Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kvantifisere Subcellulære Ubiquitin-proteasomet aktivitet i gnager hjernen

Published: May 21, 2019 doi: 10.3791/59695
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Denne protokollen er utformet for å effektivt kvantifisere ubiquitin-proteasomet system (UPS) aktivitet i ulike cellulære rom i den gnager hjernen. Brukernes er kjøpedyktig eksamen UPS fungerer inne atomer, cytoplasmatiske og Synaptic brøk inne det likt dyr, slankende beløpet av tid og antallet av dyrene behøvde å utføre disse innviklet analyser.

Abstract

Ubiquitin-proteasomet systemet er en sentral regulator av protein degradering og en rekke andre cellulære prosesser i Landplantenes. I hjernen, økninger i ubiquitin-proteasomet aktivitet er avgjørende for Synaptic plastisitet og minne formasjon og avvikende endringer i dette systemet er forbundet med en rekke nevrologiske, nevrodegenerative og psykiatriske lidelser. Et av problemene i å studere ubiquitin-proteasomet funksjon i hjernen er at det er til stede i alle cellulære rom, der proteinet mål, funksjonell rolle og mekanismer for regulering kan variere mye. Som et resultat, evnen til å direkte sammenligne hjernen ubiquitin protein målretting og proteasomet katalysator i ulike subcellulære rom innenfor samme dyr er avgjørende for fullt ut å forstå hvordan UPS bidrar til Synaptic plastisitet, hukommelse og sykdom. Metoden beskrevet her tillater innsamling av kjernefysiske, cytoplasmatiske og råolje Synaptic fraksjoner fra samme gnager (rotte) hjernen, etterfulgt av samtidige kvantifisering av proteasomet katalysator (indirekte, gi aktivitet av proteasomet kjerne ) og koblings spesifikk ubiquitin protein tagging. Således, metoden kan brukes å direkte sammenligne subcellulære endre inne ubiquitin-proteasomet aktivitet inne annerledes hjerneområder inne det likt dyr i løpet av Synaptic plastisitet, hukommelse formasjon og annerledes sykdommen fastslår. Denne metoden kan også brukes til å vurdere subcellulære fordeling og funksjon av andre proteiner innenfor samme dyr.

Introduction

Ubiquitin-proteasomet system (UPS) er et komplekst nettverk av sammenkoblede proteinstrukturer og ligases som kontrollerer nedbrytning av de fleste kortvarige proteiner i celle1. I dette systemet, proteiner er merket for degradering eller andre cellulære prosesser/skjebne av den lille endrings ubiquitin. Et mål protein kan tilegne seg 1-7 ubiquitin modifikasjoner, som kan koble sammen på en av syv lysin (K) nettsteder (K6, K11, K27, K29, K33, K48 og K63) eller N-Terminal metionin (M1; så kjent som lineær) i forrige ubiquitin2. Noen av disse polyubiquitin kodene er degradering-spesifikke (K48)3, mens andre er i stor grad uavhengig av protein fornedrelse prosessen (M1)4,5,6. Således, proteinet ubiqitinering forarbeide er utrolig innviklet og evnen å kvantifisere endre inne en spesifikk polyubiquitin tag er betenkelig for til slutt forståelse rollen av det gitt modifisering inne Cellular fungerer. Ytterligere kompliserer studiet av dette systemet, proteasomet, som er katalysatoren strukturen i ups7, både forringer proteiner, men kan også være involvert i andre ikke-proteolytiske prosesser8,9. Ikke overraskende da, siden den første oppdagelsen, har normal og avvikende ubiquitin-proteasomet aktivitet vært innblandet i langsiktig minne formasjon og en rekke sykdomstilstander, inkludert mange nevrologiske, nevrodegenerative og psykiatriske lidelser10,11. Som et resultat av dette er metoder som effektivt kan kvantifisere UPS-aktivitet i hjernen, avgjørende for til syvende og sist å forstå hvordan dette systemet dysregulated i sykdomstilstander og den endelige utviklingen av behandlingsalternativer rettet mot ubiquitin og/eller proteasomet fungerer.

Det er en rekke problemer i kvantifisere ubiquitin-proteasomet aktivitet i hjernevevet fra rotter og mus, som er de vanligste modell systemene som brukes til å studere UPS-funksjon, inkludert 1) mangfoldet av ubiquitin modifikasjoner, og 2) distribusjon og differensial regulering av UPS fungerer på tvers av subcellulære rom12,13,14. For eksempel brukte mange av de tidlige demonstrasjoner av ubiquitin-proteasomet funksjon i hjernen under minne formasjon hele celle lysater og indikerte tidsavhengige økninger i både protein ubiqitinering og proteasomet aktivitet15, 16 flere , 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20. men vi har nylig funnet at ubiquitin-proteasomet aktivitet varierte mye over subcellulære avdelinger som svar på læring, med samtidig økning i enkelte regioner og avtar i andre, et mønster som avviker betydelig fra det som tidligere ble rapportert i hele cellen lysater21. Dette er i overensstemmelse med begrensningen av en helt celle tilnærming, ettersom den ikke kan distansere bidraget av endringer i UPS-aktivitet på tvers av forskjellige subcellulære avdelinger. Selv om nyere studier har ansatt Synaptic brøk protokoller for å studere ups spesielt på synapser som svar på læring22,23,24, metodene som brukes tette evnen til å måle kjernefysiske og cytoplasmatiske ubiquitin-proteasomet endringer i samme dyr. Dette resulterer i et unødvendig behov for å gjenta eksperimenter flere ganger, samle en annen subcellulære brøkdel i hver. Dette resulterer ikke bare i et større tap av dyreliv, men det eliminerer muligheten til å sammenligne UPS-aktivitet direkte på tvers av ulike subcellulære avdelinger som svar på en gitt hendelse eller under en bestemt sykdomstilstand. Med tanke på at protein mål av ubiquitin og proteasomet varierer mye gjennom cellen, forstå hvordan ubiquitin-proteasomet signalering varierer i distinkte subcellulære rom er avgjørende for å identifisere den funksjonelle rollen til UPS i hjernen under minne formasjon og nevrologiske, nevrodegenerative og psykiatriske lidelser.

