Summary
이 프로토콜은 설치류 뇌의 다른 세포 구획에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS) 활성을 효율적으로 정량화하도록 설계되었습니다. 사용자는 동일한 동물의 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 작동하는 UPS를 검사하여 이러한 복잡한 분석을 수행하는 데 필요한 동물의 수와 시간을 줄일 수 있습니다.
Abstract
유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 진핵생물의 단백질 분해 및 기타 다양한 세포 과정의 주요 조절제입니다. 뇌에서, 유비퀴틴-프로테아좀 활동의 증가는 시냅스 가소성 및 기억 형성에 매우 중요하며, 이 시스템의 비정상적인 변화는 다양한 신경학적, 퇴행성 및 정신 장애와 관련이 있다. 두뇌에 있는 기능을 유비퀴틴 proteasome 공부에 있는 문제점의 한가지는 단백질 표적, 기능적인 역할 및 규칙의 기계장치가 넓게 변화할 수 있는 모든 세포 구획에 존재한다는 것입니다. 그 결과, 동일한 동물 내의 다른 세포 내 구획에서 뇌 유비퀴틴 단백질 표적화 및 프로테아좀 촉매 활성을 직접 비교하는 능력은 UPS가 시냅스 가소성에 기여하는 방법을 완전히 이해하는 데 매우 중요합니다. 기억력과 질병을 앓고 있습니다. 여기에 설명된 방법은 동일한 설치류(쥐) 뇌에서 핵, 세포질 및 조시냅스 분획을 수집한 다음 프로테아좀 촉매 활성의 동시 정량화(간접적으로 프로테아좀 코어의 활성 제공)를 허용합니다. 만) 및 링키지 특이적 유비퀴틴 단백질 태깅. 따라서, 이 방법은 시냅스 가소성, 기억 형성 및 상이한 질병 상태 동안 동일한 동물의 상이한 뇌 영역에서의 유비퀴틴-프로테아좀 활성의 세포내 변화를 직접 비교하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 동일한 동물 내의 다른 단백질의 세포내 분포 및 기능을 평가하는데 사용될 수 있다.
Introduction
유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 세포 1에서 대부분의 수명이 짧은 단백질의 분해를 제어하는 상호 연결된 단백질구조및 리가제의 복잡한 네트워크입니다. 이 시스템에서, 단백질은 작은 수정기 유비퀴틴에 의해 분해 또는 다른 세포 과정 / 운명에 대한 표시되어 있습니다. 표적 단백질은 7개의 리신(K) 부위(K6, K11, K27, K29, K33, K48 및 K63) 또는 이전 유비퀴틴 2에서 N-말단 메티오닌(M1; 선형으로 알려진) 중하나에서 함께 연결할 수 있는 1-7 유비퀴틴 변형을 획득할 수 있다. 이들 폴리비퀴틴 태그 중 일부는 분해 특이적(K48) 3이며, 다른 것들은 단백질 분해 과정(M1)4,5,6과크게 독립적이다. 따라서, 단백질 유비퀴틴화 과정은 믿을 수 없을 만큼 복잡하며 특정 폴리유비퀴틴 태그의 변화를 정량화하는 능력은 궁극적으로 세포 기능의 변형이 주어진 역할을 이해하는 데 매우 중요하다. 이 시스템의 연구를 더욱 복잡하게 하는, 프로테아좀은 UPS 7의 촉매구조인데, 둘 다 단백질을 저하시키지만 또한 다른 비단백질분해 과정에 관여할 수 있다8,9. 당연히 그 때, 그것의 처음 발견 부터, 정상 및 비정상적인 유비퀴틴-proteasome 활동은 많은 신경학상, 신경 퇴행성 및 정신병학을 포함하여 장기 기억 형성 및 각종 질병 국가에 연루되었습니다 장애10,11. 그 결과, 뇌에서 UPS 활동을 효과적이고 효율적으로 정량화할 수 있는 방법은 궁극적으로 이 시스템이 질병 상태에서 어떻게 dysregulated되는지 이해하고 유비퀴틴 및/또는 프로테아좀 기능.
쥐와 마우스에서 뇌 조직에서 유비퀴틴-프로테아솜 활성을 정량화하는 데 많은 문제가 있는데, 이는 1) 유비퀴틴 수정의 다양성, 및 2) 분포 및 세포 외 구획에 걸쳐 작동하는 UPS의 차동 조절12,13,14. 예를 들어, 기억 형성 동안 뇌에서 유비퀴틴-프로테아좀 기능의 초기 많은 데모는 전체 세포 용해및 단백질 유비퀴틴화 및 프로테아좀 활성 모두에서 시간 의존적 증가를 나타내었으며,15, 16세 , 17세 , 18세 , 19세 , 20. 그러나, 우리는 최근에 유비퀴틴 - proteasome 활동이 학습에 대한 응답으로 세포 외 구획에 걸쳐 광범위하게 변화한다는 것을 발견했으며, 일부 지역에서는 동시 증가와 다른 지역의 감소, 크게 다른 패턴이 있습니다. 이전에 전체 세포에서 보고 된 것에서21. 이것은 다른 세포 구획에 걸쳐 UPS 활동의 변화의 기여를 해리 할 수 없기 때문에 전체 세포 접근법의 한계와 일치합니다. 최근 연구는 학습에 대한 응답으로 시냅스에서 특히 UPS를 연구하기 위해 시냅스 분획 프로토콜을 채택했지만22,23,24,사용되는 방법은 측정 할 수있는 능력을 폐색 같은 동물에 핵 및 세포질 유비퀴틴 - 프로 테아좀 변화. 이로 인해 불필요한 실험을 여러 번 반복하여 각각다른 세포내 분획을 수집해야 합니다. 이것은 동물의 생명을 더 큰 손실귀착할 뿐 아니라, 주어진 사건에 응하여 다른 세포 외 구획에 걸쳐 UPS 활동을 직접 비교하는 기능을 제거하거나 특정 질병 상태 도중. 유비퀴틴과 프로테아좀의 단백질 표적이 세포 전체에 걸쳐 광범위하게 다르다는 점을 고려할 때, 유비퀴틴-프로테아좀 신호가 뚜렷한 세포외 구획에서 어떻게 다른지 이해하는 것은 UPS의 기능적 역할을 식별하는 데 매우 중요합니다. 기억 형성 및 신경 학 동안 뇌, 신경 퇴행 성 및 정신 장애.
