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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Quantificando a ubiquitina subcelular-atividade de proteasome no cérebro de roedores

Published: May 21, 2019 doi: 10.3791/59695
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Este protocolo é projetado para quantificar eficientemente a atividade do sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) em diferentes compartimentos celulares do cérebro de roedores. Os usuários podem examinar o funcionamento da UPS em frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas no mesmo animal, reduzindo a quantidade de tempo e o número de animais necessários para realizar essas análises complexas.

Abstract

O sistema do ubiquitin-proteasome é um regulador chave da degradação da proteína e de uma variedade de outros processos celulares nos eukaryotes. No cérebro, aumentos na atividade de ubiquitina-proteasome são críticos para a formação de plasticidade sináptica e memória e alterações aberrantes neste sistema estão associados a uma variedade de distúrbios neurológicos, neurodegenerativos e psiquiátricos. Um dos problemas no estudo do funcionamento do ubiquitina-proteasome no cérebro é que ele está presente em todos os compartimentos celulares, nos quais as metas proteicas, o papel funcional e os mecanismos de regulação podem variar muito. Como resultado, a capacidade de comparar diretamente a segmentação de proteínas de ubiquitina cerebral e a atividade catalítica de Proteassoma em diferentes compartimentos subcelulares dentro do mesmo animal é fundamental para compreender plenamente como a UPS contribui para a plasticidade sináptica, memória e doença. O método descrito aqui permite a coleta de frações sinápticas nucleares, citoplasmáticas e brutas do mesmo cérebro de roedores (Rat), seguidas pela quantificação simultânea da atividade catalítica do Proteassoma (indiretamente, proporcionando atividade do núcleo Proteassoma apenas) e marcação de proteínas de ubiquitina específica de ligação. Assim, o método pode ser usado para comparar diretamente as mudanças subcelulares na atividade do ubiquitin-proteasome em regiões diferentes do cérebro no mesmo animal durante a plasticidade sináptica, a formação da memória e Estados diferentes da doença. Este método também pode ser utilizado para avaliar a distribuição subcelular e a função de outras proteínas dentro do mesmo animal.

Introduction

O sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) é uma complexa rede de estruturas proteicas interconectadas e ligases que controla a degradação da maioria das proteínas de vida curta nas células1. Neste sistema, as proteínas são marcadas para a degradação ou outros processos/destinos celulares pelo pequeno modificador ubiquitina. Uma proteína alvo pode adquirir 1-7 modificações de ubiquitina, que podem se unir em um dos sete sítios de lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63) ou o N-terminal metionina (M1; conhecido como linear) na ubiquitina anterior2. Algumas dessas tags de poliubiquitina são específicas da degradação (K48)3, enquanto outras são em grande parte independentes do processo de degradação da proteína (M1)4,5,6. Assim, o processo de ubiquitinação de proteínas é incrivelmente complexo e a capacidade de quantificar as alterações em uma tag de poliubiquitina específica é fundamental para finalmente entender o papel dessa modificação dada no funcionamento celular. Complicando ainda mais o estudo deste sistema, o proteasome, que é a estrutura catalítica do UPS7, ambos degrada proteínas, mas também pode estar envolvido em outros processos não proteolíticos8,9. Não surprisingly então, desde que sua descoberta inicial, atividade normal e aberrante do ubiquitin-proteasome foi implicada na formação a longo prazo da memória e em uma variedade de Estados da doença, incluindo muitos neurológicos, neurodegenerativas e psiquiátricas distúrbios10,11. Como resultado, os métodos que podem efetivamente e eficientemente quantificar a atividade da UPS no cérebro são essenciais para finalmente compreender como este sistema é desregulado nos Estados de doença e o eventual desenvolvimento de opções de tratamento visando ubiquitina e/ou funcionamento do Proteassoma.

Há um número de edições em quantificar a atividade do ubiquitin-proteasome no tecido de cérebro dos ratos e dos ratos, que são os sistemas modelo os mais comuns usados para estudar a função do UPS, incluindo 1) a diversidade de modificações do ubiquitin, e 2) distribuição e regulação diferencial da UPS funcionando em compartimentos subcelulares12,13,14. Por exemplo, muitas das primeiras manifestações da função de ubiquitina-Proteassoma no cérebro durante a formação da memória usaram lisados de células inteiras e indicaram aumentos dependentes do tempo em ambas as proteínas ubiquitinação e Proteassoma atividade15, 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20. no entanto, descobrimos recentemente que a atividade ubiquitina-proteasome variou amplamente entre os compartimentos subcelulares em resposta à aprendizagem, com aumentos simultâneos em algumas regiões e diminui em outros, um padrão que difere significativamente do que foi relatado previamente em lysates inteiros da pilha21. Isso é consistente com a limitação de uma abordagem de célula inteira, pois não pode dissociar a contribuição de mudanças na atividade da UPS em diferentes compartimentos subcelulares. Embora estudos mais recentes tenham empregado protocolos de fração sináptica para estudar a UPS especificamente em sinapses em resposta à aprendizagem22,23,24, os métodos utilizados oclusam a capacidade de medir alterações de ubiquitina-proteasome nucleares e citoplasmáticas no mesmo animal. Isso resulta em uma necessidade desnecessária de repetir experimentos várias vezes, coletando uma fração subcelular diferente em cada um. Não só isso resulta em uma maior perda de vida animal, mas elimina a capacidade de comparar diretamente a atividade da UPS em diferentes compartimentos subcelulares em resposta a um determinado evento ou durante um estado de doença específica. Considerando que os alvos proteicos da ubiquitina e do Proteassoma variam amplamente em toda a célula, compreender como a sinalização de ubiquitina-Proteassoma difere em compartimentos subcelulares distintos é fundamental para identificar o papel funcional da UPS na cérebro durante a formação da memória e desordens neurológicas, neurodegenerativas e psiquiátricas.

