Summary
Este informe describe métodos completos para preparar secciones de retina de ratón congeladas para inmunohistoquímica (IHC). Los métodos descritos incluyen disección de la copa ocular posterior, fijación de paraformaldehído, incrustación en la temperatura de corte óptima (OCT) orientación de medios y tejidos, seccionamiento e inmunomancha.
Abstract
La preparación de secciones oculares de ratón de alta calidad para la inmunohistoquímica (IHC) es fundamental para evaluar la estructura y la función de la retina y para determinar los mecanismos subyacentes a las enfermedades de la retina. Mantener la integridad estructural en toda la preparación del tejido es vital para obtener datos reproducibles de IHC de la retina, pero puede ser difícil debido a la fragilidad y complejidad de la citoarquitectura de la retina. Los fijadores fuertes como el 10% de la formalina o la solución de Bouin preservan de manera óptima la estructura de la retina, a menudo impiden el análisis de IHC al mejorar la fluorescencia de fondo y/o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, un proceso conocido como enmascaramiento de epítopos. Los fijadores más leves, por otro lado, como el 4% de paraformaldehído, reducen la fluorescencia de fondo y el enmascaramiento de epítopos, se deben utilizar técnicas de disección meticulosas para preservar la estructura de la retina. En este artículo, presentamos un método integral para preparar vasos posteriores oculares de ratón para IHC que es suficiente para preservar la mayoría de las interacciones entre anticuerpos y epítopos sin pérdida de integridad estructural de la retina. Incluimos IHC representativo con anticuerpos a varios marcadores de tipo célula de la retina para ilustrar la preservación y orientación del tejido en condiciones óptimas y subóptimas. Nuestro objetivo es optimizar los estudios IHC de la retina proporcionando un protocolo completo de la disección ocular posterior de la copa a IHC.
Introduction
La inmunohistoquímica (IHC) es una poderosa técnica para localizar proteínasespecíficas y estructuras celulares en tejidos in situ 1,2,3. Los métodos de fijación inapropiados y la sección subóptima de tejidos complejos pueden alterar la estructura tisular, generar manchas de fondo alto o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, lo que resulta en artefactos de tinción y la consiguiente interpretación errónea de Datos IHC4. Como la retina vertebrada es un órgano neural complejo y altamente organizado compuesto por estratos de fotorreceptores interconectados, interneuronas y células ganglionares, es muy frágil y puede ser fácilmente interrumpida durante la disección y seccionamiento. Un protocolo detallado, estandarizado y validado desde la disección de ojos del ratón y la orientación hasta la inmunomancha ayudará a reducir significativamente los artefactos IHC, aumentando así la fiabilidad de los resultados y permitiendo datos comparativos más precisos Análisis.
Hay muchos protocolos para la preparación de tejidos para IHC, sin embargo, no todos son adecuados para el tejido de la retina. Fijadores fuertes como 10% de formalina o solución de Bouin preservan la estructura de la retina durante la disección y seccionamiento5. Desafortunadamente, los fijadores fuertes a menudo conducen a la fluorescencia de fondo mejoraday el enmascaramiento de epítopos debido a la modificación química de los epítopos 6. Por otro lado, fijadores más suaves, como 4% paraformaldehído (PFA) pueden aliviar algunos de estos artefactos, pero requieren disección meticulosa y seccionamiento para preservar la estructura óptima de la retina. La PFA penetra rápidamente en el tejido, pero relatifica las proteínas muy lentamente, reduciendo el riesgo de enmascaramiento de epítopos. Dado que la incubación de PFA de poco tiempo es una fijación relativamente leve, los tejidos a menudo requieren una congelación rápida para preservar los antígenos. Es importante evitar la formación de cristales de hielo durante la congelación de tejidos, ya que distorsionan y dañan la integridad de las células y tejidos7.
Aquí describimos protocolos detallados y estandarizados para la disección, fijación y crioprotección de copas posteriores oculares de ratón que producen datos De IHC consistentes y confiables.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía de Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio proporcionada por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.