이러한 필요성을 해결하기 위해, 우리는 최근에 핵, 세포질 및 시냅스 분획이 동일한 동물21에서주어진 뇌 영역에 대해 수집 될 수있는 절차를 개발했습니다. 또한 동일한 샘플에서 여러 세포 외 분획을 수집하여 얻을 수 있는 제한된 양의 단백질을 고려하여 이전에 확립된 프로토콜을 최적화하여 시험관내 프로테아좀 활성 및 연계 성 활성을 분석했습니다. 설치류 뇌 조직에서 수집 된 lysed 세포에서 단백질 유비퀴틴. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 쥐의 측측 편도체에서 핵과 세포질및 시냅스에서 proteasome 활성, K48, K63, M1 및 전반적인 단백질 폴리유비퀴틴화 수준에서 학습 의존적 변화를 수집하고 직접 비교할 수 있었습니다. 여기에서는 UPS가 장기 기억 형성 및 다양한 질병 상태에 어떻게 관여하는지에 대한 이해를 크게 향상시킬 수 있는 절차(그림 1)를 자세히 설명합니다. 그러나, 당사의 프로토콜에서 논의된 시험관 내 프로테아솜 활성은 널리 사용되고 있지만, 완전한 26S 프로테아솜 복합체의 활성을 직접적으로 측정하지 않는다는 점에 유의해야 한다. 오히려, 이 분석은 20S 코어의 활성을 측정하며, 이는 전체 26S 프로테아솜 컴플렉스와 는 반대로 코어 자체의 활동을 이해하는 프록시역할을 할 수 밖에 없다는 것을 의미합니다.
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Protocol
동물 과목을 포함한 모든 절차는 버지니아 폴리 테크닉 대학과 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 설치류 뇌 조직의 수집 및 해부
참고: 이 프로토콜은 다양한 뇌 영역에 적용될 수 있으며 다양한 조직 수집 절차와 함께 사용될 수 있습니다. 아래는 쥐 뇌 조직의 아세포에 대 한 우리의 실험실에서 사용 하는 절차, 사용 하 여 8-9 주 오래 된 남성 Sprague Dawley 쥐. 동일한 동물의 모든 세포 구획을 처리하기 위해, 섹션 1.3. 사용된 조직 수집 절차에 관계없이 따라야 합니다.
- 쥐 의 뇌를 추출하고 드라이 아이스에 미리 차가운 극저온 컵에 배치합니다. 드라이 아이스에서 뇌를 플래시 동결하거나 가능한 경우 액체 질소를 사용하고 -80 °C 냉동고로 옮김을 사용하십시오. 뇌는 같은 날 또는 나중에 해부 될 수 있습니다.
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극저온 컵에서 얼어 붙은 뇌를 제거하고 드라이 아이스로 차가운 쥐 뇌 매트릭스에 넣습니다. 행렬의 각 슬롯은 0.5mm에 해당하며, 관심 영역(ROI)의 대략적인 위치를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
- 쥐 브레인 아틀라스를 사용하여 ROI의 예상 시작 바로 앞(앞쪽)에 면도날을 매트릭스에 삽입합니다. 다음으로 ROI의 예측 끝(후방)에 면도날을 즉시 삽입합니다.
- 메스를 사용하여 면도날 사이의 슬라이스를 제거하고 드라이 아이스에 차가운 현미경 슬라이드에 놓습니다. 일반적으로 섹션두께는 2-3mm이지만 ROI에 따라 다릅니다.
- 메스를 사용하여 ROI를 한 번에 한 반구로 해부합니다. 각 반구를 드라이 아이스에 미리 냉각된 별도의 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 넣습니다. 냉동 조직은 -80°C에서 보관하는 경우 세포내 분획을 즉시 사용하거나 나중에 처리될 수 있다.
2. 핵 및 세포질 추출
참고: 이 프로토콜은 0.1 M HEPES, 1 M MgCl 2,1 M 디티오트레이톨 (DTT), 0.5 M 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA), 5 M NaCl, 10 % NP-40 (IGEPAL) 및 50 % 글리세롤을 포함한 일반적인 실험실 화학 물질의 미리 만들어진 재고 솔루션을 사용합니다. 종점이 프로테아좀 활성 아세에 사용되는 경우, 글리세롤과 ATP는 용해 동안 프로테아좀 복합체의 분해를 방지하기 위해 모든 버퍼에 추가 될 수있다.
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Lysis 버퍼를 준비합니다. 멸균 된 15 mL 원엽 튜브에 8.63 mL의 초순수 (탈이온화 및 증류) 물을 추가하십시오.
- 원유관에 0.1 M HEPES 1,000 μL, 1M MgCl 15 μL, 1M DTT의 100 μL 및 10% NP-40의 50 μL을 추가합니다.
- 프로테아제 억제제 칵테일 100 μL과 인산염 억제제 칵테일 100 μL을 넣습니다. 잠시 혼합하고 차가운 젖은 얼음에 배치하는 솔루션을 소용돌이. 상기 용액은 인산염 억제제로부터 황색 색조를 가질 수 있다.
참고: 프로테아제 억제제의 사용은 단백질을 보존하고 시험관 내 프로테아좀 활성 분석법의 특이성을 보장하기 위해 필수적이다. 그러나, 이들 억제제는 또한 프로테아좀 활성의 경미한 감소를 초래할 수 있으며, 이는 시험관내 분석에서 측정된 활성이 실제 활성 수준의 과소평가일 수 있음을 의미한다.
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추출 버퍼를 준비합니다. 멸균 된 15 mL 원엽 튜브에 5.925 mL의 초순수 (탈이온화 및 증류) 물을 추가하십시오.