Para abordar esta necessidade, nós desenvolvemos recentemente um procedimento em que as frações nucleares, cytoplasmic e sináptica poderiam ser coletadas para uma determinada região do cérebro do mesmo animal21. Adicionalmente, para dar conta da quantidade limitada de proteínas que podem ser obtidas a partir da coleta de múltiplas frações subcelulares da mesma amostra, otimizamos protocolos previamente estabelecidos para o ensaio de atividade Proteassoma in vitro e ligação específica ubiquitinação da proteína em pilhas lysed coletadas do tecido de cérebro do roedor. Utilizando este protocolo, pudemos coletar e comparar diretamente as mudanças dependentes da aprendizagem na atividade Proteassoma, K48, K63, M1 e níveis globais de poliubiquitinação protéica no núcleo e citoplasma e nas sinapses na amígdala lateral de ratos. Aqui, descrevemos detalhadamente nosso procedimento (Figura 1), o que pode melhorar significativamente nossa compreensão de como a UPS está envolvida na formação de memória de longo prazo e em vários Estados de doenças. Entretanto, deve-se notar que a atividade de Proteassoma in vitro discutida em nosso protocolo, embora amplamente utilizada, não mede diretamente a atividade de complexos completos de Proteassoma 26S. Em vez disso, este ensaio mede a atividade do núcleo 20s, o que significa que só pode servir como um proxy para entender a atividade do núcleo em si, em oposição ao complexo de todo o Proteassoma 26S.

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Protocol

Todos os procedimentos, incluindo os sujeitos animais, foram aprovados pelo Instituto Politécnico da Virgínia e pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Estadual (IACUC).

1. coleta e dissecção do tecido cerebral de roedores

Nota: Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de regiões do cérebro e usado com vários procedimentos da coleção do tecido. Abaixo está o procedimento utilizado em nosso laboratório para subcelular de tecido cerebral de rato, usando 8-9 semana de idade machos Sprague Dawley ratos. A fim de processar todos os compartimentos celulares no mesmo animal, seção 1,3. deve ser seguido independentemente do procedimento de coleta de tecido utilizado.

  1. Extraia o cérebro de rato e coloque em um copo criogênico pré-refrigerado em gelo seco. Flash-congelar o cérebro em gelo seco, ou usar nitrogênio líquido, se disponível, e transferir para um-80 ° c freezer. Cérebros podem ser dissecados no mesmo dia ou em um momento posterior.
  2. Retire o cérebro congelado do copo criogênico e coloque em uma matriz de cérebro de rato refrigerada com gelo seco. Cada slot na matriz corresponde a 0,5 mm, que pode ser usado para determinar a localização aproximada da região de interesse (ROI).
    1. Usando um Atlas de cérebro de rato, insira uma lâmina de barbear na matriz imediatamente na frente (anterior) do início previsto do ROI. Em seguida, insira uma lâmina de barbear imediatamente na extremidade prevista (posterior) do ROI.
    2. Retire a fatia entre as lâminas de barbear usando um bisturi e coloque em uma lâmina de microscópio refrigerada em gelo seco. Normalmente, as seções são 2-3 mm de espessura, mas isso varia de acordo com o ROI.
  3. Usando um bisturi, dissecar o ROI um hemisfério de cada vez. Coloque cada hemisfério em separado 1,5 mL microcentrífuga tubos pré-refrigerados em gelo seco. O tecido congelado pode imediatamente ser usado para o fraccionamento subcellular ou processado em uma estadia mais atrasada se armazenado em-80 ° c.

2. extração nuclear e citoplasmática

Nota: Este protocolo utiliza soluções de estoque pré-fabricados de produtos químicos de laboratório comuns, incluindo 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 m Dithiothreitol (DTT), 0,5 M de ácido ETILENODIAMINOTETRACÉTICO (EDTA), 5 M NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) e 50% glicerol. Se o valor-limite é usado em ensaios da atividade do Proteassoma, o glicerol e o ATP podem ser adicionados a todos os bufferes para ajudar a impedir a desmontagem de complexos do Proteassoma durante o lysis.