Todas las herramientas y equipos para los métodos se muestran en la Figura 1 y se enumeran en la Tabla de materiales.
1 . Enucleación del ojo del ratón, disección de la copa del ojo, y la incrustación
- Ratones eutanasiados con dióxido de carbono (CO2) seguidos de decapitación (ratones postnatales P0 - P11) o luxación cervical (adultos > ratones P11). Para ratones P0-P14, los ojos están cubiertos por la piel. Asegúrese de retirar la piel antes de los pasos posteriores.
- Marque la parte temporal del ojo (Figura2A)quemando ligeramente la córnea usando un cauterizador de cola. Evite quemar un agujero en la córnea tocando la córnea muy ligeramente y durante no más de una fracción de segundo con el cauterizador.
- Inmediatamente enuclea los ojos del ratón usando #5 Dumont curvado/45 fórceps. Incubar durante 15 minutos en un tubo criotubo de 1,5 ml con 1 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina con fosfato (PBS) sobre hielo.
- Después de 15 minutos en 4% pfa, transfiera el ojo fijo utilizando los fórceps curvos Dumont #5/45 a una placa de disección modificada de 35 mm (ver Tabla de Materiales y Figura 1C)llena de PBS y colóquela bajo el microscopio de disección.
- Hacer una pequeña incisión en la marca de quemadura, perpendicular y justo por encima del limbo (borde de la córnea) usando el micro cuchillo.
- Inserte las tijeras curvas en la incisión y realice un corte circunferencial de la córnea después del limbo (Figura 2B).
- Retire la córnea y extraiga la lente con un Dumont delgado #5 fórceps, (Figura2B)y levántela delicadamente de la parte posterior del ojo. El cuerpo vítreo, el gel transparente que llena el espacio entre la lente y la retina, saldrá con la lente (Figura2B)y la retina será visible como una superficie blanca que cubre el interior de la copa ocular posterior. Asegúrese de que no haya ningún daño visible a la retina, como agujeros o desgarros (Figura2C).
- Lave los vasos oculares dos veces en 1 ml de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Cryoprotect los vasos oculares equilibrando en una solución de 15% de sacarosa en PBS durante la noche a 4oC hasta que el ocular se hunda
- Transfiera los vasos oculares a una sacarosa del 30% en PBS durante 2-3 h hasta que la copa del ojo se hunda.
- Incruste los oculares en OCT en criomoldes de 10 x 10 mm (Figura3A). Usando un microscopio de disección, oriente el ojo en el criomold a lo largo de su eje dorsal-ventral (Figura2D, Figura 3A) girando el ojo hasta que la marca de quemadura esté en la parte superior, el nervio óptico esté a la izquierda y la parte recortada del molde se dirija hacia la derecha ( Figura 2D). Tenga cuidado de evitar burbujas cerca del tejido.
NOTA: Para manipular la copa del ojo, utilice una sonda de titanio hecha de un alambre de titanio unido a una punta de pipeta. - Para congelar a presión el tejido de la retina, sumerja el criomold durante al menos 5 minutos en un vaso de precipitados metálicos que contenga isopentano y coloque el vaso de precipitados en nitrógeno líquido o en el baño de etanol seco/100% (hasta 1/3 de la altura del vaso de precipitados metálicos).
NOTA: El criomold debe sumergirse en isopentano a más de la mitad de su altura, pero no tiene que estar completamente sumergido. - Retire el bloque congelado y envuélvalo en papel de aluminio.
- Conservar a -80oC.
- Marque el bloque congelado con un lápiz o un punzón para registrar la orientación del bloque (Figura3B).
2 . Seccionamiento con un criostato
- Después de ajustar la temperatura del criostato (entre -20 y -25 oC), permita que los moldes que contienen los vasos oculares incrustados se equilibren a la temperatura del criostato durante 1 h.