For å møte dette behovet, har vi nylig utviklet en prosedyre der kjernefysiske, cytoplasmatiske og Synaptic fraksjoner kan samles for en gitt hjerne regionen fra samme dyret21. I tillegg, for å gjøre rede for den begrensede mengden protein som kan fås fra å samle flere subcellulære fraksjoner fra samme prøve, optimaliserte vi tidligere etablerte protokoller for å analysen in vitro proteasomet aktivitet og koblings spesifikk protein ubiqitinering i lysert celler samlet inn fra gnager hjernevev. Ved hjelp av denne protokollen, kunne vi samle og direkte sammenligne læring-avhengige endringer i proteasomet aktivitet, K48, K63, M1 og generelle protein polyubiquitination nivåer i kjernen og cytoplasma og på synapser i lateral amygdala av rotter. Her beskriver vi i detalj vår prosedyre (figur 1), noe som kan forbedre vår forståelse av hvordan UPS er involvert i langsiktig minne formasjon og ulike sykdomstilstander. Imidlertid bør det bemerkes at in vitro proteasomet aktivitet diskutert i vår protokoll, mens mye brukt, ikke direkte måle aktiviteten til komplett 26S proteasomet komplekser. Rather, denne analysen måler aktiviteten i 20-årene kjernen, betyr det kan bare tjene som en proxy for å forstå aktiviteten til kjernen i seg selv i motsetning til hele 26S proteasomet kompleks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer inkludert dyr har blitt godkjent av Virginia Polytechnic Institute og State University institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).

1. innsamling og Disseksjon av gnagere Brain tissue

Merk: Denne protokollen kan brukes på en rekke av hjernen regioner og brukes med ulike vev samling prosedyrer. Neden er fremgangsmåten anvendt inne våre laboratorium for subcellulære av rotten hjerne tissue, benytter 8-9 uke gamle mannlig Sprague Dawley rotter. For å behandle alle cellulære rom i samme dyr, § 1,3. må følges uavhengig av vevs Innsamlingsprosedyren som brukes.

  1. Pakk rotte hjernen og plasser i en kryogene kopp pre-kjølt på tørr is. Flash-fryse hjernen på tørr is, eller bruke flytende nitrogen hvis tilgjengelig, og overføre til en-80 ° c fryser. Hjerner kan dissekert samme dag eller på et senere tidspunkt.
  2. Fjern den frosne hjernen fra kryogene koppen og legg den i en rotte hjerne matrise kjølt ned med tørr is. Hver slot på matrisen tilsvarer 0,5 mm, som kan brukes til å bestemme omtrentlig plassering av regionen av interesse (ROI).
    1. Bruke en Rat Brain Atlas, sette inn en barberhøvel blad inn i matrisen umiddelbart foran (fremre) av den anslåtte starten på AVKASTNINGEN. Deretter setter du inn et barberblad umiddelbart ved den anslåtte enden (bakre) av AVKASTNINGEN.
    2. Fjern stykket mellom barberbladene ved hjelp av en skalpell og plasser på et mikroskop lysbilde kjølt på tørr is. Vanligvis seksjoner er 2-3 mm tykk, men dette varierer basert på AVKASTNINGEN.
  3. Ved hjelp av en skalpell, analysere ut AVKASTNINGEN en halvkule av gangen. Plasser hver halvkule i separate 1,5 mL mikrosentrifugen rør pre-kjølt på tørr is. Frosset vev kan umiddelbart brukes til subcellulære fraksjonering eller behandles på et senere tidspunkt hvis det oppbevares ved-80 ° c.

2. kjernefysisk og cytoplasmatiske ekstraksjon

Merk: Denne protokollen bruker forhåndslagde lager løsninger av felles laboratoriekjemikalier, inkludert 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 m DITHIOTREITOL (DTT), 0,5 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), 5 M NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) og 50% glyserol. Hvis endepunktet brukes i proteasomet aktivitet analyser, glyserol og ATP kan legges til alle buffere for å hindre demontering av proteasomet komplekser under lyse.