- 원유관에 0.1 M HEPES 2,000 μL, 50% 글리세롤 1250 μL, 1 MMgCl 2, 1 M DTT의 5 μL, 0.5 M EDTA의 5 μL 및 5 M NaCl의 600 μL을 추가합니다.
- 프로테아제 억제제 칵테일 100 μL과 인산염 억제제 칵테일 100 μL을 넣습니다. 잠시 혼합하고 차가운 젖은 얼음에 배치하는 솔루션을 소용돌이. 상기 용액은 인산염 억제제로부터 황색 색조를 가질 수 있다.
- -80°C 냉동고에서 ROI의 1반구를 포함하는 1.5 mL 원심분리기 마이크로튜브를 제거한다. 사용되는 반구가 각 실험 그룹에 대한 추출 조건에서 균형을 이루는지 확인합니다. 예를 들어, 2그룹 실험에서 각 그룹의 처음 두 동물에 대해 왼쪽 반구를 사용하고 다음 두 개의 샘플에 대해 오른쪽 반구를 사용합니다.
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메스를 사용하여, 냉동 된 뇌 조직을 2 mL 유리 테플론 균질화로 옮김. 테프론 튜브에 500 μL의 Lysis 버퍼를 추가합니다.
- 유봉 B를 사용하여, 고체 물질의 눈에 보이는 양이 존재하지 않는 때까지 15 스트로크를 사용하여 동일한 조직을 균질화. 각 스트로크 중에 회전 모션(시계 방향 또는 시계 반대 방향)을 사용합니다.
- 1,000 μL 파이펫을 사용하여 균질화된 샘플을 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김. 튜브를 젖은 얼음 위에 놓고 30 분 동안 배양하십시오.
- 미세 원심분리기에 튜브를 놓고 845 x g 및 4 °C에서 10 분 동안 돌십시오. 완료 후, 조심스럽게 파이펫팅에 의해 상류를 제거하고 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 배치; 이것은 얼음 또는 섹션 2.9까지 4 °C에 저장할 수있는 세포질 분획입니다.
- 결과 펠릿에 추출 버퍼 50 μL을 추가하고 파이펫팅으로 다시 일시 중단합니다. 펠릿을 소용돌이하지 마십시오. 다시 매달린 펠릿을 함유한 튜브를 얼음 위에 놓고 30분 동안 배양한다.
- 튜브를 미세 원심분리기에 놓고 21,456 x g, 4 °C에서 20 분 동안 돌십시오. 완료 후, 조심스럽게 파이펫팅에 의해 상류를 제거하고 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 배치; 이것은 핵 분획입니다. 이제 펠릿을 버릴 수 있습니다.
- Dc 단백질 분석법(제조업체의 지침에 따라) 또는 비이온성 세제를 사용하여 수집된 샘플에 대한 동등한 분석법(이온성 분석법)을 사용하여 세포질 및 핵 추출의 단백질 농도를 측정합니다. 즉시 프로테아좀 활성 분석법(섹션 4) 또는 서양 블로팅(섹션 5)으로 진행합니다. 또는, 시료는 필요할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있다.
3. 시냅스 분수 수집
참고: 이 프로토콜은 1M Tris (pH 7.5), 0.5 M EDTA, 5 M NaCl 및 10 % SDS를 포함한 일반적인 실험실 화학 물질의 미리 만들어진 재고 솔루션을 사용합니다. 종점이 프로테아좀 활성 아세에 사용되는 경우, 글리세롤과 ATP는 용해 동안 프로테솜 복합체의 분해를 방지하기 위해 모든 버퍼에 추가 될 수있다
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320 mM 자당으로 TEVP 버퍼를 준비합니다. 깨끗한 100 mL 비커에 60 mL의 초순수 (탈이온화 및 증류) 물을 추가하십시오.
- 비커에 1,300 μL의 1M Tris (pH 7.5), 0.5 M EDTA의 260 μL, 프로테아제 억제제 칵테일 100 μL, 인산염 억제제 칵테일 100 μL 및 수크로오스 10.944 g을 추가합니다. 자당이 완전히 녹을 때까지 저어주면 됩니다.
- 피펫을 사용하여 용액에 염산(HCl)을 드롭와이즈로 첨가하여 pH를 ~7.4로 가져옵니다.
- 용액을 100mL 체적 플라스크로 옮김으로 옮니다. 초순수를 첨가하여 100 mL의 부피를 가져옵니다. 마지막 용액을 얼음에 식히고 필요할 때까지 식힙니다.
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균질화 버퍼를 준비합니다. 깨끗한 100 mL 비커에 60 mL의 초순수 (탈이온화 및 증류) 물을 추가하십시오.
- 비커에 1 M Tris (pH 7.5), 3,000 μL 의 5 M NaCl, 프로테아제 억제제 칵테일 100 μL, 인산염 억제제 칵테일 100 μL 및 10 % SDS의 2,000 μL을 추가하십시오. 볶음막대와 섞으세요.
참고: 이온성 세제는 프로테아좀 복합체의 변성으로 인해 프로테아좀 활성 검사를 방해할 수 있습니다. 원하는 경우 프로테아좀 기능을 보존하기 위해 SDS의 볼륨을 낮출 수 있습니다. - 파이펫을 사용하여 용액에 HCl 드롭와이즈를 추가하여 pH를 ~7.4로 가져옵니다.
- 용액을 100mL 체적 플라스크로 옮김으로 옮니다. 초순수를 첨가하여 부피를 100mL로 가져옵니다. 최종 용액을 실온에 저장; SDS가 솔루션에서 침전되기 때문에 냉각되지 마십시오.
- 비커에 1 M Tris (pH 7.5), 3,000 μL 의 5 M NaCl, 프로테아제 억제제 칵테일 100 μL, 인산염 억제제 칵테일 100 μL 및 10 % SDS의 2,000 μL을 추가하십시오. 볶음막대와 섞으세요.
- -80°C 냉동고에서 ROI의 1반구를 포함하는 1.5 mL 원심분리기를 제거한다. 사용되는 반구가 각 실험 그룹에 대한 추출 조건에서 균형을 이루는지 확인합니다. 예를 들어, 2그룹 실험에서 각 그룹의 처음 두 동물에 대해 왼쪽 반구를 사용하고 다음 두 개의 샘플에 대해 오른쪽 반구를 사용합니다.