- Instale el bloque con orientación dorso-ventral (Figura3C)y corte secciones seriales de 10 m de espesor. Coloque cuidadosamente las secciones de la retina en diapositivas de microscopio anotadas y numeradas.
- Almacene las diapositivas en cajas deslizantes a -20 oC o -80 oC hasta los procedimientos de IHC.
3 . Inmunomanchado de fluorescencia con el rack deslizante
NOTA: El sistema Slide Rack (p. ej., Sequenza) sostiene las guías del microscopio de vidrio con una placa de cubierta, creando un espacio capilar de 100 l entre la corredera y la placa.
- Descongelar las criosecciones a temperatura ambiente (RT) durante 2 h a 4 h para permitir que se sequen y se adhieran a los portaobjetos del microscopio.
NOTA: También es posible secarlos a 30-37 oC durante 30 min a 1 h. - Coloque los portaobjetos en el portaobjetos y lave las secciones de la retina dos veces en 100-200 l de PBS durante 2 min.
- Permeabilizar las secciones de la retina incubando en 0.25% Tritón-X / 0.05% NaN3en PBS durante 5 min a RT.
- Añadir 100 sl de solución de bloqueo a las diapositivas.
- Añadir 100 s de anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo a las diapositivas.
- Incubar secciones de retina durante la noche a 4 oC.
NOTA: Durante este tiempo, cubra el portaobjetos para evitar la desecación de las secciones. - Lavar las secciones de la retina 3 veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 200 s de PBS.
NOTA: La adición de 0.001- 0.002% Triton-X100 a PBS (PBS-T) permite un lavado más estricto, pero puede interrumpir algunas membranas y estructuras celulares. - Incubar secciones de retina en anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente durante 1 h a RT. A partir de ahora, protéjase de la luz.
- Lave las secciones de la retina 3 veces, cada una durante 15 minutos.
- Incubar las secciones de retina a RT durante 5 minutos con un marcador nuclear como Hoechst 33342 o solución DAPI.
- Lave las secciones de la retina 1 vez durante 15 min.
- Coloque una cubierta encima de una toalla de papel en el banco de laboratorio.
- Agregue 2 gotas de soporte de montaje antidecoloración al centro de la cubierta.
- Gire la diapositiva para tener la criosección de la retina hacia abajo.
- Monte con cuidado el cubreobjetos lentamente, en un ángulo de 45o, incline la corredera sobre el soporte de montaje.
NOTA: Evitar la formación de burbujas a medida que baja la diapositiva en su lugar. - Aplique una presión uniforme, utilizando un libro o catálogo pesado (ver más abajo), a la combinación de deslizamiento deslizante para eliminar el exceso de medios de montaje.
NOTA: Para garantizar la coherencia en la preparación de la muestra, utilice siempre el mismo objeto (es decir, el mismo libro o catálogo) para aplicar una presión uniforme al cubreobjetos durante el montaje de la diapositiva. - Manténgase plano y deje que se endurezca durante la noche en RT en la oscuridad. Almacene los portaobjetos planos a 4oC indefinidamente.
- Imagen mediante campo ancho o microscopía de fluorescencia confocal (Figura4).
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Representative Results
Para ilustrar cómo estos protocolos, aseguran una preservación óptima de la retina para IHC, sondeamos secciones de retina de ratones P28 WT (C57BL/6N) con anticuerpos contra la rodopesina (un marcador de fotorreceptor)8, ácido glutámico descarboxilasa 65 (Gad65, una célula de amacrina 9, glutamina sintetasa (GS, un marcador de célula de M'ller)10, y calbindina (un marcador de celda horizontal)11 (Figura 4). IHC indica que nuestros protocolos producen consistentemente secciones de retina de alta calidad y bien conservadas. En particular, los segmentos internos y externos ricos en rodopsina permanecen verticales e intactos con poca o ninguna separación de la superficie del epitelio pigmentado de la retina (RPE) (Figura4A). Además, las células de M-ller permanecen bien conservadas con soma correctamente alineados y procesos citoplasmáticos que abarcan desde la capa de células ganglionares (GCL) hasta la capa nuclear exterior (ONL) (Figura4B).