  1. Klargjør lyseringsbufferen. Tilsett 8,63 mL ultrarent (deionisert og destillert) vann til et sterilt 15 mL konisk rør.
    1. Til konisk rør, tilsett 1 000 μL av 0,1 M HEPES, 15 μL av 1 M MgCl, 100 μL av 1 M DTT og 50 μL av 10% NP-40.
    2. Tilsett 100 μL av protease inhibitor cocktail og 100 μL av fosfatase inhibitor cocktail. Kort Vortex løsningen for å mikse og plassere på våt is til chill. Merk at løsningen kan ha en gul fargetone fra fosfatase inhibitor.
      Merk: Bruk av protease hemmere er viktig å bevare protein og sikre spesifisitet av in vitro proteasomet aktivitet analysen. Imidlertid kan disse hemmere også føre til en liten reduksjon i proteasomet aktivitet, noe som betyr at aktiviteten målt på in vitro-analysen kan være en undervurdere faktiske aktivitetsnivå.
  2. Klargjør Avsugs bufferen. Tilsett 5,925 mL ultrarent (deionisert og destillert) vann til et sterilt 15 mL konisk rør.
    1. Til konisk rør, tilsett 2 000 μL av 0,1 M HEPES, 1250 μL av 50% glyserol, 15 μL av 1 M MgCl2, 5 μL av 1 m DTT, 5 μl av 0,5 M EDTA og 600 μL av 5 M NaCl.
    2. Tilsett 100 μL av protease inhibitor cocktail og 100 μL av fosfatase inhibitor cocktail. Kort Vortex løsningen for å mikse og plassere på våt is til chill. Merk at løsningen kan ha en gul fargetone fra fosfatase inhibitor.
  3. Fjern 1,5 mL sentrifuge microtube som inneholder én halvkule av AVKASTNINGEN fra-80 ° c fryseren. Sørg for at halvkule brukes er balansert på tvers av utvinnings forhold for hver eksperimentell gruppe. For eksempel, i et to-gruppe eksperiment, Bruk venstre halvkule for de to første dyrene i hver gruppe og høyre halvkule for de neste to prøvene, etc.
  4. Ved hjelp av en skalpell, overføre den frosne hjernevevet til en 2 mL glass Teflon homogenisator. Tilsett 500 μL av lyseringsbuffer til Teflon-slangen.
    1. Bruke morter B, homogenisere samme vev ved hjelp av 15 slag til ingen synlige mengden av solid materiale er til stede. Bruk en dreiebevegelse (med eller mot klokken) under hvert strøk.
  5. Ved hjelp av en 1 000 μL Pipetter, overfører du homogenisert prøven til et nytt 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Plasser røret på vått is og ruge i 30 min.
  6. Plasser røret i mikrosentrifugen og spinn i 10 min ved 845 x g og 4 ° c. Etter ferdigstillelse, forsiktig fjerne supernatanten ved pipettering og plasser i en ny 1,5 mL mikrosentrifugen tube; Dette er cytoplasmatiske fraksjon, som kan oppbevares på is eller ved 4 ° c til § 2,9.
  7. Tilsett 50 μL av Avsugs buffer til den resulterende pellet og resuspend av pipettering. Ikke Vortex pellet. Plasser røret som inneholder resuspendert pellet på is og ruge i 30 min.
  8. Plasser røret i mikrosentrifugen og spinn i 20 min ved 21 456 x g, 4 ° c. Etter ferdigstillelse, forsiktig fjerne supernatanten ved pipettering og plasser i en ny 1,5 mL mikrosentrifugen tube; Dette er Nuclear brøk. Pellet kan nå kastes.
  9. Mål protein konsentrasjonen av cytoplasmatiske og Nuclear utdrag bruker DC protein analysen (i henhold til produsentens instruksjoner), eller tilsvarende analysen for prøver samlet inn ved hjelp av ikke-ioniske vaskemidler. Fortsett umiddelbart til proteasomet aktivitets analyse (avsnitt 4) eller vestlig blotting (avsnitt 5). Alternativt kan prøvene oppbevares ved-80 ° c til det er nødvendig.

3. Synaptic brøk samling

Merk: Denne protokollen bruker forhåndslagde lager løsninger av vanlige laboratoriekjemikalier, inkludert 1 M Tris (pH 7,5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl og 10% SDS. Hvis endepunktet brukes i proteasomet aktivitet analyser, glyserol og ATP kan legges til alle buffere for å hindre demontering av proteasomet komplekser under lyse