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메스를 사용하여, 냉동 된 뇌 조직을 2 mL 유리 테플론 균질화로 옮김. 테프론 튜브에 TEVP 버퍼 500 μL을 추가합니다.
- 유봉 B를 사용하여 고체 물질의 눈에 보이는 전달이 없을 때까지 15 스트로크를 사용하여 동일한 조직을 균질화하십시오. 각 스트로크 중에 회전 모션(시계 방향 또는 시계 반대 방향)을 사용합니다.
- 1,000 μL 파이펫을 사용하여 균질화된 샘플을 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김. 10 분, 4 °C에 대한 1,000 x g에서 샘플을 원심 분리.
- 상급체를 수집하고 1,000 μL 파이펫을 사용하여 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브로 옮김을 옮김. 10,000 x g에서 10 분, 4 °C의 샘플을 원심 분리합니다. 원래 펠릿 (P1)은 핵과 큰 파편을 포함하고 폐기 될 수있다.
- 상급체를 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김. 이것은 세포 분열분수입니다. 펠릿(P2)에 50 μL의 균질화 버퍼를 추가하고 고체 물질이 보이지 않을 때까지 파이펫팅하여 다시 중단합니다.
- 샘플을 20,000 x g에서 10 분, 4 °C로 원심 분리합니다. 상복부를 새로운 1.5 mL 마이크로원지 튜브로 옮기고; 이것은 조시 냅 토 소 말 막 (시 냅 틱) 분획. 펠릿은 폐기할 수 있습니다.
- Dc 단백질 분석법(제조업체의 지침에 따라) 또는 이온 성 세제를 사용하여 수집된 샘플에 대한 동등한 분석법(이온 성 분획)을 사용하여 시냅스 분획의 단백질 농도를 측정합니다. 즉시 프로테아좀 활성 분석법(섹션 4) 또는 서양 블로팅(섹션 5)으로 진행합니다. 또는, 시료는 필요할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있다.
4. 프로테아솜 활동 분석
참고: 프로테아솜 활성은 20S 프로테아솜 액티비티 키트의 약간 변형된 버전을 사용하여 균질화된 뇌 조직에서 측정될 수 있다. 이 분석은 완전한 26S 프로테아솜 복합체의 활성을 직접 측정하지 않는다. 오히려, 20S 코어의 활동을 측정, 그것은 단지 전체 26S proteasome 단지 반대로 코어 자체의 활동을 이해하는 프록시 역할을 할 수 있습니다 의미. 이 분석의 성공은 반복된 동결 해동 주기 및/또는 세제 의 증가 수준, 특히 이온성으로 감소하며, 360/460(여기/방출) 필터 설정 및 최대 37°C의 가열 기능을 갖춘 플레이트 리더기를 사용해야 합니다.
- 플레이트 리더 설정: 37°C로 미리 따뜻하게 하고 실행을 통해 유지합니다.
- 여기를 360으로 설정하고 방출을 460으로 설정합니다. 사용된 96웰 플레이트가 선명한 경우 광학 위치를 바닥으로 설정합니다. 다크/블랙 96 웰 플레이트를 사용하는 경우 광학 위치를 위로설정합니다.
- 형광 읽기 옵션에서 이전 플레이트 판독기 모델을 자동 게인으로 설정합니다. 최신 모델은 이를 위해 미리 설정되어 있습니다. 30분마다 2시간 동안 스캐닝(독서)하여 운동 실행을 프로그래밍합니다.
- 키트에 제공된 10x 분석 버퍼를 13.5 mL의 초순수로 재구성합니다. 100 mM ATP의 14 μL을 지금 1x 버퍼에 추가하십시오. 이것은 견본에 있는 proteasome 활동을 현저하게 향상하고 분석 결과 신뢰성을 향상시킵니다. 최종 20S 분석 버퍼는 필요할 때까지 얼음 또는 4 °C에 보관할 수 있으며 몇 개월 동안 안정적입니다.
- 키트에 제공된 AMC 표준을 100 μL의 DMSO로 재구성합니다. 표준이 빛에 민감하므로 어두운 환경에서 또는 저조도 조건에서 이 단계를 수행합니다.
- 어두운 환경에서 또는 저조도 조건에서 재구성된 표준을 사용하여 AMC의 스탠드 커브를 작성합니다.
- 별도의 0.5 mL 미세원원지 튜브에서 16, 8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 및 0 μL을 추가하여 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0.5 및 0 μM AMC 농도에 해당합니다.
- 이러한 튜브에 동일한 순서로 84, 92, 93.6, 96.8, 98.4, 99.2, 99.6 및 20S 분석 버퍼의 100 μL을 추가합니다. 이것은 균질화된 샘플에서 플레이트 판독기 보정 및 프로테아좀 활성의 분석에 사용될 일련의 높은 AMC 농도를 생성합니다.
- 희석된 모든 표준을 얼음에 보관하여 필요할 때까지 보관하십시오.
- 키트에 제공된 프로테아좀 기질(Suc-LLVY-AMC)을 65 μL의 DMSO로 재구성한다. 기판이 빛에 민감하기 때문에 어두운 또는 저조도 조건에서이 단계를 수행합니다. 20S 분석 버퍼를 사용하여 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 프로테아좀 기판의 1:20 희석을 생성합니다. 희석된 기판을 얼음에 보관하여 필요할 때까지 보관하십시오.
참고: 예를 들어, 플레이트에 10개의 샘플과 1개의 공백이 있는 경우, 웰당 10 μL에서 22개의 웰(중복)에 대해 충분한 희석기판이 필요합니다. 이는 파이펫팅 오류에 대해 220 μL + 30 μL이 필요하며, 기판12.5 μL과 20S 분석 버퍼의 237.5 μL이 필요합니다. - 원하는 시료를 해동(냉동된 경우)하고 정규화된 양을 96웰 플레이트에 첨가합니다. 중복으로 각 샘플을 실행합니다. 필요한 견본의 양은 조직 준비에 따라 변화합니다. 일반적으로 10-20 μg는 모든 세포내 분획에 충분합니다.