Las interneuronas, como las células amacrinas positivas de Gad65, también permanecen debidamente estratificadas dentro de la capa INL y plexiforme interna (IPL) (Figura 4B),mientras que las células horizontales bien definidas son detectables en el INL y la capa plexiforme externa (Figura 4C). Colectivamente, estos datos demuestran que nuestro método preserva la integridad de las células y tejidos de la retina, desde fotorreceptores hasta células ganglionares
Para facilitar el seccionamiento transversal, es importante orientar meticulosamente la copa óptica en el criomol antes de la congelación. Las retinas desorientadas, la mala técnica de seccionamiento o el seccionamiento con cuchillos microtomos o apagados pueden causar artefactos como desgarros del tejido de la retina, distorsiones y desplazamiento celular, como en la Figura4. En la Figura 4D-Fse muestran ejemplos de artefactos de sección. En la Figura 4D, el mal seccionamiento y la alineación conducen a la distorsión de los segmentos internos y externos del fotorreceptor (Figura4D)y pequeños desgarros de tejido (Figura4E, flecha). En otro ejemplo, la orientación deficiente del tejido antes de la sección conduce a una alineación subóptima del soma de células de Muller y los procesos citoplasmáticos Figura 4E. La Figura 4F muestra cómo la mala sección probablemente causada por un cuchillo microtomo apagado hizo que las células horizontales se manchan de la OPL a la GCL. Por lo tanto, se debe prestar atención precisa a la ejecución de cada paso descrito en el protocolo para garantizar la máxima calidad y reproducibilidad de los datos de IHC.
Figura 1 : Herramientas para la disección de ojos del ratón, incrustación e IHC. (A) Cauterizador; (B) Herramientas de disección de izquierda a derecha: Fórceps curvos Dumont #5/45, tijeras curvas y Dumont #5 fórceps delgados; (C) plato de disección de 35 mm (la flecha apunta a la cámara de disección); (D) Microscopio de disección; (E) Herramientas congeladas de izquierda a derecha: Enfriador aislado, vaso de precipitados de acero inoxidable para baño de isopentano, líquido de acero inoxidable N2 baño; (F) sonda de titanio; (G) Bastidor deslizante y cubierta para IHC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Orientación y descripción de la copa del ojo del ratón. (A) Ubicación de la marca de quemadura temporal (flecha roja) para facilitar la orientación ocular (dorso - D, ventral - V, temporal - T, nasal - N). (B) Esquema para la disección de ojos del ratón. Se realiza una pequeña incisión en la marca de quemadura, perpendicular en la córnea y justo por encima del limbo usando un bisturí fino (Micro cuchillo). Corte alrededor de la córnea para separar la parte anterior y posterior del ojo. (C) Copa ocular con retina intacta. (D) Orientación dorso-ventral del ojo del ratón con el nervio óptico (ON), lente (L), córnea (C) el limbo (SS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Incrustar el ojo del ratón. (A) Copa de ojos de ratones orientadas dorso-ventral en criomold lleno de OCT, (B) Copa de retina de ratón congelada en criomold anotado. (C) Criostato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Inmunohistoquímica de la retina del ratón. (A-C) Lassecciones de retina de mala calidad y (D-F) de mala calidad de P 28 WT fueron etiquetadas con anticuerpos contra el marcador de rodopina (A, C) de amacrina GAD65 (B, E) y el marcador celular de glutamina sintetasa (GS; B, E) y el marcador de celda horizontal calbindin (C, F). Las flechas blancas apuntan a desgarros tisulares y aberrantes manchas del tejido. Barra de escala, 20 m. Nuclei etiquetada con Hoechst 33342 (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La disección de la retina del ratón es un proceso delicado debido al pequeño tamaño y forma de los ojos del ratón y la fragilidad del tejido de la retina. A pesar de que realizar disección de alta calidad es una cuestión de práctica, tener un protocolo detallado, proporcionar métodos y consejos eficientes es una necesidad para obtener secciones de retina e IHC. Además de los protocolos descritos aquí, hay varios consejos que permiten secciones de retina consistentes de alta calidad que son adecuadas para IHC reproducible.