  1. Klargjør TEVP-bufferen med 320 mM sukrose. Tilsett 60 mL ultrarent (deionisert og destillert) vann til et rent 100 mL beger.
    1. Til begeret, tilsett 1 300 μL av 1 M Tris (pH 7,5), 260 μL av 0,5 M EDTA, 100 μL av protease inhibitor cocktail, 100 μL av fosfatase inhibitor cocktail og 10,944 g av sukrose. Bland med en røre bar til sukrose er helt oppløst.
    2. Bring pH til ~ 7,4 ved å tilsette saltsyre (HCl) dråpevis til løsningen ved hjelp av en pipette.
    3. Overfør løsningen til en 100 mL volum kolbe. Bring volumet til 100 mL ved å tilsette ultrarent vann. Chill den endelige løsningen på isen til nødvendig.
  2. Klargjør homogenisering buffer. Tilsett 60 mL ultrarent (deionisert og destillert) vann til et rent 100 mL beger.
    1. Til begeret legger du til 5 000 μL av 1 M Tris (pH 7,5), 3 000 μL av 5 M NaCl, 100 μL av protease inhibitor cocktail, 100 μL av fosfatase inhibitor cocktail og 2 000 μL av 10% SDS. Bland med en røre bar.
      Merk: Ioniske vaskemidler kan forstyrre proteasomet aktivitets analyser ved å resultere i denaturering av det proteasomet komplekset. Volumet av SDS kan senkes for å bidra til å bevare proteasomet funksjon hvis ønskelig.
    2. Bring pH til ~ 7,4 ved å legge til HCl-dråpevis i løsningen ved hjelp av en pipette.
    3. Overfør løsningen til en 100 mL volum kolbe. Bring volumet til 100 mL ved å tilsette ultrarent vann. Oppbevar den endelige løsningen ved romtemperatur; ikke Chill som SDS vil utløse ut av løsningen.
  3. Fjern 1,5 mL sentrifuge inneholder en halvkule av AVKASTNINGEN fra-80 ° c fryser. Sørg for at halvkule brukes er balansert på tvers av utvinnings forhold for hver eksperimentell gruppe. For eksempel, i et to-gruppe eksperiment, Bruk venstre halvkule for de to første dyrene i hver gruppe og høyre halvkule for de neste to prøvene, etc.
  4. Ved hjelp av en skalpell, overføre den frosne hjernevevet til en 2 mL glass Teflon homogenisator. Tilsett 500 μL av TEVP buffer til Teflon røret.
    1. Bruke morter B, homogenisere samme vev ved hjelp av 15 slag til ingen synlige overføringer av solid materiale er til stede. Bruk en dreiebevegelse (med eller mot klokken) under hvert strøk.
  5. Ved hjelp av en 1 000 μL Pipetter, overfører du homogenisert prøven til et nytt 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Sentrifuger prøven ved 1 000 x g i 10 min, 4 ° c.
  6. Samle supernatanten og Overfør til et nytt 1,5 mL mikrosentrifugen rør med en 1 000 μL pipette. Sentrifuger prøven ved 10 000 x g i 10 min, 4 ° c. Den opprinnelige pellet (P1) inneholder kjerner og de store rusk og kan kastes.
  7. Overfør supernatanten til en ny 1,5 mL mikrosentrifugen slange. Dette er en cytosolic brøk. Tilsett 50 μL av homogenisering buffer til pellet (P2) og resuspend ved pipettering til ingen fast materiale er synlig.
  8. Sentrifuger prøven ved 20 000 x g i 10 min, 4 ° c. Overfør supernatanten til en ny 1,5 mL mikrosentrifugen slange; Dette er Crude Synaptosomal membran (Synaptic) brøk. Pellet kan kastes.
  9. Mål protein konsentrasjonen av Synaptic fraksjonen ved hjelp av DC protein analysen (i henhold til produsentens instruksjoner), eller tilsvarende analysen for prøver samlet inn ved hjelp av ioniske vaskemidler. Fortsett umiddelbart til proteasomet aktivitets analyse (avsnitt 4) eller vestlig blotting (avsnitt 5). Alternativt kan prøvene oppbevares ved-80 ° c til det er nødvendig.

4. proteasomet aktivitet analysen

Merk: Proteasomet aktivitet kan måles i homogenisert hjernevev ved hjelp av en litt modifisert versjon av 20 Proteasomet Activity Kit. Denne analysen ikke direkte måle aktiviteten av komplette 26S proteasomet komplekser. Rather, måler aktiviteten i 20-årene kjernen, betyr det kan bare tjene som en proxy for å forstå aktiviteten av kjernen i seg selv i motsetning til hele 26S proteasomet kompleks. Suksessen til denne analysen avtar med gjentatte fryse-tine sykluser og/eller økende nivåer av vaskemidler, spesielt ioniske, og krever bruk av en plate leser med et 360/460 (eksitasjon/utslipp) filter sett og oppvarming evner opp til 37 ° c.