  1. Prepare o tampão de Lise. Adicionar 8,63 mL de água ultrapura (desionizada e destilada) a um tubo cônico estéril de 15 mL.
    1. Para o tubo cônico, adicionar 1.000 μL de 0,1 M HEPES, 15 μL de 1 M MgCl, 100 μL de 1 M DTT e 50 μL de 10% NP-40.
    2. Adicionar 100 μL de cocktail inibidor da protease e 100 μL de cocktail inibidor da fosfatase. Momentaneamente Vortex a solução para misturar e coloc no gelo molhado para refrigerar. Note que a solução pode ter uma tonalidade amarela do inibidor da fosfatase.
      Nota: O uso de inibidores da protease é essencial para preservar a proteína e garantir a especificidade do ensaio de atividade de Proteassoma in vitro. No entanto, esses inibidores também podem resultar em uma ligeira redução na atividade Proteassoma, o que significa que a atividade medida no ensaio in vitro pode ser uma subestimar os níveis de atividade real.
  2. Prepare o buffer de extração. Adicionar 5,925 mL de água ultrapura (desionizada e destilada) a um tubo cônico estéril de 15 mL.
    1. Para o tubo cônico, adicionar 2.000 μL de 0,1 M HEPES, 1250 μL de glicerol de 50%, 15 μL de 1 M MgCl2,5μL de 1 m DTT, 5 μl de 0,5 m de EDTA e 600 μl de NaCl de 5 m.
    2. Adicionar 100 μL de cocktail inibidor da protease e 100 μL de cocktail inibidor da fosfatase. Momentaneamente Vortex a solução para misturar e coloc no gelo molhado para refrigerar. Note que a solução pode ter uma tonalidade amarela do inibidor da fosfatase.
  3. Retire o microtubo de centrifugação de 1,5 mL contendo um hemisfério do ROI do congelador-80 ° c. Assegure-se de que o hemisfério usado seja contrabalançado entre as condições de extração para cada grupo experimental. Por exemplo, em um experimento de dois grupos, use o hemisfério esquerdo para os dois primeiros animais em cada grupo e o hemisfério direito para as próximas duas amostras, etc.
  4. Usando um bisturi, transfira o tecido cerebral congelado para um homogeneizador de Teflon de vidro de 2 mL. Adicionar 500 μL de tampão de Lise ao tubo de Teflon.
    1. Usando o pilão B, Homogeneize o mesmo tecido usando 15 cursos até que nenhuma quantidade visível de material contínuo esteja atual. Use um movimento de giro (no sentido horário ou anti-horário) durante cada curso.
  5. Utilizando uma pipeta de 1.000 μL, transfira a amostra homogeneizada para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Coloque o tubo no gelo molhado e incubar por 30 min.
  6. Coloque o tubo em microcentrífuga e gire por 10 min a 845 x g e 4 ° c. Após a conclusão, Retire cuidadosamente o sobrenadante introduzindo pipetagem e coloque-o num novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL; Esta é a fração citoplasmática, que pode ser armazenada no gelo ou a 4 ° c até a seção 2,9.
  7. Adicionar 50 μL de tampão de extração ao pellet resultante e ressuscitar por pipetagem. Não vórtice o pellet. Coloque o tubo que contém o pellet resinado no gelo e incubar durante 30 min.
  8. Coloque o tubo em microcentrífuga e gire por 20 min a 21.456 x g, 4 ° c. Após a conclusão, Retire cuidadosamente o sobrenadante introduzindo pipetagem e coloque-o num novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL; Esta é a fração nuclear. O pellet agora pode ser Descartado.
  9. Medir a concentração proteica das extrações citoplasmáticas e nucleares usando o ensaio de proteína DC (de acordo com as instruções do fabricante), ou qualquer ensaio equivalente para amostras coletadas usando detergentes não-iônicos. Proceder imediatamente ao ensaio de atividade de Proteassoma (secção 4) ou western blotting (secção 5). Alternativamente, as amostras podem ser armazenadas em-80 ° c até que necessário.

3. coleção de fração sináptica

Nota: Este protocolo utiliza soluções de estoque pré-fabricados de produtos químicos de laboratório comuns, incluindo 1 M Tris (pH 7,5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl e 10% SDS. Se o valor-limite é usado em ensaios da atividade do Proteassoma, o glicerol e o ATP podem ser adicionados a todos os bufferes para ajudar a impedir a desmontagem de complexos do Proteassoma durante o lysis