- 초순수로 샘플을 80 μL로 잘 채량합니다. 추가된 양은 추가된 샘플의 부피에 따라 다릅니다. 예를 들어, 샘플 1이 단백질의 4.5 μL이고 샘플 2가 8.7 μL인 경우, 필요한 물의 양은 각각 75.5 μL 및 71.3 μL이 될 것이다. 두 개의 별도 우물에서 80 μL의 물을 단독으로 추가하십시오. 이들은 분석 공백이 될 것입니다.
참고: 파이펫팅 오류로 인한 단백질 부피의 변화를 제한하기 위해 단백질 농도는 가장 적은 농축 시료로 정규화될 수 있습니다. 이렇게 하면 모든 조건에서 동일한 샘플 볼륨을 사용할 수 있습니다. - 분석 공백을 포함하여 각 우물에 20S 분석 버퍼의 10 μL을 추가합니다. 유정 전반에 걸쳐 일관된 분석 부피를 보장하기 위해 리피터/자동 파이펫을 권장합니다.
- 선택 사항: 이 단계에서, 원하는 경우 시험관 내 조작을 소개; 이를 위해서는 각 샘플에 차량을 포함한 치료당 2개의 웰이 추가로 필요합니다. 그렇다면, 5-10 μL의 약물/화합물을 샘플 웰 2개에 추가하고 다른 2개의 웰에 동등한 양의 제어/차량을 추가하십시오. 플레이트를 예온 된 플레이트 리더에 놓거나 37 °C 인큐베이터에 30 분 동안 놓습니다.
- 조명을 끄거나 어두운 방에 들어갑니다. 희석 된 AMC 표준 의 모든 100 μL을 새로운 우물에 추가하십시오. 각 표준은 하나의 우물을 해야합니다.
- 어둠 속에서, 샘플과 분석 공백을 포함하는 우물에 희석 된 프로 테아좀 기판 10 μL을 추가하지만 AMC 표준에는 넣지 않습니다. 유정 전반에 걸쳐 일관된 분석 부피를 보장하기 위해 리피터/자동 파이펫을 권장합니다.
- 플레이트를 플레이트 판독기에 넣고 운동 실행을 시작합니다.
참고: 플레이트는 운동 실행 중에 일정한 교반하에 있을 필요가 없지만 원하는 경우 사용자가 선택할 수 있습니다. - 운동 실행이 끝나면 원시 형광 값 360/460을 Microsoft Excel로 내보냅니다.
- 각 표준, 각 샘플 및 5개 스캔 모두에 대해 분석 공백에 대해 함께 중복 된 우물을 평균화합니다. 원시 형광 값은 샘플에 대한 스캔을 통해 증가해야하지만 표준 및 분석 공백에 대한 안정 (또는 약간 감소).
- 가장 높은 AMC 표준을 잘 평균하고 공지된 농도(20 μM)로 나눈다. 표준화된 AMC 값을 얻기 위해 분석에서 사용되는 샘플 농도로 이 값을 나눈다. 각 샘플 및 분석 빈 평균에 대해 표준화된 AMC 값으로 나눕니다.
- 이 최종 값을 취하여 분석에서 사용된 표본 농도로 나누어 각 샘플과 분석 빈에 대한 정규화된 값을 얻습니다. 모든 5 스캔에 대해이 작업을 수행합니다.
- 모든 5개의 검사에 대해 정규화된 각 샘플 값에서 정규화된 분석 빈 값을 뺍니다.
5. 링키지 특이적 단백질 유비퀴틴화의 정량화
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설치류 뇌 조직에서 수집 된 다른 세포 분열에서 다양한 폴리 유비 퀴틴 태그의 정량화는 독특한, 링크주 특이적 폴리 유비퀴틴 항체와 함께 다양한 표준 서양 블로팅 프로토콜을 사용하여 수행해야합니다.
- 변성의 경우, 정규화된 샘플을 β-메르카포에탄올로 보충한 동일한 부피의 Laemmli 샘플 버퍼와 혼합하여 제조업체의 지시에 따라 부피 5%의 백분율로 혼합합니다.
- 링키지에 관계없이 모든 단일 유큐퀴틴화 및 폴리유비퀴틴화 변형의 정량화를 위해 범유비퀴틴 항체를 사용하십시오.
- 모든 폴리비퀴틴화 단백질을 인식하려면 단큐퀴틴화와 교차 반응하지 않는 유비퀴틴 항체를 사용하십시오.
- 링키지 특이적 폴리유퀴틴화의 경우, 리신-27, 리신-48, 리신-63 및 선형(M1) 폴리유비퀴틴화를 검출할 수 있는 항체를 사용한다.
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거짓 양성을 초래하거나 다른 유비퀴틴 변형의 이미징을 방해할 수 있는 개발 간의 교차 오염을 방지하기 위해, 10 분 동안 0.1 M NaOH를 사용하여 개발 사이의 스트립 멤브레인.
- 10 분 동안 0.1 % 트위넨으로 TBS에서 멤브레인을 두 번 씻고 다시 차단하십시오 (사용되는 웨스턴 블롯 프로토콜에서 선호되는 차단제를 사용).
- 이차 항체와 멤브레인을 배양하고 멤브레인이 1 차 및 이차 항체를 제대로 벗겨졌는지 확인하기 위해 재개발합니다.
- 권장 사항: 오염없이 다른 유비퀴틴 항체의 성공적인 개발을 위해 형광 또는 근적외선 이미징 시스템을 사용하십시오. 이것은 수시로 항체 사이 이월을 방지할 수 있습니다.
-
일부 유비퀴틴 웨스턴 블롯 이미지는 뚜렷한 밴드(예: M1)의 열을 제공하는 반면, 다른 이미지는 명확한 선이 거의 없거나 전혀 없는 얼룩 모양의 패턴을 생성합니다(K48과 공통). 이미지 유비퀴틴 웨스턴 블롯의 정량화를 위해 전체 분자 표준 사다리를 확장하는 기둥 주위에 상자를 그립니다.
- 유비퀴틴 염색이 전체 사다리를 통과하는 경우 상자를 위(또는 아래로) 조정합니다. 이것은 Lysine-48 수정에 대 한 일반적 이며 세포 외 구획에 걸쳐 광범위 하 게 변화.
- 모든 면에서 열을 둘러싼 배경의 평균 광학 밀도로 계산되는 배경을 뺍니다.
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Representative Results
여기에 기재된 절차를 사용하여, 핵, 세포질 및 시냅스 분획을 쥐 뇌의 측측편도체로부터 수집하였다(도 1). 개별 분획의 순도는 서쪽 블로팅을 통해 확인되었고, 리세이트에서 농축되거나 고갈되어야 하는 단백질에 대한 항체를 조사했다. 조시냅스 분획이 수집된 제1 반구에서, 후층성 밀도 단백질 95(PSD95)는 세포질에서 더 낮은 수준으로 시냅스,분획이 아닌 시냅스에 존재하였다(도 2A). 이는 시냅스 분획 제제가 시냅스 전 및 후성 내피 성분둘다를 분리한다는 것을 입증하는 이전 작업과 일치한다(25). 반대로, 핵 단백질 히스톤 H3는 핵에 존재하였으나 시냅스, 분획, 세포질에서 더낮은 수준으로 존재하였다(도 2B). 세포질에서 PSD95 및 H3의 존재는 세포질 번역과 일치합니다. 세포질 단백질 β-tubulin는 우리의 세포질 분획에서 존재했습니다, 그러나 시냅스 지구에있는 더 낮은 수준으로 핵 용해물 (그림 2C)에서 크게 결석했습니다. 이것은 우리가 세포질 단백질의 주로 결석한 핵 분획을 생성할 수 있었다는 것을 건의합니다. 시 냅 스 지역에서 tubulin의 존재는 이전 연구와 일치26. 3개의 분획 모두 로딩 대조군으로 사용되었고, 단백질 β-액틴(도2D)을유지하는 하우징의 유사한 수준을 보였다. 집합적으로, 이러한 결과는 단일 랫트 측측 편도체로부터 수집된 핵, 세포질 및 시냅스 분획의 순도를 확인한다.
다음으로, 모든 용해액은 시험관내 20S 프로테아좀 활성 분석법의 기재된 변형 버전을 사용하여 기능성 프로테아좀 활성을 확인하였다. 모든 분석에서, 분석의 성공은 첫번째 스캔(0분)에서 다섯 번째/최종 스캔(120분)까지 검출된 원시 형광 단위(RFU)의 증가로 정의되었다. 이러한 모든 분석에서 10 μM AMC는 원시 형광 단위(RFU)의 정상화를 위한 가장 높은 표준으로 사용되었습니다. 조시 냅 스 분획에서, RFU 는스캔 5 (그림 3A)에서 정점에 도달하여 0.1 (그림3B)의정규화 된 RFU를 초래했습니다. 세포질 분획에서, RFU는 ~1.6의 최종 정규화 된 RFU와 스캔 (그림3C)에걸쳐 증가 (그림3D). 핵 분획은 또한 RFU(그림3E)에서시간 의존적 변화를 나타내었으며, 최종 정규화된 RFU는 0.3(그림 3F)이다. 구획에 걸쳐 proteasome 활동의 차이는 가능성이 분획에 proteasomes의 가용성을 반영, 이는 일반적으로 세포질과핵27에서가장 풍부하다, 우리의 활동의 가장 높은 수준을 가지고 구획 준비. 시 냅 스 지역에서 활동의 가장 낮은 수준 이온 성 세제를 사용 하 여 수집 된 유일한 용해 되 고 일치, 가혹한 변성 조건으로 인해 proteasome 활동을 줄일 수 있는. 중요한 것은, RFU는 분석 블랭크 또는 용해 (시냅스)에서 고도로 특이적이고 강력한 프로테아좀 억제제 클라스토-락타시스틴-β-락톤(그림3G,β-lac)으로 배양되어 최종 정규화된 RFU 수준을 표시하면서 시간이 지남에 따라 증가하지 않았다. 각각 0.01 및 0.001(그림3H). 이것은 RFU에 있는 관찰된 변경이 프로테아좀이 아닌 다른 프로테아제의 활성에 특히 기인했다는 것을 건의합니다. 더욱이, 실험 조건에 걸쳐 분석될 때, 세포질, 세포질, 후 측측 편도체에서의 프로테아좀 활성의 증가가 있었으며, 이는 시냅스 프로테아좀 활성의 감소와 동시에 발생하였다. 대조군 동물과비교한다(그림 4). 집합적으로, 이러한 결과는 프로테아좀 활성이 단일 랫측 편도체로부터 수집된 3개의 세포내 분획 모두에서 정확하게 측정될 수 있음을 확인한다.
프로테아좀 활성 분석의 장점 중 하나는 시험관 내 조작이 프로테아좀을 조절할 수 있는 특정 분자의 식별을 허용하는 프로테아좀 기질의 추가 직전에 샘플에 도입될 수 있다는 것입니다. 특정 세포 분수. 이것의 예로, CaMKII (칼슘/칼모둘린 의존성 단백질 키나아제 II)의 역할은 시냅스 분획에서 평가되었고, 가장 가혹한 변성 분해액이 수집되었기 때문에, CaMKII는 시냅스에서 프로테아좀 기능을 조절하는 것으로 생각되기 때문이다. CaMKII 억제제 myr-AIP (myristolayted autocamtide-2 관련 억제 펩티드)를 사용하여 30 분 배양을 하면 치료되지 않은 것의 ~ 61 %에 불과한 수준에 도달 한 분석에서 프로테아좀 활성이 현저히 감소했습니다. 컨트롤(그림5A)을참조하십시오. 반대로, 세포질에 적용된 동일한 조작은 비히클 처리웰로부터의 프로테아좀 활성의변화를 초래하지 않았다(도 5B). 이러한 결과는 프로테아좀 활성이 시험관 내에서 추가로 조작될 수 있고 이 조작이 수집된 세포분획에 따라 다른 효과를 가질 수 있음을 확인한다.