  1. Innstillinger for plate leser: pre-varm til 37 ° c og hold gjennom løpeturen.
    1. Sett eksitasjon til 360 og utslipp til 460. Hvis den 96 brønn platen som brukes er klar, Still inn optikk posisjonen til bunnen. Hvis det brukes en mørk/svart 96 brønn plate, setter du optisk posisjon til toppen.
    2. Sett eldre plate leser modeller til Auto-Gain under fluorescerende Lesealternativer; nyere modeller er forhåndsinnstilt for dette. Program en kinetisk kjøre med en tid på 2 h, skanning (lesing) hver 30 min.
  2. Rekonstituer den 10x analysen buffer gitt i settet med 13,5 mL ultrarent vann. Tilsett 14 μL av 100 mM ATP til nå 1x buffer; Dette forbedrer proteasomet aktivitet i prøvene og forbedrer analysen pålitelighet. Den siste 20-analysen buffer kan lagres på is eller ved 4 ° c til nødvendig og er stabil i flere måneder.
  3. Rekonstituer AMC standard leveres i kit med 100 μL av DMSO. Utfør dette steget i mørket eller under dårlige lysforhold, da standarden er lysfølsom.
  4. Lag en stativ kurve av AMC ved hjelp av rekonstituert standard, i mørket eller under dårlige lysforhold.
    1. I separate 0,5 mL mikrosentrifugen rør, tilsett 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 og 0 μL av AMC-standarden, som tilsvarer 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 og 0 μM AMC konsentrasjon.
    2. Til disse rørene, i samme rekkefølge, tilsett 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 og 100 μL av 20-analysen buffer. Dette skaper en rekke høye til lave AMC konsentrasjoner, som vil bli brukt for plate leser kalibrering og analyse av proteasomet aktivitet i homogenisert prøvene.
    3. Oppbevar alle Fortynnede standarder på is i mørket til det trengs.
  5. Rekonstituer proteasomet substrat (suc-LLVY-AMC) i kit med 65 μL av DMSO. Utfør dette steget i mørket eller under svake lysforhold, som underlaget er lysfølsom. Lag en 1:20 fortynning av proteasomet substrat i en ny 1,5 mL mikrosentrifugen tube bruker 20 analysen buffer. Oppbevar fortynnet substrat på is i mørket til nødvendig.
    Merk: For eksempel, hvis platen vil ha 10 prøver og 1 blank, vil du trenge nok fortynnet substrat for 22 brønner (med duplikater) ved 10 μL per brønn. Dette tilsvarer 220 μL behov + 30 μL for pipettering feil, som krevde 12,5 μL av substrat og 237,5 μL av 20-analysen buffer.
  6. Tin ønsket prøver (hvis frosset) og legge til en normalisert beløpet til en 96 brønn plate. Kjør hvert eksemplar i duplikater. Mengden av prøven som trengs varierer basert på vevs forberedelser. Vanligvis er 10-20 μg tilstrekkelig for enhver subcellulære brøkdel.
  7. Ta prøve brønn volumet til 80 μL med ultrarent vann. Mengden som legges til, avhenger av volumet av prøven som er lagt til. For eksempel, hvis prøve 1 var 4,5 μL av protein og prøve 2 var 8,7 μL, vil mengden vann som trengs være henholdsvis 75,5 μL og 71,3 μL. I to separate brønner, tilsett bare 80 μL av vann; disse vil være analysen blanks.
    Merk: For å begrense endringer i protein volum på grunn av pipettering feil, kan protein konsentrasjoner bli normalisert til den minst konsentrerte prøven. Dette vil tillate bruk av samme prøvevolum under alle forhold.
  8. Tilsett 10 μL av 20-analysen buffer til hver brønn, inkludert analysen blanks. En repeater/automatisert pipette anbefales her for å sikre konsistent analyse volum på tvers av brønner.
  9. Valgfritt: På dette stadiet, innføre in vitro manipulasjoner hvis ønskelig; Dette vil kreve at hver prøve har ytterligere 2 brønner per behandling, inkludert kjøretøyet. Hvis det er tilfelle, tilsett 5-10 μL av legemiddel/sammensatte av interesse for 2 av prøve brønnene og et tilsvarende volum av kontroll/kjøretøy til ytterligere 2 brønner. Plasser platen på den forvarmet plate leseren eller i en 37 ° c inkubator i 30 minutter.
  10. Slå av lysene eller skriv inn et mørkt rom. Legg til alle 100 μL av utvannet AMC standarder til en ny brønn; hver standard vil ha en enkelt brønn.
  11. I mørket, tilsett 10 μL av fortynnet proteasomet substrat til brønner som inneholder prøve og analysen blanks, men ikke til AMC standard. En repeater/automatisert pipette anbefales her for å sikre konsistent analyse volum på tvers av brønner.
  12. Plasser platen i plate leseren og start kinetisk kjøring.
    Merk: Platen trenger ikke å være under konstant omrøring under kinetisk kjøre, men brukeren kan velge om ønskelig
  13. På slutten av kinetisk kjøre, eksportere rå 360/460 fluorescerende verdier til Microsoft Excel.
    1. Gjennomsnitt sammen dupliserte brønner for hver standard, hver prøve og analysen blank for alle 5 skanninger. RAW fluorescerende verdier bør øke på tvers av skanninger for prøvene, men forblir stabile (eller redusere litt) for standarder og analysen blanks.
    2. Ta høyeste AMC standard brønn gjennomsnitt og dividere med den kjente konsentrasjonen (20 μM). Dividere denne verdien av prøven konsentrasjon brukes i analysen for å få standardisert AMC verdi. For hver prøve og analysen blank gjennomsnitt, dividere med standardisert AMC verdi.
    3. Ta denne endelige verdien og dividere med prøven konsentrasjon brukes i analysen for å få normalisert verdi for hver prøve og analysen blank. Gjør dette for alle 5 skanninger.
    4. Trekke normalisert analysen tom verdi fra hver normalisert sample verdi for alle 5 skanninger.