Antes de iniciar la disección, es importante estar cómodo, relajado y configurar la iluminación de la habitación para una visión óptima durante la microdisección del ojo del ratón. Para mantener la forma de la copa de los ojos del ratón mientras disecciona el ojo, sugerimos mantener los ojos sumergidos en PBS en platos de disección recubiertos de cera hechos a medida. Sugerimos recubrir un plato de disección de 35 mm con cera dental de color rosa claro (Figura1C). De hecho, el color rosa claro de la cera dental proporciona un contraste adecuado para ver fácilmente las estructuras oculares bajo un alcance de disección, las impresiones del tamaño de los ojos en la cera, hechas presionando la base de los tubos de microfusión en la cera, mantendrá la copa del ojo en su lugar mientras permitiendo la rotación adecuada de las herramientas alrededor de la copa del ojo durante la disección. Además, es importante eliminar tanto líquido vítreo de la copa ocular como sea posible mientras se retira la lente, ya que el líquido vítreo residual es propenso a formar cristales de hielo dañinos en el tejido durante el paso de congelación del bloque de tejido. Generalmente usamos un papel tisú y lo colocamos en el borde de la copa del ojo diseccionada, para eliminar cuidadosamente todo el líquido vítreo restante por capilar sin alterar el tejido de la retina. En el desafortunado caso en el que todavía hay una pequeña cantidad de líquido vítreo residual en la copa ocular, el seccionamiento debe realizarse a -20 oC para reducir la transformación del vítreo en hielo y, por lo tanto, preservar la nitidez de la hoja y la calidad del seccionamiento .
Los métodos de fijación e incrustación también tienen un impacto importante en la calidad de las secciones y el IHC. Aunque las secciones de parafina incrustadas en formalina producen una integridad estructural óptima del tejido ocular, la formalina contiene metanol que puede mejorar la fluorescencia de fondo. Para evitar estos artefactos, recomendamos utilizar paraformaldehído de grado EM fresco (PFA) para limitar el fondo y la autofluorescencia causada por metanol o PFA oxidado4,5,6. Recomendamos las condiciones de fijación leves descritas en nuestro protocolo fijando el ojo con 4% de paraformaldehído durante 15 minutos sobre hielo. Dado que la PFA penetra rápidamente en el tejido, pero las proteínas retigentes muy lentamente, esas condiciones son suficientes para preservar la integridad estructural de la retina durante la disección y preservar la antigenicidad de los antígenos retinianos comunes sin necesidad de antígeno métodos de recuperación4. Si la estructura de la retina no está bien conservada, la duración de la fijación de PFA puede aumentar, sin embargo, es importante tener en cuenta que los tejidos de sobrefijación mejorarán la fluorescencia de fondo no específica y pueden conducir a enmascaramiento de epítopos, mientras que la fijación subfijada los tejidos pueden comprometer la integridad estructural del tejido y causar la pérdida de algunos antígenos propensos a la degradación proteolítica. Dado que la incubación de PFA de poco tiempo es una fijación relativamente suave, también recomendamos retinas de congelación rápida sumergiendo el ojo incrustado en OCT, contenido en un criomold (10 mm x 10 mm x 5 mm), en un baño de isopentano sumergido en nitrógeno líquido. Los tejidos que congelan a presión conservarán los antígenos, mientras que la solución de sacarosa y los PTU actúan como crioprotectores. Este método reducirá la distorsión del tejido debido a la formación de cristales de hielo, que puede causar el llamado tipo de queso suizo de daño tisular. El criomold no debe sumergirse directamente en nitrógeno líquido o comenzará a hervir, formando una barrera de vapor y que ralentizará el proceso de congelación, lo que resultará en una fijación y preservación heterogénea. Además, el tejido y los PTU en contacto con nitrógeno líquido pueden agrietarse, afectando así la integridad del ojo7. Por lo tanto, recomendamos sumergir el criomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) en isopentano de no más de 5 mm de profundidad utilizando un pequeño vaso de acero inoxidable, sumergido en un vaso de precipitados de acero inoxidable