프로테아좀 활성을 정량화하는 것 외에도, 기재된 프로토콜은 서양 블롯 절차를 사용하여 다양한 유비퀴틴 변형에서 세포내 차이를 측정하는데 사용될 수 있다. 검출할 수 있는 유비퀴틴 태그는 현재 쥐를 위한 K48, K63 및 M1을 포함하는 링키지 특이적 항체의 가용성에 의해 제한된다는 것을 주의하는 것이 중요합니다 (참고: K27 항체는 유효합니다, 그러나 어떤에서 검출 가능한 심상을 생성하지 않았습니다 측면 편도체 분획 또는 전체 세포는 다양한 조건하에서 용해된다). 모든 세포 내 분획에서 전체 폴리유비퀴틴화, 분해 독립적 선형/M1 및 K63 유비퀴틴화 및 분해 특이적 K48 유비퀴틴화를 검출했습니다. 중요한 것은, 상이한 실험 조건에 걸쳐 분석할 때, 전체적으로 증가하였다(도6A),선형(도6B),K63 (도6C)및 K48(도6D)측측 편도체에서의 폴리이퀴틴화 제어 동물에 비해 학습 다음 핵 분획. 동시에, 세포질 지역에서, 전반적인 polyubiquitination 감소 및 K48 유비퀴틴은 학습 후 증가, 시냅스 K63 유비퀴틴화는 감소된 동안. 집합적으로, 이러한 결과는 동일한 동물 내 의 연관성 특이적 단백질 유비퀴틴화에서 의 한 세포내 차이가 정확하게 검출될 수 있음을 나타낸다.
그림 1 : 쥐 뇌 조직의 세포분열을 위한 회로도. 설치류 뇌가 추출되고 뇌 영역이 해부되고 반구가 분할됩니다. 일련의 버퍼 및 원심 분리 단계를 사용하여 핵 및 세포질 분획은 한 반구에서 수집되고 조잡한 시냅스 분획은 다른 반구에서 수집됩니다. 두 분획 은 다음 proteasome 활성 분석 및 서양 블로팅에 대 한 사용, 분석 단백질 polyubiquitination 수준. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 조질 시냅스, 핵 및 세포질 분획 순도 확인. (a) 시냅스 단백질 후층성 밀도 단백질 95(PSD95; 1:1,000)는 시냅스에 존재하였으나 세포질에서 더 낮은 수준으로 핵 분획은 존재하지 않았다. (B) 히스톤 H3 (1:500)는 핵에 존재했지만 시냅스는 아니지만, 세포질에서 낮은 발현을 가진 분율. (C) β-Tubulin (1:1,000)은 세포질에서 존재했지만, 핵에서 크게 결석하였으나, 시냅스 용해물에서 낮은 발현을 가진 분율. (D) 하우스키핑 단백질 β-액틴(1:1,000)을 모든 세포내 구획에 존재하였다. 영역은 표적 단백질의 예상 크기를 나타낸다. 이 수치는 Orsi, S.A. 외21에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 같은 동물의 측측 편도체로부터 채취한 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 프로테아좀 활성의 정량화. 시험관내 프로테아좀 활성 분석동안, 상대형광단위(RFU)는 시냅스(A), 세포질(C) 및 핵(E) 분획에서 분석의시작(스캔 1)에서 종말(Scan 5)까지 증가하였다. 기준선으로부터 이러한 변화의 정량화는 시냅스(B)에서 0.1의 정규화된 RFU 값(10 μM AMC에 상대), 세포질(D)에서 1.6 및 핵(F) 분획에서 0.3을 나타냈다. 프로테아좀 억제제 βlac은 세션(G-H)에서 RUS가 변화하는 것을 방지하였다. 이 수치는 Orsi, S.A. 외21에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 같은 동물의 측면 편도체에서 프로테아좀 활성의 세포 내 차이. 핵 proteasome 활동의 증가는 시냅스 분획 내의 활동의 감소에 대응하는 대조군을 기준으로 훈련된 (공포 조절된) 동물에서 검출되었습니다. 세포질 프로테아솜 활동은 기준선에 남아 있었습니다. *P < 제어에서 0.05. 이 수치는 Orsi, S.A. 외21에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 수집된 시냅스 및 세포질 분획에서 프로테아좀 활성의 시험관 내 조작. 억제제 AIP를 통한 CaMKII 신호의 시험관 내 조작은 시냅스(A)에서 프로테아좀 활성을 감소시키지만, 세포질(B), 랫트 측측 편도체로부터의 분획은 아니다. 이 수치는 제롬, T.J. 외23에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 같은 동물의 횡편도에서 의 연계특이적 단백질 유비퀴틴화의 세포내 차이. (a) 학습 후 핵 분획에서 전반적인 유비퀴틴이 증가하였고, 이는 세포질 분획의 감소와 상관관계가 있었다. (B) 핵에서 선형 유비퀴틴화의 증가가 있었지만, 세포질이나 시냅스는 아니지만, 배움을 따르는 분획이 있었다. (C) 학습 후 핵 분획에서 K63 유비퀴틴화의 증가가 있었으며, 이는 시냅스 분획의 감소와 상관관계가 있었다. (D) K48 유비퀴틴은 핵 및 세포질에서 증가했지만, 시냅스는 아니지만, 배움을 따르는 분율은 증가하였다. *P < 제어에서 0.05. 얻어진 모든 유비퀴틴 광학 밀도는 로딩 제어로서 사용되었던 β-액틴 수준(A에서 하부 대표적인 웨스턴 블롯 이미지)으로 정규화되었다. 이 수치는 Orsi, S.A. 외21에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서, 우리는 동일 동물에 있는 다른 세포 내 구획에 걸쳐 유비퀴틴-proteasome 활동의 변경을 정량화하는 효율적인 방법을 보여줍니다. 현재, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 활성에서 세포외 변화를 측정하는 대부분의 시도는 샘플당 단일 구획으로 제한되어 실험을 반복할 필요가 있다. 이것은 상당한 비용과 동물의 생명의 손실로 이어집니다. 우리의 프로토콜은 반구를 분할하여이 문제를 완화, 다른 세포 분획은 동일한 동물의 각 반구에서 수집 할 수 있도록. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 학습21에응하여 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 동일한 동물 유비퀴틴-프로테아좀 활성이 분별적으로 변화한다는 것을 처음으로 보여줄 수 있었다.
여기서 설명된 프로토콜의 주요 제한사항은 수득된 뇌 조직(샘플)의 양에 의존한다. 예를 들어, 위에서 설명한 대로 이 프로토콜은 주어진 뇌 영역의 반구를 분할해야 합니다. 그러나 한 반구에만 존재하는 특정 영역의 경우와 같이 항상 가능하지는 않을 수 있습니다. 이러한 경우, 프로토콜은 시냅스 분획 단계(Section 3.1)에 사용되는 TEVP 버퍼에서 전체 뇌 영역을 먼저 균질화함으로써 수정될 수 있으며, 이는 이러한 버퍼가 모든 변성 제제가 없기 때문이다. 그런 다음 샘플을 부피별로 두 개의 동일한 부분으로 나눌 수 있습니다. 제1 부분은 설명된 바와 같이 프로토콜에 따라 시냅스 분획에 사용될 수 있다. 시료의 후반부에서, 비이온성 세제 NP-40은 0.05%의 최종 농도에 첨가될 수 있고, 이어서 섹션 2.6에 기재된 바와 같이 원심분리를 첨가할 수 있다. 이것은 세포질 단백질을 상류및 핵 단백질내로 분리하는 것을 허용할 것이고, 이는 섹션 2의 나머지 단계에 따라 더 격리될 수 있다. 조직 수량에 있는 또 다른 관심사는 몇몇 두뇌 지구가 전임 피질과 같은 크기에서 아주 작다는 것입니다. 그러나, 이러한 경우, 상기 프로토콜은 여전히 사용된 버퍼의 부피를 감소시킴으로써 사용될 수 있으며, 이는 수집된 뇌 영역의 크기에 기초하여 경험적으로 결정되어야 할 것이다. 따라서, 이 프로토콜은 더 적은 조직을 사용할 수 있는 더 어려운 뇌 영역으로 개정될 수 있다.
여기서 설명하는 프로토콜의 주요 장점 중 하나는 대부분의 시설에서 찾을 수 있는 일반적인 실험실 장비와 시약을 사용하므로 제한된 예산이나 제한된 리소스가 있는 경우에도 이 방법론을 수정할 수 있습니다. 또한, 우리는 유비퀴틴 -proteasome 신호에 있는 세포내 변화를 측정하는 방법으로 이 프로토콜을 설명하는 동안, 이 방법론은 또한 세포 국소화 및 기능을 이해하는 그밖 단백질 또는 세포 프로세스에 적용될 수 있습니다 중요합니다. 따라서, 이 프로토콜은 학습 및 기억 또는 상이한 질병 상태 동안 특정 단백질 또는 복합체의 세포내 기능을 이해하는 광범위한 응용을 가질 수 있었다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 농업 및 생명 과학 대학의 시작 기금에 의해 지원되었다 버지니아 공대에서 과학 대학. T.M.는 버지니아 공대의 조지 워싱턴 카버 프로그램에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Fisher | 15575020 | Various other vendors |
| 20S Proteasome Activity Kit | Millipore Sigma | APT280 | Other vendors carry different versions |
| ATP | Fisher | FERR1441 | Various other vendors |
| Beta-actin antibody | Cell signaling | 4967S | Various other vendors |
| Beta-tubulin antibody | Cell signaling | 2128T | Various other vendors |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | VATECHH1MT3 | Other vendors carry different versions |
| B-mercaptoethanol | Fisher | ICN19024280 | Various other vendors |
| Clasto lactacystin b-lactone | Millipore Sigma | L7035 | Various other vendors |
| Cryogenic cup | Fisher | 033377B | Various other vendors |
| DMSO | DMSO | D8418 | Varous other vendors |
| DTT | Millipore Sigma | D0632 | Various other vendors |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | Various other vendors |
| H3 antibody | Abcam | ab1791 | Various other vendors |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Various other vendors |
| Hydrochloric acid | Fisher | SA48 | Various other vendors |
| IGEPAL (NP-40) | Millipore Sigma | I3021 | Various other vendors |
| K48 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab140601 | Various other vendors |
| K63 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab179434 | Various other vendors |
| KCl | Millipore Sigma | P9541 | Various other vendors |
| KONTES tissue grinder | VWR | KT885300-0002 | Various other vendors |
| Laemmli sample buffer | Bio-rad | 161-0737 | Various other vendors |
| Linear Ubiquitin Antibody | Life Sensors | AB-0130-0100 | Only M1 antibody |
| MgCl | Millipore Sigma | 442611 | Various other vendors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 2231000213 | Various other manufacturers/models |
| myr-AIP | Enzo Life Sciences | BML-P212-0500 | Carried by Millipore-Sigma |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Various other vendors |
| Odyssey Fc Imaging System | LiCor | 2800-02 | Other vendors carry different versions |
| Phosphatase Inhibitor | Millipore Sigma | 524625 | Various other vendors |
| Precision Plus Protein Standard | Bio-rad | 161-0373 | Various other vendors |
| Protease Inhibitor | Millipore Sigma | P8340 | Various other vendors |
| PSD95 antibody | Cell signaling | 3450T | Various other vendors |
| SDS | Millipore Sigma | L3771 | Various other vendors |
| Sodium hydroxide | Fisher | SS255 | Various other vendors |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | Various other vendors |
| TBS | Alfa Aesar | J62938 | Varous other vendors |
| Tris | Millipore Sigma | T1503 | Various other vendors |
| Tween-20 | Fisher | BP337-100 | Various other vendors |
| Ubiquitin Antibody | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | Various other vendors |
References
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