5. kvantifisering av koblings spesifikk protein Ubiqitinering

  1. Kvantifisering av ulike polyubiquitin koder i forskjellige subcellulære fraksjoner samlet inn fra gnager hjernevev bør gjøres ved hjelp av en rekke standard vestlige blotting protokoller i kombinasjon med unike, forbindelses-spesifikke polyubiquitin antistoffer.
    1. For denaturering, bland normalisert prøvene med et likt volum av Laemmli sample buffer supplert med β-mercaptoethanol til en prosentandel av 5% av volum, per produsentens instruksjon.
    2. For kvantifisering av alle monoubiquitination og polyubiquitination modifikasjoner, uavhengig av sammenhengen, bruk et Pan-ubiquitin antistoff.
    3. For å gjenkjenne alle polyubiquitinated proteiner, bruk et ubiquitin antistoff som ikke reagerer med monoubiquitination.
    4. For koblings spesifikke polyubiquitination, bruk antistoffer som kan oppdage lysin-27, lysin-48, lysin-63 og lineær (M1) polyubiquitination.
  2. For å hindre krysskontaminering mellom utbygginger, noe som kan resultere i en falsk positiv eller forstyrre Imaging av en annen ubiquitin modifikasjon, stripe membraner mellom utbygginger ved hjelp 0,1 M NaOH i 10 min.
    1. Vask membraner i TBS med 0,1% mellom to ganger i 10 min og reblock (ved hjelp av hva blokkerende agent foretrekkes i Western Blot protokollen brukes).
    2. Ruge membranen med sekundær antistoff og sanere for å bekrefte at membranen ble strippet for primær og sekundær antistoffer riktig.
    3. Anbefalt: For vellykket utvikling av ulike ubiquitin antistoffer uten forurensning, bruk fluorescerende eller nær-infrarøde bilde systemer. Dette ofte kan hindre carryover mellom antistoffer.
  3. Noen ubiquitin Western Blot bilder vil gi kolonner av distinkte band (for eksempel M1), mens andre produserer en smøre-lignende mønster med få eller ingen klare linjer (felles med K48). For kvantifisering av avbildet ubiquitin vestlige blots, tegne en boks rundt kolonnen som utvider hele molekylære standarder stigen.
    1. Juster boksen opp (eller ned) hvis ubiquitin flekker ikke strekker seg gjennom hele stigen; Dette er vanlig for lysin-48 modifikasjoner og varierer mye over subcellulære rom.
    2. Trekk ut bakgrunnen, som er beregnet som gjennomsnittlig optisk tetthet av bakgrunnen umiddelbart rundt kolonnen på alle sider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av prosedyren som er beskrevet her, kjernefysiske, cytoplasmatiske og Synaptic fraksjoner ble samlet inn fra lateral amygdala av rotte hjernen (figur 1). Renhet av de enkelte fraksjoner ble bekreftet via vestlig blotting, undersøkelser med antistoffer mot proteiner som skal være beriket eller utarmet i lysat. I den første halvkule der en grov Synaptic brøkdel ble samlet inn, postsynaptic tetthet protein 95 (PSD95) var til stede i Synaptic, men ikke kjernefysiske, brøkdel, med lavere nivåer i cytoplasma (figur 2a). Dette er forenlig med tidligere arbeid som viser at Synaptic fraksjonen preparatet isolerer både presynaptiske nerve og postsynaptic komponenter25. Omvendt, det kjernefysiske proteinet histone H3 var til stede i kjernefysiske, men ikke Synaptic, brøkdel, med lavere nivåer i cytoplasma (figur 2b). Tilstedeværelsen av PSD95 og H3 i cytoplasma er forenlig med deres cytoplasmatiske oversettelse. Den cytoplasmatiske protein β-tubulin var til stede i vår cytoplasmatiske brøkdel, men var stort sett fraværende fra kjernefysiske lysat (figur 2C), med lavere nivåer i Synaptic regionen. Dette tyder på at vi var i stand til å produsere en kjernefysisk brøkdel som i stor grad var fraværende av cytoplasmatiske proteiner. Tilstedeværelsen av tubulin i Synaptic regionen er konsistent med tidligere studier26. Alle tre fraksjoner viste tilsvarende nivåer av boliger holde protein β-utgangen (figur 2D), som ble brukt som en lasting kontroll. Kollektivt disse resultatene bekrefter at renheten av kjernefysiske, cytoplasmatiske og Synaptic fraksjoner samlet inn fra en enkelt rotte lateral amygdala.

Deretter ble alle lysater bekreftet for funksjonell proteasomet aktivitet ved hjelp av den beskrevne modifiserte versjonen av in vitro 20 proteasomet aktivitet analysen. I alle lysater var suksessen til analysen definert som en økning i rå fluorescerende enheter (RFU) oppdaget fra den første skanningen (0 min) til den femte/siste skanningen (120 min). For alle disse analysene ble AMC 10 μM brukt som den høyeste standarden for normalisering av de rå fluorescerende enhetene (RFU). I råolje Synaptic brøkdel, RFU toppet på skanning 5 (figur 3a), noe som resulterer i en normalisert RFU på like under 0,1 (figur 3b). I den cytoplasmatiske fraksjonen økte RFU på tvers av skanninger (figur 3c) med en endelig normalisert RFU på ~ 1,6 (figur 3D). Den kjernefysiske fraksjonen viste også tidsavhengige endringer i RFU (figur 3e), med en endelig normalisert RFU på 0,3 (figur 3F). Forskjellene i proteasomet aktivitet på tvers av rom gjenspeiler trolig tilgjengeligheten av proteasomes i fraksjonen, som generelt er mest tallrike i cytoplasma og nucleus27, rom som har det høyeste nivået av aktivitet i vår Forberedelse. Det laveste nivået av aktivitet i Synaptic regionen er forenlig med det er den eneste lysat som ble samlet inn ved hjelp av ioniske vaskemidler, som kan redusere proteasomet aktivitet på grunn av strengere denaturering tilstand. Viktigere, RFU ikke øke over tid i analysen blanks eller i lysater (Synaptic) inkubert med svært spesifikke og potente proteasomet inhibitor clasto-lactacystin-β-laktonring (figur 3g, β-Lac), viser endelig normalisert RFU nivåer av 0,01 og 0,001, henholdsvis (figur 3t). Dette tyder på at den observerte endringen i RFU skyldtes spesielt aktiviteten til proteasomet og ikke andre proteaser. Videre, når analysert på tvers av eksperimentelle forhold, var det en økning i kjernefysiske, men ikke cytoplasmatiske, proteasomet aktivitet i lateral amygdala følgende læring, som skjedde samtidig med en nedgang i Synaptic proteasomet aktivitet i forhold til kontroll dyr (Figur 4). Kollektivt, disse resultatene bekrefter at proteasomet aktivitet kan være nøyaktig målt i alle tre subcellulære fraksjoner samlet inn fra en enkelt rotte lateral amygdala.

En av fordelene med proteasomet aktivitet analysen er at in vitro manipulasjoner kan innføres til prøvene umiddelbart før tilsetning av proteasomet substrat, som tillater identifisering av spesifikke molekyler som kan regulere proteasomet i den aktuelle subcellulære brøk. Som et eksempel på dette, ble rollen som CaMKII (kalsium/calmodulin avhengige protein kinase II) vurdert i Synaptic fraksjonen, de tøffeste denaturert lysat samlet inn, siden CaMKII antas å regulere proteasomet funksjon på synapser. En 30 min inkubasjons med CaMKII hemmer myr-AIP (myristolayted autocamtide-2 relatert hemmende peptid) resulterte i en betydelig redusert økning i proteasomet aktivitet på analysen, som bare nådde nivåer som var ~ 61% av ubehandlet kontrollene (figur 5a). Motsatt, gjorde den samme manipulasjon som anvendes på cytoplasmatiske ikke i en endring i proteasomet aktivitet fra kjøretøy behandlede brønner (figur 5B). Disse resultatene bekrefter at proteasomet aktivitet kan bli videre manipulert in vitro og at denne manipulasjon kan ha ulike effekter avhengig av subcellulære brøkdel samlet.

I tillegg til kvantifisere proteasomet aktivitet, kan den beskrevne protokollen brukes til å måle subcellulære forskjeller i ulike ubiquitin modifikasjoner ved hjelp av Western Blot prosedyrer. Det er viktig å merke seg at ubiquitin koder som kan oppdages er begrenset av tilgjengeligheten av koblings spesifikke antistoffer, som i dag inkluderer K48, K63 og M1 for rotter (Merk: et K27 antistoff er tilgjengelig, men ikke produsere en synlig bilde i noen lateral amygdala brøk eller hele celle lysater under en rekke forhold). Samlet polyubiquitination, degradering-uavhengig lineær/M1 og K63 ubiqitinering og degradering-spesifikke K48 ubiqitinering ble påvist i alle subcellulære fraksjoner. Viktigere, da analysert på tvers av ulike eksperimentelle forhold, var det en økning i total (figur 6a), lineær (figur 6b), K63 (figur 6C) og K48 (figur 6D) polyubiquitination i lateral amygdala kjernefysisk brøkdel etter læring i forhold til kontroll dyr. Samtidig, i den cytoplasmatiske regionen, sank total polyubiquitination og K48 ubiqitinering økte etter læring, mens Synaptic K63 ubiqitinering ble redusert. Kollektivt, disse resultatene tyder på at innenfor de samme dyret subcellulære forskjeller i koblings spesifikke protein ubiqitinering kan være nøyaktig oppdages.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk for subcellulære fraksjonering av rotten hjerne tissue. Gnagere hjernen er ekstrahert, hjernen regionen dissekert og halvkuler delt. Ved hjelp av en rekke buffere og sentrifugering trinn, er kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner samlet fra en halvkule, mens en grov Synaptic brøkdel er samlet inn fra den andre. Begge fraksjoner blir deretter brukt til proteasomet aktivitet analyser og vestlige blotting, til analysen protein polyubiquitination nivåer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Bekreftelse av råolje Synaptic, kjernefysiske og cytoplasmatiske brøk renhet. (A) Synaptic protein postsynaptic tetthet protein 95 (PSD95; 1:1000) var til stede i Synaptic, men ikke kjernefysisk brøkdel med lavere nivåer i cytoplasma. (B) histone H3 (1:500) var til stede i kjernefysiske, men ikke Synaptic, brøkdel med lavere uttrykk i cytoplasma. (C) β-Tubulin (1:1000) var til stede i cytoplasmatiske, men i stor grad fraværende fra det kjernefysiske, brøkdel med lavere uttrykk i Synaptic lysat. (D) housekeeping protein β-utgangen (1:1000) var til stede i alle subcellulære avdelinger. Områder indikerer forventet størrelse på mål proteinet. Dette tallet har blitt modifisert fra Orsi, S.A. et al.21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Kvantifisering av proteasomet aktivitet i kjernefysiske, cytoplasmatiske og Synaptic fraksjoner samlet inn fra lateral amygdala av samme dyr. Under in vitro proteasomet aktivitet analysen, oppdaget relative fluorescerende enheter (RFU) økt fra begynnelsen (Skann 1) til slutten (Scan 5) av analysen i Synaptic (A), cytoplasmatiske (C) og kjernefysiske (E) fraksjoner. Kvantifisering av denne endringen fra Baseline indikerte en normalisert RFU-verdi (i forhold til 10 μM AMC) av 0,1 i Synaptic (B), 1,6 i cytoplasmatiske (D) og 0,3 i kjernefysiske (F) fraksjoner. Den proteasomet hemmer βlac forhindret RFUs fra å endre på tvers av økten (G-H). Dette tallet er blitt modifisert fra Orsi, S.A. et al.21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Subcellulære forskjeller i proteasomet aktivitet i lateral amygdala av samme dyret. En økning i kjernefysisk proteasomet aktivitet ble påvist i trent (frykt conditioned) dyr i forhold til kontroller, som tilsvarte en nedgang i aktivitet innenfor Synaptic brøk. Cytoplasmatiske proteasomet aktivitet forble ved Baseline. *P < 0,05 fra kontroll. Dette tallet er blitt modifisert fra Orsi, S.A. et al.21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : In vitro manipulasjon av proteasomet aktivitet i samlet Synaptic og cytoplasmatiske fraksjoner. In vitro manipulasjon av CaMKII signalering via inhibitor AIP redusert proteasomet aktivitet i Synaptic (A), men ikke cytoplasmatiske (B), brøkdel av rotte lateral amygdala. Dette tallet har blitt modifisert fra Jarome, TJ et al.23. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Subcellulære forskjeller i koblings spesifikke protein ubiqitinering i lateral amygdala av samme dyr etter læring. (A) det var en økning i samlede ubiqitinering i den kjernefysiske fraksjonen følgende læring, som korrelert med en nedgang i cytoplasmatiske brøkdel. (B) det var en økning i lineære ubiqitinering i kjernefysiske, men ikke cytoplasmatiske eller Synaptic, brøkdel etter læring. (C) det var en økning i K63 ubiqitinering i kjernefysiske brøkdel følgende læring, som korrelert med en nedgang i Synaptic brøkdel. (D) K48 ubiqitinering økt i kjernefysiske og cytoplasmatiske, men ikke Synaptic, brøkdel etter læring. *P < 0,05 fra kontroll. Alle oppnådde ubiquitin optiske tettheten ble normalisert til β-utgangen nivåer (lavere representative Western Blot bilder i A), som ble brukt som en lasting kontroll. Dette tallet er blitt modifisert fra Orsi, S.A. et al.21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her demonstrerer vi en effektiv metode for kvantifisere endringer i ubiquitin-proteasomet aktivitet på tvers av forskjellige subcellulære rom i det samme dyret. For tiden har de fleste forsøk på å måle subcellulære endringer i aktiviteten til ubiquitin-proteasomet systemet vært begrenset til en enkelt kupé per prøve, noe som resulterer i behovet for å gjenta eksperimenter. Dette fører til betydelige kostnader og tap av dyreliv. Vår protokoll lindrer dette problemet ved å splitte halvkuler, slik at ulike mobilnettet fraksjoner skal samles inn fra hver halvkule av samme dyret. Ved hjelp av denne protokollen, var vi i stand til å vise for første gang at i samme dyr ubiquitin-proteasomet aktivitet differensielt endringer i kjernefysiske, cytoplasmatiske og Synaptic fraksjoner som svar på læring21.