más grande (100 mm de ancho mínimo) que contiene nitrógeno líquido. Para evitar la rápida evaporación del nitrógeno líquido durante la preparación de varias muestras, mantenemos ambos baños en un enfriador aislado. Cabe señalar que la criopreservación de los tejidos en los PTU no es un método de conservación a largo plazo, debido a la formación de cristales de hielo en el tejido con el tiempo que puede alterar la morfología subcelular y / o desnaturalizar algunos antígenos. En consecuencia, los bloques de tejido y las secciones congeladas deben almacenarse a -20 oC para el almacenamiento a corto plazo y para el almacenamiento a largo plazo de -80 oC.
La retina de los mamíferos es un órgano asimétrico con una distribución espacial específica de las células a través de los ejes temporal-nasal y dorso-ventral. Por ejemplo, los conos M y S-opsin están dispuestos en un gradiente dorso-ventral específico 12. Por lo tanto, es esencial asegurar la orientación adecuada del ojo a lo largo de la preparación y seccionamiento del tejido con el fin de realizar la IHC comparativa. Utilizamos un cauterizador para colocar una marca de referencia en el ojo antes de la disección (Figura2A,D) para que podamos orientar la copa ocular a lo largo de su eje dorsal-ventral durante la fase de incrustación, obteniendo así secciones perfectamente transversales. Colocamos la marca de quemadura en la parte dorso-temporal del ojo, tocando la córnea durante una fracción de segundo con el cauteizador. Esto permitirá quemar ligeramente la córnea evitando perforar un agujero en ella. Durante la disección de la copa ocular, hacemos una pequeña incisión, en la marca de quemadura, perpendicular al borde de la córnea, utilizando el micro cuchillo (Figura2B). Para facilitar la orientación dorso-ventral del bloque y minimizar los ajustes de orientación durante el seccionamiento, sugerimos orientar la copa ocular posterior en el criomold, con la marca de quemadura mirando hacia la parte inferior del criomold y la abertura de la córnea perfectamente paralelo del lado derecho del criomold (Figura3A,B). El bloque congelado se instalará con la parte inferior del bloque mirando hacia la hoja en el criostato, la copa del ojo perpendicular a la hoja, en una orientación dorso-ventral (Figura3c).
La retina confiable IHC comienza con disecciones óptimas, adaptadas y reproducibles y procesamiento de tejidos. El método descrito aquí preserva de manera óptima la estructura y la integridad de la retina, al tiempo que minimiza la autofluorescencia y el enmascaramiento de epítopos que pueden comprometer la IHC fluorescente. Seguir este protocolo garantizará que dispone de datos reproducibles de alta calidad.
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Disclosures
Sin revelaciones.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de NIH (RO1-GMO97327) y la University Research Foundation (UPenn). Agradecemos especialmente a Svetlana Savina por su ayuda en el desarrollo del protocolo de inmunohistoquímica, Gordon Ruthel (Universidad de Pensilvania) y Penn Vet Imaging Core por su ayuda con la microscopía y Leslie King, Ph.D. por la lectura crítica de este manuscrito .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
| Aluminum foil | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
| Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
| Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
| Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
| Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives - Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
| Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
| Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
| Styrofoam box | For insulated cooler | ||
| Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
| Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
| Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
| Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
| Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
| Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
| Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
| anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |
References
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