  1. Prepare o tampão TEVP com 320 mM de sacarose. Adicionar 60 mL de água ultrapura (desionizada e destilada) a um copo limpo de 100 mL.
    1. Para a taça, adicione 1.300 μL de Tris de 1 M (pH 7,5), 260 μL de EDTA de 0,5 M, 100 μL de cocktail de inibidor de protease, 100 μL de cocktail inibidor da fosfatase e 10,944 g de sacarose. Misture com uma barra de agitação até que a sacarose esteja completamente dissolvida.
    2. Traga o pH a ~ 7,4 adicionando o ácido clorídrico (HCL) gota gota à solução usando uma pipeta.
    3. Transfira a solução para um balão volumétrico de 100 mL. Traga o volume a 100 ml adicionando a água ultrapura. Chill a solução final no gelo até que necessário.
  2. Prepare o buffer de homogeneização. Adicionar 60 mL de água ultrapura (desionizada e destilada) a um copo limpo de 100 mL.
    1. Para a taça, adicione 5.000 μL de Tris de 1 M (pH 7,5), 3.000 μL de NaCl de 5 M, 100 μL de cocktail de inibidor de protease, 100 μL de cocktail inibidor da fosfatase e 2.000 μL de SDS de 10%. Misture com uma barra de agitação.
      Nota: Os detergentes iónicos podem interferir com os ensaios da atividade do Proteassoma resultando na desnaturação do complexo do Proteassoma. O volume de SDS poderia ser abaixado para ajudar a preservar a função do Proteassoma se desejado.
    2. Traga o pH a ~ 7,4 adicionando o HCl gota gota à solução usando uma pipeta.
    3. Transfira a solução para um balão volumétrico de 100 mL. Traga o volume para 100 mL adicionando água ultrapura. Armazene a solução final à temperatura ambiente; Não Chill como SDS vai precipar fora da solução.
  3. Retire a centrífuga de 1,5 mL contendo um hemisfério do ROI do congelador-80 ° c. Assegure-se de que o hemisfério usado seja contrabalançado entre as condições de extração para cada grupo experimental. Por exemplo, em um experimento de dois grupos, use o hemisfério esquerdo para os dois primeiros animais em cada grupo e o hemisfério direito para as próximas duas amostras, etc.
  4. Usando um bisturi, transfira o tecido cerebral congelado para um homogeneizador de Teflon de vidro de 2 mL. Adicionar 500 μL de tampão TEVP ao tubo de Teflon.
    1. Usando o pilão B, Homogeneize o mesmo tecido usando 15 cursos até que nenhuma transferência visível do material contínuo esteja atual. Use um movimento de giro (no sentido horário ou anti-horário) durante cada curso.
  5. Utilizando uma pipeta de 1.000 μL, transfira a amostra homogeneizada para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a amostra em 1.000 x g por 10 min, 4 ° c.
  6. Colete o sobrenadante e transfira para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma pipeta de 1.000 μL. Centrifugue a amostra em 10.000 x g por 10 min, 4 ° c. O pellet original (P1) contém núcleos e os grandes detritos e pode ser Descartado.
  7. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Esta é uma fração citosólica. Adicionar 50 μL de tampão de homogeneização ao pellet (P2) e ressuscitar introduzindo pipetagem até que não seja visível nenhum material sólido.
  8. Centrifugue a amostra em 20.000 x g por 10 min, 4 ° c. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL; Esta é a membrana Synaptosomal bruta (Synaptic) fração. A pelota pode ser descartada.
  9. Meça a concentração proteica da fração sináptica usando o ensaio de proteína DC (de acordo com as instruções do fabricante), ou qualquer ensaio equivalente para amostras coletadas usando detergentes iônicos. Proceder imediatamente ao ensaio de atividade de Proteassoma (secção 4) ou western blotting (secção 5). Alternativamente, as amostras podem ser armazenadas em-80 ° c até que necessário.

4. ensaio de atividade de proteasome

Nota: A atividade do proteasome pode ser medida no tecido de cérebro homogeneizado usando uma versão ligeiramente modificada do kit de atividade de Proteasome 20S. Este ensaio não mede diretamente a atividade de complexos completos do Proteassoma 26S. Em vez disso, ele mede a atividade do núcleo 20s, o que significa que só pode servir como um proxy para entender a atividade do núcleo em si, em oposição a todo o complexo de Proteassoma 26S. O sucesso deste ensaio diminui com ciclos repetidos do Freeze-Thaw e/ou níveis crescentes de detergentes, particularmente iônicos, e exige o uso de um leitor da placa com um conjunto de filtro 360/460 (excitação/emissão) e capacidades de aquecimento até 37 ° c.

  1. Configurações do leitor de placas: pré-aqueça a 37 ° c e segure a corrida.
    1. Ajuste a excitação a 360 e a emissão a 460. Se a placa 96 bem utilizada for clara, defina a posição óptica para baixo. Se uma placa de poço escuro/preto 96 for usada, ajuste a posição óptica para cima.
    2. Ajuste modelos mais velhos do leitor da placa ao auto-ganho as opções lidas fluorescentes; modelos mais recentes são predefinidos para isso. Programe uma corrida cinética com um tempo de 2 h, digitalização (leitura) a cada 30 min.
  2. Reconstituir o tampão de ensaio 10x fornecido no kit com 13,5 mL de água ultrapura. Adicionar 14 μL de 100 mM ATP para o buffer agora 1x; Isso aumenta significativamente a atividade de Proteassoma nas amostras e melhora a confiabilidade do ensaio. O tampão final do ensaio 20S pode ser armazenado no gelo ou em 4 ° c até necessário e é estável por diversos meses.
  3. Reconstituir o padrão AMC fornecido em kit com 100 μL de DMSO. Realize esta etapa no escuro ou condições de pouca luz, como o padrão é sensível à luz.
  4. Crie uma curva de suporte da AMC usando o padrão reconstituído, no escuro ou condições de pouca luz.
    1. Em tubos de microcentrífuga separados de 0,5 mL, adicione 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 e 0 μL do padrão AMC, que corresponde a 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0 μM de concentração de AMC.
    2. Para estes tubos, na mesma ordem, adicione 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 e 100 μL de tampão de ensaio 20S. Isto cria uma série de concentrações elevadas a baixas de AMC, que serão usadas para a calibração do leitor da placa e a análise da atividade do Proteassoma nas amostras homogeneizadas.
    3. Armazene todos os padrões diluídos no gelo no escuro até que seja necessário.
  5. Reconstituir o substrato Proteassoma (suc-llvy-AMC) fornecido em kit com 65 μL de DMSO. Realize esta etapa no escuro ou condições de pouca luz, pois o substrato é sensível à luz. Crie uma diluição 1:20 da carcaça do Proteassoma em um tubo novo do microcentrifugador de 1,5 ml usando o amortecedor do ensaio 20s. Guarde o substrato diluído no gelo no escuro até que seja necessário.
    Nota: Por exemplo, se a placa terá 10 amostras e 1 em branco, você vai precisar de substrato diluído suficiente para 22 poços (com duplicatas) a 10 μL por poço. Isso equivale a 220 μL de necessidade + 30 μL para erros de pipetagem, exigindo 12,5 μL de substrato e 237,5 μL de tampão de ensaio 20S.
  6. Descongelar amostras desejadas (se congeladas) e adicionar uma quantidade normalizada a uma placa de poço 96. Execute cada amostra em duplicatas. A quantidade de amostra necessária varia com base na preparação do tecido. Geralmente, 10-20 μg é suficiente para qualquer fração subcelular.
  7. Traga o volume da amostra para 80 μL com água ultrapura. O valor adicionado depende do volume de amostra adicionado. Por exemplo, se a amostra 1 foi de 4,5 μL de proteína e a amostra 2 foi de 8,7 μL, a quantidade de água necessária será de 75,5 μL e 71,3 μL, respectivamente. Em dois poços separados, adicione 80 μL de água isoladamente; Estes serão os espaços em branco do ensaio.
    Nota: A fim limitar mudanças no volume da proteína devido aos erros de pipetagem, as concentrações da proteína podem ser normalizadas à amostra menos concentrada. Isso permitirá o uso do mesmo volume de amostra em todas as condições.
  8. Adicione 10 μL de tampão de ensaio 20S a cada poço, incluindo o ensaio em branco. Um repetidor/pipeta automatizada é recomendado aqui para assegurar o volume consistente do ensaio através dos poços.
  9. Opcional: Nesta fase, introduzir manipulações in vitro, se desejado; Isto exigirá que cada amostra tenha 2 poços adicionais por tratamento, incluindo o veículo. Em caso afirmativo, adicionar 5-10 μL de fármaco/composto de interesse para 2 dos poços da amostra e um volume equivalente de controle/veículo para outros 2 poços. Coloc a placa no leitor pre-aquecido da placa ou em uma incubadora de 37 ° c por 30 minutos.
  10. Desligue as luzes ou entrar em um quarto escuro. Adicione todos os 100 μL de padrões de AMC diluídos a um poço novo; cada padrão terá um único poço.
  11. No escuro, adicione 10 μL de substrato de Proteassoma diluído a poços contendo amostra e ensaios em branco, mas não ao padrão AMC. Um repetidor/pipeta automatizada é recomendado aqui para assegurar o volume consistente do ensaio através dos poços.
  12. Coloc a placa no leitor da placa e comece a corrida cinética.
    Nota: A placa não precisa estar agitação constante durante a corrida cinética, no entanto, o usuário pode escolher se desejar
  13. No final da execução cinética, exporte valores brutos 360/460 fluorescentes para o Microsoft Excel.
    1. Médias juntas duplicam poços para cada padrão, cada amostra e o ensaio em branco para todas as 5 varreduras. Os valores fluorescentes brutos devem aumentar através de varreduras para as amostras, mas permanecem estáveis (ou diminuem ligeiramente) para padrões e ensaios em branco.
    2. Tome o mais alto padrão AMC bem médio e divida pela concentração conhecida (20 μM). Divida esse valor pela concentração de amostra usada no ensaio para obter o valor padronizado da AMC. Para cada amostra e média de ensaio em branco, divida pelo valor padronizado da AMC.
    3. Tome este valor final e divida pela concentração da amostra usada no ensaio para obter o valor normalizado para cada amostra e o ensaio em branco. Faça isso para todas as 5 varreduras.
    4. Subtrair o valor normalizado de ensaio em branco de cada valor de amostra normalizado para todas as 5 verificações.

5. quantificação da Ubiquitinação de proteínas específicas de ligação

  1. A quantificação de etiquetas diversas do poliubiquitina em frações subcellular diferentes coletadas do tecido do cérebro do roedor deve ser feita usando uma variedade de protocolos de mancha ocidentais padrão em combinação com os anticorpos originais, enlace-específicos do poliubiquitina.
    1. Para desnaturar, misture as amostras normalizadas com um volume igual de tampão de amostra de Laemmli suplementado com β-Mercaptoetanol a uma percentagem de 5% em volume, por instrução do fabricante.
    2. Para a quantificação de todas as modificações da monoubiquitinação e do oxigênio não obstante o enlace, use um anticorpo da bandeja-ubiquitina.
    3. Para reconhecer todas as proteínas polyubiquitinated, use um anticorpo do ubiquitin que não cruze-reage com o monoubiquitination.
    4. Para o polyubiquitination ligação-específico, use os anticorpos que podem detectar o lysine-27, o lysine-48, o lysine-63 e o polyubiquitination linear (M1).
  2. Para evitar a contaminação cruzada entre os desenvolvimentos, o que poderia resultar em um falso positivo ou interferir com a imagem de uma modificação ubiquitina diferente, as membranas de tira entre os desenvolvimentos usando 0,1 M NaOH por 10 min.
    1. Lave as membranas em TBS com 0,1% de interpolação duas vezes por 10 min e Rebloqueie (usando qualquer agente de bloqueio é preferível no protocolo Western blot usado).
    2. Incubar a membrana com o anticorpo secundário e redesenvolva a fim confirmar que a membrana estêve descascada de anticorpos preliminares e secundários corretamente.
    3. Recomendado: Para o desenvolvimento bem sucedido de anticorpos diferentes do ubiquitin sem contaminação, use sistemas fluorescentes ou do próximo-infravermelho da imagem latente. Isso muitas vezes pode impedir a transição entre os anticorpos.
  3. Algumas imagens ocidentais do borrão do ubiquitin fornecerão colunas de faixas distintas (tais como M1) quando outro produzem um mancha-como o teste padrão com poucas ou nenhumas linhas desobstruídas (comuns com K48). Para a quantificação de blots ocidentais imaged do ubiquitin, desenhe uma caixa em torno da coluna que estende a escada inteira dos padrões moleculars.
    1. Ajuste a caixa acima (ou para baixo) se a mancha do ubiquitin se estende através da escada inteira; Isto é comum para as modificações de lysine-48 e varia extensamente através dos compartimentos subcellular.
    2. Subtraia o plano de fundo, que é calculado como a densidade óptica média do plano de fundo imediatamente ao redor da coluna em todos os lados.

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Representative Results

Usando o procedimento descrito aqui, frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas foram coletadas da amígdala lateral do cérebro de rato (Figura 1). A pureza das frações individuais foi confirmada via Western blotting, sondagem com anticorpos contra proteínas que devem ser enriquecidas ou esgotadas no lisado. No primeiro hemisfério onde foi coletada uma fração sináptica bruta, a proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD95) estava presente na fração sináptica, mas não nuclear, com níveis inferiores no citoplasma (Figura 2a). Isso é consistente com o trabalho prévio demonstrando que a preparação da fração sináptica isola ambos os componentes pré-sinápticos e postsynapticos25. Inversamente, a proteína nuclear histona H3 esteve presente na fração nuclear, mas não sináptica, com níveis inferiores no citoplasma (Figura 2b). A presença de PSD95 e H3 no citoplasma é consistente com sua tradução citoplasmática. A proteína citoplasmática β-tubulina estava presente em nossa fração citoplasmática, mas estava em grande parte ausente do lisado nuclear (Figura 2C), com níveis inferiores na região sináptica. Isto sugere que nós pudemos produzir uma fração nuclear que fosse pela maior parte ausente de proteínas cytoplasmic. A presença de tubulina na região sináptica é consistente com estudos anteriores26. Todas as três frações apresentaram níveis semelhantes de proteína β-actina (Figura 2D), que foi utilizada como controle de carga. Coletivamente, esses resultados confirmam que a pureza das frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas coletadas de uma única amígdala lateral de ratos.

Em seguida, todos os lisados foram confirmados para a atividade funcional do Proteassoma usando a versão modificada descrita do ensaio in vitro da atividade do Proteassoma 20s. Em todos os lisados, o sucesso do ensaio foi definido como um aumento nas unidades fluorescentes cruas (RFU) detectadas a partir da primeira varredura (0 min) até a quinta/última varredura (120 min). Para todas estas análises, 10 μM AMC foi utilizado como o mais alto padrão para normalização das unidades fluorescentes cruas (RFU). Na fração sináptica bruta, o RFU atingiu o pico na varredura 5 (Figura 3a), resultando em uma RFU normalizada de pouco menos de 0,1 (Figura 3B). Na fração citoplasmática, o RFU aumentou através de varreduras (Figura 3C) com um RFU normalizado final de ~ 1,6 (Figura 3D). A fração nuclear também exibiu alterações dependentes do tempo no RFU (Figura 3E), com um RFU normalizado final de 0,3 (Figura 3F). As diferenças na atividade do Proteassoma através dos compartimentos refletem provavelmente a disponibilidade dos proteasomas na fração, que são geralmente as mais abundantes no citoplasma e no núcleo27, compartimentos que têm o nível o mais elevado de atividade em nosso Preparação. O menor nível de atividade na região sináptica é consistente com ele sendo o único lisado que foi coletado usando detergentes iônicos, o que pode reduzir a atividade de Proteassoma devido à condição de desnaturação mais severa. Importante, RFU não aumentava ao longo do tempo nos espaços em branco do ensaio ou em lisados (Synaptic) incubadas com o inibidor altamente específico e potente do Proteassoma clasto-lactacystin-β-lactone (Figura 3G, β-Lac), indicando níveis de RFU normalizados finais de 0, 1 e 0, 1, respectivamente (Figura 3h). Isto sugere que a mudança observada em RFU estêve devido especificamente à atividade do Proteassoma e não de outras proteases. Além disso, quando analisados em condições experimentais, houve um aumento na atividade nuclear, mas não citoplasmática, Proteassoma na amígdala lateral após a aprendizagem, que ocorreu simultaneamente com uma diminuição da atividade do Proteassoma sináptico em comparação com animais de controle (Figura 4). Coletivamente, estes resultados confirmam que a atividade do Proteassoma poderia com precisão ser medida em todas as três frações subcellular coletadas de um único amygdala lateral do rato.

Uma das vantagens do teste de atividade do Proteassoma é que as manipulações in vitro podem ser introduzidas nas amostras imediatamente antes da adição do substrato Proteassoma, que permite a identificação de moléculas específicas que podem regular o Proteassoma em Essa fração subcellular particular. Como exemplo disso, o papel de camkii (cálcio/calmodulina dependente proteína quinase II) foi avaliado na fração sináptica, o lisado desnaturado mais áspero coletado, uma vez que camkii é pensado para regular a função de Proteassoma em sinapses. Uma incubação de 30 minutos com o inibidor de camkii MYR-AIP (myristolayted autocamtide-2 relacionou o peptide inibitório) conduziu a um aumento significativamente diminuído na atividade do Proteassoma no ensaio, que alcançou somente os níveis que eram ~ 61% do não tratado controlos (Figura 5a). Por outro lado, a mesma manipulação aplicada ao citoplasma não deu resultado a uma mudança na atividade Proteassoma dos poços tratados pelo veículo (Figura 5b). Estes resultados confirmam que a atividade do Proteassoma pode mais ser manipulada in vitro e que esta manipulação pode ter efeitos diferentes dependendo da fração subcellular coletada.

Além do que quantificar a atividade do Proteassoma, o protocolo descrito pode ser usado para medir diferenças subcellular em modificações diferentes do ubiquitin usando procedimentos ocidentais do borrão. É importante notar que as tags de ubiquitina que podem ser detectadas são limitadas pela disponibilidade de anticorpos específicos de ligação, que atualmente incluem K48, K63 e M1 para ratos (Nota: um anticorpo K27 está disponível, embora não produziu uma imagem detectável em qualquer fração lateral da amígdala ou lysates inteiros da pilha uma variedade de circunstâncias). O polyubiquitination total, a degradação-independente linear/M1 e o ubiquitinação K63 e a ubiquitinação K48 degradação-específica foram detectados em todas as frações subcellular. É importante ressaltar que, quando analisados em diferentes condições experimentais, houve um aumento global (Figura 6a), linear (Figura 6B), K63 (Figura 6C) e K48 (Figura 6D) de poliubiquitinação na amígdala lateral fração nuclear após a aprendizagem em comparação com animais de controle. Ao mesmo tempo, na região cytoplasmic, o oxigênio total diminuiu e o ubiquitinação K48 aumentado depois da aprendizagem, quando o ubiquitinação K63 sináptica foi reduzido. Coletivamente, estes resultados indicam que dentro das mesmas diferenças subcellular animais na ubiquitinação ligação-específica da proteína podem com precisão ser detectadas.

Figure 1
Figura 1 : Esquema para o fraccionamento subcellular do tecido do cérebro do rato. Cérebro de roedores é extraído, região cerebral dissecada e hemisférios divididos. Usando uma série de buffers e etapas de centrifugação, frações nucleares e citoplasmáticas são coletadas de um hemisfério, enquanto uma fração sináptica bruta é coletada do outro. Ambas as frações são então usadas para ensaios de atividade de Proteassoma e western blotting, para o ensaio de níveis de poliubiquitinação de proteínas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Confirmação da pureza da fração sináptica, nuclear e citoplasmática bruta. (A) a proteína de densidade pós-sináptica proteína 95 (PSD95; 1:1000) estava presente no sináptico, mas não na fração nuclear com níveis inferiores no citoplasma. (B) histona H3 (1:500) estava presente na fração nuclear, mas não sináptica, com menor expressão no citoplasma. (C) β-tubulin (1:1000) estava presente no citoplasma, mas em grande parte ausente da fração nuclear, com menor expressão no lisado sináptico. (D) a proteína de limpeza β-actina (1:1000) estava presente em todos os compartimentos subcelulares. As áreas indicam o tamanho esperado da proteína alvo. Este número foi modificado de Orsi, S.A. et al.21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Quantificação da atividade Proteassoma em frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas coletadas da amígdala lateral do mesmo animal. Durante o ensaio da atividade do Proteassoma in vitro, as unidades fluorescentes relativas (RFU) detectadas aumentaram do começo (varredura 1) à extremidade (varredura 5) do ensaio nas frações sináptica (a), cytoplasmic (C) e nucleares (e). A quantificação dessa alteração desde o início indicou um valor normalizado de RFU (em relação a 10 μM AMC) de 0,1 no sináptico (B), 1,6 no citoplasma (D) e 0,3 nas frações nucleares (F). O βlac do inibidor do Proteassoma impediu que os rfus mudem através da sessão (G-H). Este número foi modificado de Orsi, S.A. et al.21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Diferenças subcelulares na atividade do Proteassoma na amígdala lateral do mesmo animal. Um aumento na atividade de Proteassoma nuclear foi detectado em animais treinados (com medo) em relação aos controles, o que correspondeu a uma diminuição na atividade dentro da fração sináptica. A atividade do Proteassoma cytoplasmic permaneceu na linha de base. *P < 0, 5 do controle. Este número foi modificado de Orsi, S.A. et al.21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : In vitro manipulação de atividade Proteassoma em frações sinápticas e citoplasmáticas coletadas. In vitro a manipulação da sinalização de camkii através do inibidor AIP reduziu a atividade do Proteassoma no sináptica (a), mas não o cytoplasmic (B), fração da amígdala lateral do rato. Este número foi modificado de Jarome, T.J. et al.23. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Diferenças subcellular no ubiquitinação ligação-específico da proteína na amígdala lateral do mesmo animal que segue a aprendizagem. (A) houve um aumento na ubiquitinação global na fração nuclear após a aprendizagem, que se correlacionou com uma diminuição na fração citoplasmática. (B) houve aumento da ubiquitinação linear na fração nuclear, mas não citoplasmática ou sináptica, após a aprendizagem. (C) houve aumento da ubiquitinação K63 na fração nuclear após a aprendizagem, que se correlacionou com a diminuição da fração sináptica. (D) K48 ubiquitinação aumentada na fração nuclear e citoplasmática, mas não sináptica, após a aprendizagem. *P < 0, 5 do controle. Todas as densidades ópticas de ubiquitina obtidas foram normalizadas para níveis de β-actina (imagens de Western blot representativas inferiores em A), que foi utilizada como controle de carga. Este número foi modificado de Orsi, S.A. et al.21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, Nós demonstramos um método eficiente para quantificar mudanças na atividade do ubiquitin-proteasome através dos compartimentos subcellular diferentes no mesmo animal. Atualmente, a maioria das tentativas de medir as alterações subcelulares na atividade do sistema ubiquitina-proteasome tem se limitado a um único compartimento por amostra, resultando na necessidade de repetição de experimentos. Isso leva a custos significativos e perda de vida animal. Nosso protocolo alivia esse problema dividindo os hemisférios, permitindo que diferentes frações celulares sejam coletadas de cada hemisfério do mesmo animal. Usando este protocolo, pudemos mostrar pela primeira vez que na mesma atividade animal ubiquitina-proteasome mudanças diferencialmente em frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas em resposta à aprendizagem21.

A principal limitação do protocolo descrito aqui é que é dependente da quantidade de tecido cerebral (amostra) obtido. Por exemplo, como descrito acima, este protocolo requer a divisão de hemisférios de uma determinada região cerebral. No entanto, isso nem sempre pode ser possível, como no caso de certas áreas que só estão presentes em um hemisfério. Nesses casos, o protocolo poderia ser modificado pela primeira homogeneização da região cerebral inteira no tampão TEVP utilizado na etapa da fração sináptica (seção 3,1), uma vez que este tampão está livre de todos os agentes desnaturantes. O exemplo pode ser dividido em duas partes iguais por volume. A primeira parte pode ser usada para a fração sináptica, seguindo o protocolo conforme descrito. Para a segunda metade da amostra, o detergente não-iônico NP-40 pode ser adicionado a uma concentração final de 0, 5%, seguido de centrifugação, conforme descrito na seção 2,6. Isto permitirá a separação de proteínas cytoplasmic no sobrenadante e nas proteínas nucleares na pelota, que pode mais ser isolada seguindo as etapas restantes na seção 2. Uma outra preocupação na quantidade do tecido é que algumas regiões do cérebro são muito pequenas no tamanho, tais como o córtice prelimbic. No entanto, nesses casos, o protocolo acima ainda pode ser usado reduzindo os volumes dos buffers usados, que teriam que ser determinados empiricamente com base no tamanho da região cerebral coletada. Assim, este protocolo pode ser alterado para até mesmo as regiões cerebrais mais difíceis em que menos tecido está disponível.

Uma das principais vantagens do protocolo que delineamos aqui é que ele usa equipamentos laboratoriais comuns e reagentes que podem ser encontrados na maioria das instalações, permitindo que esta metodologia seja modificável para aqueles, mesmo em um orçamento restrito ou com recursos limitados. Além disso, enquanto Delineamos este protocolo como uma forma de medir as alterações subcelulares na sinalização de ubiquitina-proteasome, esta metodologia também pode ser aplicada a qualquer outro processo de proteína ou celular em que a compreensão da localização celular e função é importante. Assim, este protocolo poderia ter aplicações amplas para compreender as funções subcelulares de proteínas ou complexos específicos durante a aprendizagem e a memória ou Estados diferentes da doença.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por fundos de arranque da faculdade de ciências agrícolas e da vida e do colégio de Ciências da Virginia Tech. o TM é apoiado pelo programa George Washington Carver na Virginia Tech.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

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References

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McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

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