Den viktigste begrensningen av protokollen som er beskrevet her er det er avhengig av mengden av hjernevevet (Sample) innhentet. For eksempel, som beskrevet ovenfor, krever denne protokollen splitting halvkuler av en gitt hjerne regionen. Imidlertid kan dette ikke alltid være mulig, for eksempel i tilfelle av visse områder som bare er til stede i en halvkule. I disse tilfellene kan protokollen endres ved først å homogenisere hele hjernens område i TEVP-bufferen som ble brukt i del 3,1 for Synaptic-Brøkdelen (avsnitt i kapittel), siden denne bufferen er fri for alle denaturering midler. Prøven kan deretter deles i to like deler etter volum. Den første delen kan brukes for Synaptic fraksjonen, etter protokollen som beskrevet. For den andre halvdelen av prøven kan ikke-ioniske vaskemiddel NP-40 legges til en endelig konsentrasjon på 0,05%, etterfulgt av sentrifugering som beskrevet i Seksjon 2,6. Dette vil tillate separasjon av cytoplasmatiske proteiner i supernatanten og kjernefysiske proteiner inn i pellet, som kan bli ytterligere isolert etter de resterende trinnene i § 2. En annen bekymring i vevs mengde er at noen hjerneregioner er svært små i størrelse, slik som prelimbic cortex. Men i disse tilfellene, kan protokollen ovenfor fortsatt brukes ved å redusere volumene av buffere som brukes, noe som må bestemmes empirisk basert på størrelsen på hjernen regionen samlet inn. Dermed kan denne protokollen endres til selv de vanskeligere hjerneområder der mindre vev er tilgjengelig.

En av de store fordelene med protokollen vi skisserer her er at den bruker felles laboratorieutstyr og reagenser som finnes i de fleste anlegg, slik at denne metodikken skal amendable til dem selv på et begrenset budsjett eller med begrensede ressurser. Videre, mens vi skissere denne protokollen som en måte å måle subcellulære endringer i ubiquitin-proteasomet signalering, kan denne metodikken også brukes til andre protein eller cellulær prosess der forstå mobilnettet lokalisering og funksjon er viktig. Dermed kan denne protokollen har brede programmer til å forstå subcellulære funksjoner av spesifikke proteiner eller komplekser under læring og hukommelse eller ulike sykdomstilstander.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av oppstart midler fra College of Agricultural and Life Sciences og College of Science ved Virginia Tech. T.M. støttes av George Washington Carver program ved Virginia Tech.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).

Tags

Nevrovitenskap ubiquitin proteasomet Nucleus synapse cytoplasma minne hippocampus amygdala
Kvantifisere Subcellulære Ubiquitin-proteasomet aktivitet i gnager hjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McFadden, T., Devulapalli, R. K.,… More

McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter