лимба(рисунок 2B).
7. Снимите роговицу и извлечь линзу с тонкой Дюмон #5 щипками,(Рисунок 2B) и поднимите его деликатно от задней части глаза. Стекловидное тело, прозрачный гель, который заполняет пространство между объективом и сетчаткой, выйдет с объективом(Рисунок 2B) и сетчатки будут видны как белая поверхность, покрывающая внутреннюю часть задней чашки глаза. Убедитесь, что нет никаких видимых повреждений сетчатки, таких как отверстия или слезы(рисунок 2C).
8. Вымойте глазные чашки дважды в 1 мл PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.
9. Криозащита глаз чашки, уравновешись их в растворе 15% сахарозы в PBS ночь на 4 градусов по Цельсию, пока глаз чашка раковины
10. Передача глаз чашки 30% сахарозы в PBS для 2-3 ч, пока глаз чашка тонет.
11. Встраивайте чашки глаз в OCT в криомолды 10 x 10 мм(рисунок 3A). Используя рассекающий микроскоп, ориентируйте глаз в криомольде вдоль его рстально-вентральной оси(Рисунок 2D, Рисунок 3A) при повороте глаза, пока след ожога находится на вершине, зрительный нерв находится слева и вырезанная часть плесени стоит справа ( Рисунок 2D). Позаботьтесь, чтобы избежать пузырьков вблизи ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы манипулировать глазчашкой, используйте титановый зонд из титановой проволоки, прикрепленной к кончику пипетки.
12. Чтобы заморозить ткани сытинальной ткани, погрузите криомольд в течение по крайней мере 5 мин в металлический стакан, содержащий изопентан и поместите стакан в жидкий азот или сухой лед /100% этанол ванны (до 1/3 от высоты металлического стакана).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Криомольд должен быть погружен в изопентан больше половины своей высоты, но не должен быть полностью погружен.
13. Снимите замороженный блок и заверните его в алюминиевую фольгу.
14. Хранить при -80 градусах по Цельсию.
15. Отметьте замороженный блок с помощью ручки или резкости для записи ориентации блока(рисунок 3B).

2 . Секция с использованием криостата

1. После регулировки криостатной температуры (от -20 до -25 градусов по Цельсию) позвольте плесеням, содержащим встроенные чашки для глаз, уравновеситься до температуры криостата в течение 1 ч.
2. Установите блок с дорсо-вентральной ориентации(рисунок 3C) и вырезать 10 мкм толщиной серийных разделов. Аккуратно поместите участки сытов для стины на аннотированных и пронумерованных слайдах микроскопа.
3. Храните слайды в слайд-боксах при -20 градусах по Цельсию или -80 градусов до процедур IHC.

3 . Флуоресценция иммуностоинга с помощью слайд-стойки

ПРИМЕЧАНИЕ: Система Slide Rack (например, Sequenza) содержит слайды стеклянного микроскопа с крышкой пластины, создавая капиллярный зазор в размере 100 евро между слайдом и пластиной.

1. Оттепель криосекций при комнатной температуре (RT) на 2 ч до 4 ч, чтобы позволить им высохнуть и прикрепить к микроскопу слайды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно также высушить их при 30-37 градусах по Цельсию в течение 30 мин до 1 ч.
2. Поместите слайды в Слайд Стойка и мыть секции сыворотки дважды в 100-200 Л Л. PBS в течение 2 минут.
3. Пермяки ретинальных секций путем инкубации их в 0,25% Triton-X / 0,05% NaN₃в PBS в течение 5 минут на RT.
4. Добавьте 100 зл блокирующего раствора на слайды.
5. Добавьте 100 л первичных антител, разбавленных в блокирующем растворе на слайдах.
6. Инкубировать участки ретины на ночь при 4 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени, крышка слайд Стойка, чтобы избежать высыхания разделов.
7. Вымойте секции сытов 3 раза, каждый в течение 15 минут, используя 200 Л Л PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление 0,001- 0,002% Triton-X100 к PBS (PBS-T) позволяют более строгие мыть, но может нарушить некоторые мембраны и клеточные структуры.
8. Инкубировать участки сеттины в флуоресцентных маркировке вторичных антител в течение 1 ч на RT. Отныне защитите от света.
9. Вымойте секции сытов 3 раза, каждый в течение 15 минут.
10. Инкубировать участки сытов в/рейко на РТ в течение 5 минут с ядерным маркером, таким как Hoechst 33342 или DAPI решение.
11. Вымойте участки сытины 1 раз в течение 15 минут.
12. Поместите крышку на верхней части бумажного полотенца на скамейке лаборатории.
13. Добавьте 2 капли антиугасающих монтажных носителей в центр coverslip.
14. Переверните слайд, чтобы иметь крио-сечение с вышек.
15. Тщательно смонтируйте крышку медленно, под углом 45, наклоняйте слайд на монтажные носители.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегая формирования пузырьков, как вы опустите слайд на месте.
16. Применить даже давление, используя тяжелую книгу или каталог (см. ниже), к слайд-coverslip комбинации для устранения избыточного монтажа средств массовой информации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения согласованности в подготовке образца, всегда используйте один и тот же объект (т.е. одну и ту же книгу или каталог), чтобы применить даже давление на обложку во время монтажа слайда.
17. Держите плоский и дайте затвердеть на ночь на RT в темноте. Хранить слайды плоские при 4 градусах по Цельсию на неопределенный срок.
18. Изображение с помощью широкой полевой или конфокальной флуоресценции микроскопии(рисунок 4).

Representative Results

Чтобы проиллюстрировать, как эти протоколы, обеспечить оптимальное сохранение сетчатки для IHC, мы исследовали участки сетчатки от p28 WT мышей (C57BL/6N) с антителами к родопсину (маркер фоторецептора)⁸, глутаминовой кислотой decarboxylase 65 (Gad65, амакринная клетка маркер)⁹, глутамин синтезаза (GS, маркер клетки Мюллера)¹⁰, и calbindin (горизонтальный маркер клетки)¹¹ (Рисунок 4). IHC указывает на то, что наши протоколы стабильно дают высококачественные и хорошо сохранившиеся секции сетточной сетки. Примечательно, что богатые родопсином внутренние и внешние сегменты остаются вертикальными и нетронутыми практически без отделения от верхнего пигментного эпителия религена (RPE) (Рисунок 4A). Кроме того, клетки Мюллера остаются хорошо сохранившимися с сомой, правильно выровненные и цитоплазмамные процессы, которые простираются от слоя клеток ганглия (GCL) к внешнему ядерному слою (ONL) (Рисунок 4B).

Интернейроны, такие как Gad65-положительные амакринные клетки, также остаются должным образом стратифицированы в РАМКАХ INL и внутреннего плексиформного слоя (IPL) (Рисунок 4B), в то время как четко определенные горизонтальные клетки обнаруживаются на INL и внешней плексиформе слочок (OPL) граница(рисунок 4C). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что наш метод сохраняет целостность клеток и тканей, от фоторецепторов до ганглия-клеток

Для облегчения поперечного сечения, важно тщательно сориентировать оптическую чашку в крио-плесени до замораживания. Неправильно ориентированные сетчатки, плохой метод секции или секции с тупой или поврежденных ножей микротомможет вызвать артефакты, такие как слезы тканей сетчатки, искажения и клеточное смещение, как на рисунке 4. Примеры артефактов раздела отображаются на рисунке 4D-F. На рисунке 4D плохое сечение и выравнивание приводят к искажению внутреннего и внешнего сегментов фоторецептора (рисунок4D)и мелким тканевым слезам (рисунок4E,стрелка). В другом примере плохая ориентация тканей до раздела приводит к неоптимальному выравниванию клеточной сомы Мюллера и цитоплазматических процессов Рисунок 4E. Рисунок 4F показывает, как плохое сечение, вероятно, вызвано тупой нож микротома вызвало горизонтальные клетки аберрантно мазок из OPL в GCL. Таким образом, необходимо уделять особое внимание выполнению каждого шага, изложенного в протоколе, для обеспечения высочайшего качества и воспроизводимости данных IHC.

Рисунок 1 : Инструменты для рассечения глаз мыши, встраивания, и IHC. (A) Каутеризер; (B) Инструменты рассечения слева направо: Dumont #5/45 изогнутые щипцы, кривые ножницы, и Дюмон #5 тонкие щипцы; (C) 35-мм рассечение тарелки (стрелка указывает на вскрытие камеры); (D) Расчленяющий микроскоп; (E) Замороженные инструменты слева направо: изолированный кулер, стакан из нержавеющей стали для изопентановой ванны, жидкость из нержавеющей стали N₂ ванны; (F) титановый зонд; (G) Слайд Стойка и обложка для IHC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2 : Мышь глаз чашка ориентации и описания. (A) Временное расположение отметки ожога (красная стрелка) для облегчения ориентации глаз (дорсо D, вентрал й V, височной , T, носовой No N). (B) Схема для рассечения глаз мыши. Небольшой разрез делается на ожоговой отметке, перпендикулярно в роговицу и чуть выше лимба с помощью тонкого скальпеля (Микро-нож). Вырезать вокруг роговицы, чтобы отделить переднюю и заднюю часть глаза. (C) Глазная чашка с нетронутой сетчаткой. (D) Дорсо-вентральная ориентация глаза мыши с зрительным нервом (ON), линзой (L), роговицой (C) лимбом (ОС). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3 : Мышь глаз встраивания. (A) Дорсо-вентральный ориентированных мышей глаз чашку в криомольд заполнены OCT, (B) Замороженные мыши жевательной чаши в аннотированных криомолд. (C) Криостат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4 : Иммуногистохимия сетчатки сетчатки мыши. (A-C) Хорошее качество и (D-F) плохое качество секций свитины от P28 WT были помечены антителами к родопсину (A, C) амакрин маркер GAD65 (B, E) и Мюллер азначитэрный маркер глутамина синтетаза (GS; B, E) и горизонтальный маркер клеток calbindin (C, F). Белые стрелки указывают на слезы тканей и аномальное размазывание ткани. Шкала бар, 20 мкм. Ядра помечены Hoechst 33342 (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Рассечение сетчатки мыши является деликатным процессом из-за небольшого размера и формы мыжеток и хрупкости ткани сетчатки. Несмотря на то, что выполнение высококачественного вскрытия является вопросом практики, наличие детального протокола, предоставление эффективных методов и советов является необходимостью получения секций сетчатого и IHC. В дополнение к протоколам, описанным здесь, есть несколько советов, которые позволяют последовательно высокого качества сетточной секции, которые подходят для воспроизводимых IHC.

Перед началом с вскрытия, важно быть удобным, расслабленным и установить освещение комнаты для оптимального зрения во время микродиссекции глаз мыши. Для поддержания формы чашки глаза мыши при вскрытии глаза, мы предлагаем держать глаза погруженными в PBS в изготовленных на заказ восковых посудах покрытия. Мы предлагаем покрытие 35 мм вскрытия блюдо с светло-розовый цвет зубного воска(рисунок 1C). Действительно, светло-розовый цвет зубного воска обеспечивает адекватный контраст, чтобы увидеть легко глазных структур под рассеиванием сферы, глаза размера впечатления в воске, сделанные путем нажатия базы микрофуга труб в воск, будет держать глаз чашку на месте в то время как позволяет соответствующее вращение инструментов вокруг чашки глаза во время вскрытия. Кроме того, важно удалить как можно больше стекловидной жидкости из чашки глаза, как это возможно при удалении объектива, как остаточная стекловидной жидкости склонна к форме ткани повреждения кристаллов льда во время ткани блока замораживания шаг. Обычно мы используем бумажную ткань и помещаем ее на границу расчлененной чашки глаза, чтобы тщательно удалить все оставшиеся стекловидной жидкости капиллярами, не нарушая ткани сетчатки. В прискорбном случае, когда небольшое количество остаточной стекловидной жидкости все еще присутствует в чашке глаза, секционирование должно быть сделано при -20 градусов по Цельсию, чтобы уменьшить преобразование стекловидного тела во льду и, следовательно, сохранить резкость лезвия и качество секции .

Методы фиксации и встраивания также оказывают существенное влияние на качество секций и МХК. Хотя формалин фиксированной парафина встроенных разделов дают оптимальную структурную целостность ткани глаза, формалин содержит метанол, который может повысить фоновый флуоресценции. Чтобы избежать этих артефактов, мы рекомендуем использовать свежий параформальдегид класса EM (PFA) для ограничения фона и автофлюоресценции, вызванной метанолом или окисленной PFA^4,5,6. Мы рекомендуем мягкие условия фиксации, описанные в нашем протоколе фиксации глаз с 4% параформальдегида в течение 15 минут на льду. Так как PFA быстро проникает в ткани, но поперечные белки очень медленно, эти условия достаточны для сохранения структурной целостности корыты во время вскрытия и сохранения антигенов общей ретины без необходимости антигена методы поиска⁴. Если структура сетчатки не хорошо сохранилась, продолжительность фиксации PFA может быть увеличена, однако важно знать, что чрезмернофиксационные ткани усилят неспецифическую фоновом универсалию и могут привести к маскировке эпитопов, в то время как нефиксация ткани могут поставить под угрозу структурную целостность ткани и привести к потере некоторых антигенов, склонных к протеолитической деградации. Поскольку короткое время инкубации PFA является относительно мягкой фиксацией, мы также рекомендуем оснастки замораживания сетчатки путем погружения OCT-встроенный глаз, содержащийся в криомольд (10 мм х 10 мм х 5 мм), в изопентан ванне погружен в жидкий азот. Привязка замораживания тканей сохранит антигены, в то время как сахарозы раствор и OCT выступать в качестве крио-защиты. Этот метод позволит уменьшить искажение тканей за счет образования кристаллов льда, что может привести к так называемому швейцарскому сыру типа повреждения тканей. Криомольд не следует окунать непосредственно в жидкий азот или он начнет кипеть, образуя паровый барьер, и что замедлит процесс замораживания, в результате чего неоднородное фиксации и сохранения. Кроме того, ткани и OCT при контакте с жидкимазотом могут треснуть, тем самым влияя на целостность глаза 7. Поэтому мы рекомендуем окунать криомольд (10 мм х 10 мм х 5 мм) в изопентан глубиной не более 5 мм с помощью небольшого стакана из нержавеющей стали, сам окунутого в более крупный стакан из нержавеющей стали (минимум шириной 100 мм), содержащий жидкий азот. Чтобы избежать быстрого испарения жидкого азота при подготовке нескольких образцов, мы держим обе ванны в изолированном холодильнике. Следует отметить, что криоконсервирующие ткани в ОКТ не является долгосрочным методом сохранения, из-за образования кристаллов льда в ткани с течением времени, которые могут изменить субклеточной морфологии и / или денатурации некоторых антигенов. Следовательно, блоки ткани и замороженные разделы должны храниться при -20 градусах Цельсия для кратковременного хранения и для долгосрочного хранения -80 градусов по Цельсию.

Сетчатка млекопитающих является асимметричным органом с определенным пространственным распределением клеток по височно-носовым и дорсо-вентральным осям. Например, конусы M- и S-opsin расположены в конкретном дорсо-вентральном градиенте ^12. Поэтому, важно обеспечить правильную ориентацию глаза в течении подготовки ткани и сечения для того чтобы выполнить сравнительный IHC. Мы используем cauterizer, чтобы поместить эталонный знак на глаз до вскрытия(Рисунок 2A,D), так что мы можем сориентировать чашку глаза вдоль его псих-вентральной оси во время встраивания фазы, и, следовательно, получение совершенно поперечных разделов. Мы помещаем след ожога на дорсо-временной части глаза, касаясь роговицы на долю секунды с каутеризатором. Это позволит слегка сжечь роговицу, избегая при этом прокалывания отверстия в нее. Во время вскрытия чашки глаза, мы делаем небольшой разрез, на ожоговой отметке, перпендикулярно границе роговицы, используя микро-нож(рисунок 2B). Для облегчения дорсо-вентральной ориентации блока и минимизации регулировок ориентации во время секции, мы предлагаем ориентировать заднюю чашку глаза в криомольде, с ожоговой отметкой, обращенной к нижней части криомолд и открытию роговицы идеально параллельно правой стороне криомольд(рисунок 3A, B). Замороженный блок будет установлен с нижней части блока, обращенного к лезвию в криостате, глазная чашка перпендикулярно лезвию, в дорсо-вентральной ориентации(рисунок 3c).

Надежная сетчатка IHC начинается с оптимального, адаптированного и воспроизводимого вскрытия и обработки тканей. Метод, описанный здесь, оптимально сохраняет структуру и целостность сетчатого находятся при минимизации автофлюоресценции и маскировки эпитопов, которые могут скомпрометировать флуоресцентный IHC. Следуя этому протоколу, вы будете иметь воспроизводимые высококачественные данные.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods