Este informe describe métodos completos para preparar secciones de retina de ratón congeladas para inmunohistoquímica (IHC). Los métodos descritos incluyen disección de la copa ocular posterior, fijación de paraformaldehído, incrustación en la temperatura de corte óptima (OCT) orientación de medios y tejidos, seccionamiento e inmunomancha.
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Artículo de método
Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica
En este artículo
Resumen
Resumen
La preparación de secciones oculares de ratón de alta calidad para la inmunohistoquímica (IHC) es fundamental para evaluar la estructura y la función de la retina y para determinar los mecanismos subyacentes a las enfermedades de la retina. Mantener la integridad estructural en toda la preparación del tejido es vital para obtener datos reproducibles de IHC de la retina, pero puede ser difícil debido a la fragilidad y complejidad de la citoarquitectura de la retina. Los fijadores fuertes como el 10% de la formalina o la solución de Bouin preservan de manera óptima la estructura de la retina, a menudo impiden el análisis de IHC al mejorar la fluorescencia de fondo y/o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, un proceso conocido como enmascaramiento de epítopos. Los fijadores más leves, por otro lado, como el 4% de paraformaldehído, reducen la fluorescencia de fondo y el enmascaramiento de epítopos, se deben utilizar técnicas de disección meticulosas para preservar la estructura de la retina. En este artículo, presentamos un método integral para preparar vasos posteriores oculares de ratón para IHC que es suficiente para preservar la mayoría de las interacciones entre anticuerpos y epítopos sin pérdida de integridad estructural de la retina. Incluimos IHC representativo con anticuerpos a varios marcadores de tipo célula de la retina para ilustrar la preservación y orientación del tejido en condiciones óptimas y subóptimas. Nuestro objetivo es optimizar los estudios IHC de la retina proporcionando un protocolo completo de la disección ocular posterior de la copa a IHC.
Introducción
La inmunohistoquímica (IHC) es una poderosa técnica para localizar proteínasespecíficas y estructuras celulares en tejidos in situ 1,2,3. Los métodos de fijación inapropiados y la sección subóptima de tejidos complejos pueden alterar la estructura tisular, generar manchas de fondo alto o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, lo que resulta en artefactos de tinción y la consiguiente interpretación errónea de Datos IHC4. Como la retina vertebrada es un órgano neural complejo y altamente organizado compuesto por estratos de fotorrecept....
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Protocolo
Todos los métodos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía de Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio proporcionada por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.
Todas las herramientas y equipos para los métodos se muestran en la Figura 1 y se enumeran en la Tabla de materiales.
1 . Enucleación del ojo del ratón, disección de la copa del ojo, y la incrustación
- Rato....
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Resultados
Para ilustrar cómo estos protocolos, aseguran una preservación óptima de la retina para IHC, sondeamos secciones de retina de ratones P28 WT (C57BL/6N) con anticuerpos contra la rodopesina (un marcador de fotorreceptor)8, ácido glutámico descarboxilasa 65 (Gad65, una célula de amacrina 9, glutamina sintetasa (GS, un marcador de célula de M'ller)10, y calbindina (un marcador de celda horizontal)11
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Discusión
La disección de la retina del ratón es un proceso delicado debido al pequeño tamaño y forma de los ojos del ratón y la fragilidad del tejido de la retina. A pesar de que realizar disección de alta calidad es una cuestión de práctica, tener un protocolo detallado, proporcionar métodos y consejos eficientes es una necesidad para obtener secciones de retina e IHC. Además de los protocolos descritos aquí, hay varios consejos que permiten secciones de retina consistentes de alta calidad que son adecuadas para IHC reproducible.......
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Divulgaciones
Sin revelaciones.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos de NIH (RO1-GMO97327) y la University Research Foundation (UPenn). Agradecemos especialmente a Svetlana Savina por su ayuda en el desarrollo del protocolo de inmunohistoquímica, Gordon Ruthel (Universidad de Pensilvania) y Penn Vet Imaging Core por su ayuda con la microscopía y Leslie King, Ph.D. por la lectura crítica de este manuscrito .
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vaso de precipitados de acero inoxidable de 6 cuartos (185 x 218 mm) | Gilson | #MA-48 | Para nitrógeno líquido (Figura 1E) |
| Papel de aluminio | |||
| Cauterizador | Bovie | #AA01 | Para marcar la orientación de los ojos (Figura 1A) |
| Pinzas curvas, pinzas Dumont #5/45, dobladas 45 grados | Ciencias de la microscopía electrónica | # 72703-D | Para la enucleación y el mantenimiento del ojo del ratón (Figura 1A) |
| Tijeras curvas, tijeras de resorte Vannas - borde de corte de 2,5 mm | Herramientas de Bellas Ciencias | #15002-08 | Para cortar circunferencialmente la córnea (Figura 1B) |
| Plato | Para la disección de la copa del ojo (Figura 1C) | ||
| Microscopio de disección | Leica, Houston, Estados Unidos | MZ12.5 Micro cuchillos de microscopio estereoscópico | |
| - Mango de plástico | Herramientas de Bellas Ciencias | #10315-12 | Para hacer una pequeña incisión en la marca de la quemadura (Figura 1A) |
| Cera dental rosa | Ciencias de la Microscopía Electrónica | #72660 | Para recubrimiento de plato de disección |
| Slide Rack y cubierta | Ted Pella | #36107 | Para retinal IHC (Figura 1G) |
| Vaso de precipitados de acero inoxidable (89 x 114 mm) | Gilson | #MA-40 | Para baño de isopentano (Figura 1E)Caja |
| espuma de poliestireno | Para enfriador aislado | ||
| Pinzas delgadas Dumont # 5 | Herramientas de Bellas Ciencias | #11254-20 | Para extraer la córnea y extraer el cristalino (Figura 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) | Ciencias de la Miscroscopia Electrónica | #62534-10 | Molde para |
| < >tampones y re | Compañía | Número de catálogo | Comentarios |
| Solución | 2% Suero de caballo normal, 1,5% Gelatina de piel de pescado fría (al 40-50% en H2O, #G7765 de gato), 5% de albúmina sérica bovina (cat #AK1391-0100) en tampón de permeabilización. | ||
| Gelvatol (medio de montaje antidecoloración) | disuelva 0,337 g de DABCO (Sigma cat #D2522-25G) en 10 ml de Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Ajuste a pH 8-8.5 con 12N HCl (~ 5 gotas). Almacene en una botella de gota ámbar a 4 & grados; C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml en PBS (1000x). Alícuota y almacenamiento en la oscuridad, a 4° C hasta por 1 año o a -20 grados; C para almacenamiento a largo plazo. Preparar fresco a 1 ug/mL (1x) |
| Isopentano, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| (PFA) en ciencias de | microscopía electrónica PBS | #15710 | Preparado fresco 4% PFA a partir de 16% de stock de PFA. Almacene el 16% de PFA restante a 4 grados; C en la oscuridad. |
| de permeabilización | PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0,05% NaN3. Prepáralo fresco. | ||
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0,02 g/L KCl, 0,02 g/L KH2PO4, 0,8 g/L NaCl, 0,216 g/L Na2HPO4 , pH 7,4. Preparado a partir de 10x stock |
| Soluciones de sacarosa | Fisher Scientific | #S-5-500 | Disuelva la cantidad adecuada de sacarosa en 37 C PBS (tarda ~15 min en disolverse). Puede almacenarse durante unos días a 4&nb;C. |
| Compuesto Tissue-Tek OCT | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Número de catálogo | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | Para etiquetar células horinzotales |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | Para etiquetar GABAcélulas amacrinas érgicas |
| anti-GS | BD Transduction 610517 | Para etiquetar Mü células ller | |
| anti-rodopsina | Millipore MAB5316 | Para etiquetar cañas |
Referencias
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H.
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Reimpresiones y permisos
