Summary
Her præsenterer vi en protokol for DNAzyme-afhængig kavalergang af RNA. Dette muliggør hurtig og websteds afhængig analyse af RNA 2 '-O-methylering. Denne fremgangsmåde kan anvendes til foreløbig eller større vurdering af snoRNA aktivitet.
Abstract
Guide boks C/D små nucleolar RNAs (snoRNAs) katalyserer 2 '-O-methylering af ribosomale og små nukleare RNA. Men et stort antal snoRNA i højere eukaryoter kan promiøst anerkende andre RNA-arter og 2 '-O-methylat flere mål. Her giver vi trin-for-trin guide til den hurtige og ikke-dyre analyse af den stedspecifikke 2 '-O-methylering ved hjælp af en veletableret metode, der anvender korte DNA-oligonukleotider kaldet DNAzymes. Disse DNA-fragmenter indeholder katalytiske sekvenser, som kløver RNA ved specifikke konsensus positioner, samt variable homologi Arms, der dirigerer dnazyme til sine RNA-mål. DNAzyme aktivitet hæmmes af 2-' O-methylering af nukleotid støder op til spaltnings stedet i RNA. Således er DNAzymes, kun begrænset af konsensus af spaltet sekvens, perfekte værktøjer til hurtig analyse af snoRNA-medieret RNA 2 '-O-methylering. Vi analyserede snoRNA snR13-og snR47-guidet 2 '-O-methylering af 25S ribosomale RNA i Saccharomyces cerevisiae for at demonstrere enkelheden af teknikken og for at give en detaljeret protokol til DNAzyme-afhængig analyse.
Introduction
RNA-modifikationer spiller en vigtig rolle i reguleringen af genekspression. RNA 2 '-O-methylering og pseudouridylation, som styres af box C/D og box H/ACA små nucleolar RNAs (snornas) henholdsvis beskytter RNA mod nedbrydning og stabiliserer deres højere ordre strukturer1,2,3 . SnoRNA mål er primært blevet identificeret i ribosomale RNAs (rRNA) og små nukleare RNAs (snRNAs). Men i højere eukaryoter, der er potentielt hundredvis af snorna med ingen tildelte funktioner og nogle af dem kan genkende flere RNAs1,4,5,6,7. Derfor er metoder, der giver mulighed for identifikation og analyse af snoRNA-guidede modifikationer, vigtige værktøjer til at afdække mekanismer for cellulære processer.
En boks C/D snoRNA-guidet, anstødelige 2 '-O-methylering site kan identificeres bioinformatisk og bekræftet eksperimentelt af mange teknikker, herunder RNase H-instrueret spaltning, eller site-specifikke og genomdækkende metoder, som beskæftiger reverse transskription i lavnukleotider (dntps) koncentrations metode8,9,10,11. Disse teknikker er meget følsomme, men også omstændelig og dyre, derfor, kan ikke være egnet til den indledende eller hurtig test. En af de enkleste og billige metoder til at identificere 2 '-O-methylering sites er DNAzyme-afhængige RNA kavalergang12. DNAzymes er korte, enkelt strengede og katalytisk aktive DNA-molekyler, der kan endonukleolytisk spaltning af RNA på bestemte positioner. De består af en bevaret og katalytisk aktiv kerne sekvens og 5 ' og 3 ' bindings arme bestående af variable sekvenser, der er designet til at hybridisere af Watson-Crick base-parring til RNA-målet (figur 1). Således giver 5 ' og 3 ' armene den katalytiske sekvens til det specifikke RNA-sted. Dnazyme-afhængig spaltning hæmmes af 2 '-O-methylering af nucleotid placeret direkte opstrøms for kavaler pladsen12,13. Dette gør DNAzymes meget praktiske værktøjer til analyse af formodede eller kendte RNA 2 '-O-methylering sites.
Der anvendes to typer DNAzymes til analyse af RNA-modifikationer12. Den aktive sekvens af 10-23 DNAzyme (figur 1a) består af 15 nukleotider (5 ' RGGCTAGCTACAACGA3 '), som danner en løkke omkring den målrettede RNA purin-pyrimidin (ry) dinucleosid og katalyserer spalningen mellem disse to nukleotider. RNA purin (R) er ikke base-parret med DNAzyme og 2 '-O-methylering præsenterer på DNAzyme hæmmer kavalergang. Bind armene på 10-23 DNAzymes er normalt 10-15 nucleotider lang. Den anden DNAzyme klasse, 8-17 DNAzymes (figur 1b) indeholder 14-nukleotid katalytisk sekvens (5 ' TCCGAGCCGGACGA3 '). Nucleotides C2, c3 og g4 par med C9 G10 og g11 danner en kort stamme-loop struktur. 8-17 dnazymes kløver RNA opstrøms for enhver guanin, der er perfekt parret med den første cytosin fra dnazyme Active sekvensen. RNA-nukleotid opstrøms for guanin er ikke base-parret med DNAzyme og dets 2 '-O-methylering forringer spalningen. 8-17 DNAzymes kræver længere homologi arme på omkring 20 nukleotider for at dirigere DNAzyme til dens specifikke sekvens.
Her giver vi en trin-for-trin protokol til analyse af 2 '-O-methylering af rRNA i Saccharomyces cerevisiae ved hjælp af 10-23 og 8-17 dnazyme-afhængige tilgange12,13 (figur 1c). Denne protokol kan let tilpasses til andre organismer og RNA-arter og anvendes til hurtige, foreløbige eller større analyser af den stedspecifikke RNA 2 '-O-methylering.
Protocol
1. stammer, medier, og buffer opskrifter
- Forbered gær (S. cerevisiae) medier som beskrevet her: YP (1% w/v gær ekstrakt, 2% w/v bakteriologisk peptone), og glucose og galactose bestande ved 20% w/v.
- Forbered natriumacetat (NaAc)-EDTA (AE) buffer som beskrevet her: 50 mM NaAc pH 5,3 og 10 mM EDTA.
- Forbered 10-23 DNAzyme 4X inkubations buffer som detaljeret her: 24 mM Tris pH 8,0, 60 mM NaCl og 10-23 DNAzyme 4X Reaktionsbuffer: 200 mM Tris pH 8,0 og 600 mM NaCl.
- Forbered 8-17 DNAzyme 2x reaktions buffer som beskrevet her: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,0, 15 mM MgCl2og 15 mm mncl2.
- Forbered 10x MOPS buffer som detaljeret her: 200 mM MOPS, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7,0 og 1.5 x prøve Denaturerings buffer: 50% v/v formamid, 20% v/v formaldehyd, 1.5 x MOPS buffer.
- Opnå S. cerevisiae stammer, BY4741 (MATa His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1:: SNR13 (som BY4741, men GAL1:: SNR13: KANmX); GAL1:: SNR47 (som BY4741, men GAL1:: SNR47: HIS3mX). Enhver anden gærstamme kan anvendes til denne analyse.
2. DNAzyme design
- Find RNA sekvens af interesse eller formodede methylering site ved hjælp af en passende database. For S. cerevisiae snorna mål, brug gær snorna database: http://People.Biochem.UMass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14
- For at finde den methylering sted af interesse, f. eks, snR13-afhængige websted, skal du vælge "snR13" og notere positionen af den modificerede nucleotid (f. eks snR13-guidede en2281 i 25S rRNA).
- Find sekvenser opstrøms og nedstrøms for den modificerede nucleotid ved hjælp af passende database. For S. cerevisiae, brug Saccharomyces Genome database: https://www.yeastgenome.org/
- Søg efter målnavnet for genet fx RDN25 (kodning 25S rRNA).
- Fra "sekvens" fanen, skal du vælge 10-15 nukleotider upstream (5 ' arm) og downstream (3 ' arm) af methylering site, når du bruger en 10-23 dnazyme assay og 20 nukleotider opstrøms (5 ' arm) og downstream (3 ' arm) af methylering site for en 8-17 dnazyme.
- Opret komplementære sekvenser af 5 ' og 3 ' arme.
- Flanke 10-23 eller 8-17 DNAzyme katalytisk sekvens med komplementære sekvenser af 5 ' og 3 ' arme.
- Bestil DNAzyme som et normalt DNA-oligonukleotid fra leverandøren.
3. S. cerevisiae vækstbetingelser
Bemærk: S. cerevisiae BY4741 stamme derivater blev anvendt, hvor ekspression af enten SNR13 eller SNR47 snorna er drevet fra den inducerbare GAL1 promotor. For at inducere eller hæmme deres syntese, dyrke celler på medium indeholdende galactose (GAL1-afhængig transkription på) eller glucose (GAL1-afhængig transkription off). Som en kontrol, brug Wild type stamme (BY4741) dyrket enten på galactose eller glucose.
- Dyrke gær stammer i et passende medium og betingelser. At analysere GAL1:: SNR13 og GAL1:: SNR47 stammer samt den isogene vilde type stamme, vokse celler i 50 ml YP medier med enten 2% glukose (YPD) eller galactose (ypgal) ved 30 ° c til den midterste eksponentielle fase.
- Centrifuge cellerne ved 1.000 x g, i 3 minutter ved 4 °c.
- Kassér supernatanten og opbevar pillerne.
- Frys celle pellets i flydende nitrogen og opbevar dem ved-80 °C.
Forsigtig: Flydende nitrogen kan forårsage alvorlige kryogene forbrændinger. Bær altid Beskyttelsesbeklædning og brug sikkerhedsforanstaltninger.
Bemærk: Celle pellets kan opbevares ved-80 °C op til 1 måned. Protokollen kan sættes på pause her, hvis det er nødvendigt.
4. RNA-isolation15
Bemærk: Brug den mest hensigtsmæssige metode til at isolere RNA. For gær S. cerevisiae, hot-phenol RNA ekstraktion kan anvendes.
- Tilsæt 1 mL iskold vand, resuspender pellets og Overfør resuspenderede celler til 1,5 mL mikrorør.
- Centrifugeres ved 20.000 x g i 10 s ved 4 °c, og supernatanten fjernes.
- Tilsæt 400 μL AE-buffer, og gensuspender cellerne.
Bemærk: Trin 4.4-4.15 udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. - Tilsæt 40 μL 10% SDS og 400 μL syre phenol (pH 4,5).
Forsigtig: Phenol er giftigt og bør håndteres under en røg hætte. Brug altid en laboratorie frakke, beskyttende handsker og briller, når du arbejder med phenol. Bortskaf affaldet i henhold til de institutionelle bestemmelser. - Bland godt ved vortexning for 20 s.
- Inkuber ved 65 °C i 10 min. Hver 2 min, forsigtigt åbne og lukke røret for at frigive trykket og flip røret 2-3 gange for at blande faserne.
- Rørene overføres til-80 °C og inkuberes i 10 min.
- Afrimning rørene på bænken og centrifugeres ved 20.000 x g, i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Den øvre fase overføres til et nyt rør, der indeholder 400 μL syre phenol: chloroform: isoamylalkohol (25:24:1). Må ikke forstyrre Interphase.
Forsigtig: Chloroform er giftigt og bør håndteres under en røg hætte. Brug altid en laboratorie frakke, beskyttende handsker og briller, når du arbejder med chloroform. Bortskaf affaldet i henhold til de institutionelle bestemmelser. - Bland godt ved vortexning for 30 s og centrifuge ved 20.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Den øvre fase (~ 400 μL) overføres til et nyt rør, der indeholder 400 μL chloroform.
- Bland godt ved vortexning for 30 s og centrifuge ved 20.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Den øvre fase (~ 300-350 μL) overføres til et nyt rør, der indeholder 1 mL EtOH og 40 μL af 7,5 M ammonium acetat (NH4AC). Bland ved at spejlvende røret et par gange.
- Inkuber ved-80 °C i 2 timer eller natten over ved-20 °C.
Bemærk: Proceduren kan sættes på pause her. - Centrifugeres ved 20.000 x g, i 10 minutter ved 4 °c. En lille, hvid RNA-pellet vil blive synlig på bunden af røret.
- Fjern EtOH ved pipettering for at undgå at forstyrre pellet.
- Tilsæt 1 mL 70% EtOH og centrifugeres ved 20.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern 70% EtOH ved pipettering.
- Centrifuge ved 20.000 x g for 15 s og fjern den resterende etoh med 2-20 μl pipette.
- Lad røret stå åbent på bænken i 5 minutter for at tørre RNA-pellet.
Bemærk: RNA pellet ændrer sin farve fra hvid til transparent, når den er tør. - Resuspension af RNA-pellet i 30 μL RNase/DNase-fri H2O, Overfør straks røret på isen og mål RNA-koncentrationen på microspektrofotometer.
- Prøverne fryses ved-20 °C.
Bemærk: RNA kan opbevares ved-20 °C op til 1 måned og ved-80 °C op til 1 år. Proceduren kan stoppes midlertidigt her eller fortsætte direkte til næste trin.
5. DNAzyme fordøjelse
-
10-23 DNAzyme fordøjelse
- I 1,5 mL-rør forberedes en inkubations blanding ved at kombinere 5 μg RNA, 200 pmol af 10-23 DNAzyme (2 μL 100 mM stamopløsning) og 2,5 μL 4X 10-23 inkubations buffer i et samlet volumen på 10 μL. hold rørene på is.
- Rørene overføres til en tør varmeblok, der er indstillet til 95 °C, og inkuberes i 3 min.
- Straks overføres rørene på is og inkuberes i 5 minutter.
- Spin ned kort og sætte rørene tilbage på isen.
- Tilsæt 20 e Rnasehæmmer (f. eks. 0,5 μL RiboLock Rnasehæmmer).
- Rørene placeres i en tør varmeblok, der er indstillet til 25 °C, og inkuberes i 10 minutter.
- I mellemtiden skal der forberedes en reaktionsblanding i et 1,5 μL rør ved at kombinere 5 μL 4X 10-23 reaktions buffer med 4 μL 300 mM MgCl2 og 1 μl H2O. Anbring røret i en tør blok indstillet til 37 °c.
- Inkubations blandingen overføres til en tør varmeblok, der er indstillet til 37 °C, og der tilsættes 10 μL præ-varmet reaktionsblanding.
- Reaktionen inkubates ved 37 °C i 1 time.
- Overfør rørene på isen og Fortsæt til trin 5.3.1.
-
8-17 DNAzyme fordøjelse
- Forbered et 1,5 mL mikrorør med 5 μg RNA i et samlet volumen på 6 μL. hold røret på is.
- Forbered et 1,5 mL mikrorør med 400 pmol af 8-17 DNAzyme (4 μL ud af 100 mM lager). Hold røret på is.
- Rørene overføres til en tør varmeblok, der er indstillet til 95 °C, og inkuberes i 2 min.
- Flyt RNA-prøven på is.
- Drej røret ned med DNAzyme i 5 s og Inkuber ved 25 °C i 10 minutter.
- Samtidig forberedes et 1,5 mL rør med 10 μL 2x 8-17 reaktions buffer og inkuberes ved 25 °C.
- Forbered en reaktionsblanding ved at tilsætte 10 μL pre-warmed 2x reaktions buffer til røret med DNAzyme.
- Overfør 14 μL af reaktionsblandingen til røret med RNA, og tilsæt 20 U Rnasehæmmer.
- Reaktionen inkubates ved 25 °C i 2 timer.
- Overfør røret på is og Fortsæt til RNA rensning (trin 5.3.1).
-
RNA-rensning
- Tilsæt 350 μL vand og 400 μL chloroform til reaktionsrøret, bland godt ved vortexning i 30 s og centrifuge ved 20.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Den øvre fase (~ 300-350 μL) overføres til et nyt rør, der indeholder 1 mL EtOH, 40 μL af 7,5 M NH4AC og 1 μl glykogen (10 μg/μl). Bland ved at spejlvende røret et par gange.
- Inkuber ved-80 °C i 2 timer eller natten over ved-20 °C.
Bemærk: Proceduren kan sættes på pause her. - Gentag trin fra 4,15 til 4,21.
- Resuspension af RNA-pellet i 10 μL RNase/DNase-fri H2O og Overfør straks rørene på is.
- Prøverne fryses ved-20 °C.
Bemærk: RNA kan opbevares ved-20 °C op til en måned og ved-80 °C op til 1 år. Proceduren kan sættes på pause her eller fortsætte til RNA elektroforese.
6. RNA-elektroforese
- Spray elektroforese udstyr (tank, bakke, kam) med 1% SDS, lad i 15 min og skyl med masser af ddH2O.
- 1,5 g agopstået i 127,5 mL ddH2O opløses ved opvarmning i mikrobølgeovnen.
- Der tilsættes 15 mL 10x MOPS og 7,5 mL 37% formaldehyd til aghas-opløsningen (total volumen er 150 mL).
Forsigtig: Formaldehyd er giftigt og bør håndteres under en røg hætte. Brug altid en laboratorie frakke, beskyttende handsker og briller, når du arbejder med formaldehyd. Bortskaf affaldet i henhold til de institutionelle bestemmelser. - Tilsæt en passende mængde af en gelplet af valget til aghas-opløsningen (f. eks. 15 μL SYBR Safe DNA-gel bejdsning). Bland godt og hæld agopstået til bakken.
- Indsæt en kam i gelen med det samme.
- Lad den stå i 45 min under røghætten. Dæk bakken med aluminiumsfolie, når du bruger en lysfølsom gel bejdning.
- Forbered 600 mL 1x MOPS buffer.
-
Forberedelse af RNA-prøver
- I et 1,5 mL rør kombineres 10 μL af den Ford øjede og oprensede RNA-prøve, 5 μL prøve Denaturerings buffer og 0,5 μL af 6x-belastnings farve.
Forsigtig: Formamid er giftigt og bør håndteres under en røg hætte. Brug altid en laboratorie frakke, beskyttende handsker og briller, når du arbejder med formamid. Bortskaf affaldet i henhold til de institutionelle bestemmelser. - Incubate RNA-prøver ved 70 °C i 5 min. Overfør prøverne på is. Inkuber i 5 min.
- Spin ned kort før lastning på gelen.
- I et 1,5 mL rør kombineres 10 μL af den Ford øjede og oprensede RNA-prøve, 5 μL prøve Denaturerings buffer og 0,5 μL af 6x-belastnings farve.
- Sæt gelen i elektroforese tanken og fyld med 1x MOPS buffer. Læg hele volumenet af hver prøve (15 μL) på gelen. Kør ved 80 V indtil bromphenolblåt blå når 2/3 af gel længde.
- Billede gelen ved hjælp af en Imager egnet til at detektere den valgte gel plet (f. eks. UV-transilluminator).
Representative Results
Nytten af DNAzyme-afhængige kavalergang i analysen af rRNA modifikationer er blevet vist for nylig i forbindelse med snoRNAs modning13. Den DNAzyme-afhængige assay blev brugt til at påvise, at manglen på 5 '-ende præ-snoRNA behandling påvirker 2 '-O-methylering niveauer af 25S og 18S rRNA i S. cerevisiae13.
Her brugte vi et inducerbart snoRNA transskription system til at demonstrere effektiviteten og enkelheden af teknikken. Boks C/D snR13 guider methylering på to positioner i 25S rRNA, herunder adenin 2281 (figur 2a). Denne nucleotid efterfølges af uracil, som udgør konsensus dinucleotid (ry) spalte af en 10-23 dnazyme. Boks C/D snR47 vejleder også methylering af to nukleotider i 25S rRNA (figur 2b). Adenin i position 2220 efterfølges af en guaninrest, og denne dinucleotid kan spaltet af en 8-17 DNAzyme. For at inducere eller hæmme syntesen af enten snR13 eller snR47 snoRNA indsatte vi den inducerbare GAL1 promotor opstrøms for enten snR13 eller snR47 gener og dyrkede celler i medium indeholdende galactose (GAL1-afhængige eller glucose (GAL1-afhængig transkription). Dernæst RNA isoleret fra GAL1:: SNR13 celler blev inkuberet med 10-23 dnazyme designet til at kløve 25s rRNA på SNR13-afhængige sted, i mellem nukleotider 2281 og 2282 (figur 2c). RNA fra GAL1:: SNR47 stamme blev behandlet med 8-17 dnazyme målretning SNR47-afhængige websted i mellem nukleotider 2220 og 2221 (figur 2D). Som en kontrol, RNA fra Wild-type BY4741 stamme vokser på enten galactose eller glucose blev inkuberet med begge DNAzymes. Elektroforese af DNAzyme-behandlet RNA afslørede, at 25S rRNA udvundet fra GAL1:: SNR13 og GAL1:: SNR47 stammer vokser på GALACTOSE (gal) forblev intakt (figur 3a,B; Lanes 3). I modsætning, RNA isoleret fra GAL1:: SNR13 og GAL1:: SNR47 celler vokser på glukose (GLC) blev fordøjet af respektive Dnazymes (figur 3a, B; Lanes 4). I begge tilfælde faldt 25S rRNA-båndet, og 5 ' og 3 ' cut-off-kavaler-produkter (A og B) blev observeret. Dette indikerer, at i GAL1:: SNR13 og GAL1:: SNR47 stammer, 25s rRNA var 2 '-O-methyleret på SNR13-eller SNR47-guidede sites, når galactose blev brugt som en kulstofkilde, og disse snorna blev udtrykt. Manglen på 25S rRNA methylering når snR13 eller snR47 udtryk blev slukket på glucose tilladt for DNAzyme-afhængige spaltning. Der blev ikke observeret nogen RNA-fordøjelse for vildtype prøver (figur 3a,B; vognbane 1 og 2), da ekspression af snR13 og snR47 er galactose/glucoseuafhængig i denne stamme. Derfor blev rRNA normalt methyleret og så modstandsdygtig over for DNAzymes aktivitet.
Samlet set viser vores eksperiment, at kløvningen af 10-23 (figur 3a) og 8-17 (figur 3b) dnazymes korrelerede med fraværet af box C/D snR13 eller snR47, hvilket klart indikerer, at disse snorna er ansvarlige for 25s rRNA 2 '-O-methylering på bestemte steder.
Figur 1: DNAzymes og deres RNA-substrater. (A) 10-23 DNAzymes kløver en purin-pyrimidin (ry) RNA dinucleotid. R i RNA er ikke parret med DNAzyme, mens Y er et supplement til R-basen i DNAzyme. Methylering af purin (R) i RNA undertrykker DNAzyme-afhængig kavalergang. (B) 8-17 dnazymes kløver RNA opstrøms for guanin, der er perfekt parret med den første cytosin i dnazyme katalytisk sekvens. Nukleotidden foregående guanin er ikke parret, og dens methylering beskytter mod DNAzyme-afhængig kavalergang. RNA er vist i grå (bortset fra methylering site), DNAzyme er vist i lilla. N = enhver nukleotid, R = purin: adenin eller guanin, Y = pyrimidin: cytosin eller uracil; CH3-betegner RNA-methylering. Base parring i DNAzyme aktive sekvenser er markeret med punkterede linjer. En blå lynbolt markerer kavaler pladsen. C) et rutediagram, der viser trinnene i en DNAzyme-afhængig analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: DNAzymes, som er målrettet mod snR13-og snR47-afhængige methylerings steder i 25S rRNA. (A, B) Browser screenshots viser snR13-afhængige (a) og snR47-afhængige (B) methylering steder i 25s rRNA (C) 25S rRNA sekvens omkring snR13-afhængige methylering site (A2281) og 10-23 dnazyme (vist i lilla) designet til at kløve RNA mellem en2281 og U2282. En2281 er ikke parret med dnazyme mens U2282 danner et par med den første nucleotid fra dnazyme aktiv sekvens (markeret med en blå linje). Et blåt lyn markerer spalten. D) 25S rRNA-sekvens omkring snR47-afhængig methylerings sted (A2220) og 8-17 dnazyme (vist med lilla) designet til at kløve RNA mellem A2220 og G2221. En2220 er ikke hybridiseret med dnazyme, mens G2221 er uperfekt parret med cytosin (angivet med en stiplet linje). En blå lynbolt markerer kavaler pladsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af områdespecifik 2 '-O-methylering af 25S rRNA med 10-23 og 8-17 DNAzyme-afhængig analyse. A) analyse af snR13-afhængig 25S rRNA-methylering med 10-23 DNAzyme. B) analyse af snR47-afhængig 25S rRNA-methylering med 8-17 DNAzyme. RNA blev visualiseret farvning i en denaturering agopstået gel. Cleavage produkter A og B er markeret med røde pile. WT = vildtype stamme; GAL = galactose, GLC = glucose. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Dnazyme-afhængig fordøjelse kan bruges som en enkel og hurtig metode til at analysere site-specifikke RNA 2 '-O-methylering12,13. DNAzymes kløver RNA, hvis nukleotid opstrøms for kavaler pladsen ikke er methyleret. I modsætning til andre tilgange, herunder RNase H-dirigeret fordøjelse, alkalisk nedbrydning eller omvendt transskription i lav nukleotider koncentration efterfulgt af kvantitativ PCR eller sekventering8,10,11 ,16, dnazyme tilgang kræver en simpel DNA oligonukleotid og grundlæggende reagenser, der er til stede i enhver molekylær biologi laboratorium. Desuden kan DNAzymes anvendes på en lignende måde til at analysere RNA pseudouridylation medieret af box H/ACA snoRNA12, hvilket gør dem alsidige værktøjer til at studere snorna mål.
DNAzyme-afhængige tilgange er kun begrænset af kavalergang konsensus sekvenser17. 10-23 DNAzymes kan anvendes til at analysere 2 '-O-methylering kun på position R af RY dinucleotid, mens 8-17 DNAzymes genkende modifikationen af nukleotid placeret opstrøms for guanin. Som følge heraf kan ændringer som 2 '-O-methylering af det første nukleotid i dinucleotides guanine-adenin (GA), adenin-adenin (AA), pyrimidin-adenin (YA) og pyrimidin-pyrimidin (YY) ikke analyseres. Desuden bør den lave effektivitet af DNAzyme-afhængig spaltning12 overvejes. Selv om nogle DNAzymes Cleave RNA næsten helt (figur 3b), mange dnazymes kun delvist fordøje deres mål (figur 3b). Effektiviteten kan afhænge af sekvensen omkring kavaler pladsen. F. eks. kan RNA-regioner med strækninger af samme nukleotid påvirke den korrekte placering af den aktive DNAzyme-sekvens. Desuden kan RNA-regioner, der danner en stærk sekundær struktur, re-hybridisere og undertrykke DNAzyme binding til målsekvensen. For at overvinde disse problemer, cyklusser af opvarmning og afkøling af 10-23 DNAzyme og dets RNA substrat kan anvendes18.
Vi brugte DNAzyme-tilgangen til at undersøge 2 '-O-methylering af rRNA. Man kan også bruge denne teknik til at analysere andre RNA modifikationer, såsom N6-methyladenosine19. Ribosomal RNA, på grund af sin overflod, kan analyseres ved elektroforese og spaltningen produkter kan visualiseres under UV-lys. Dette gælder dog ikke for mindre rigelige RNAs som RNA polymerase II-genereret kodning RNAs (mRNA) og ikke-kodning RNAs (ncRNA). Disse RNAs kan normalt ikke påvises direkte ved RNA-farvning i agrose eller polyacrylamid geler. I sådanne tilfælde kan DNAzyme-afhængig spaltning visualiseres ved nordlige blotning, indirekte påvist ved PCR/kvantitativ PCR eller analyseret ved kvantitativ PCR med polymeraser (f. eks. KlenTaq DNA-Polymerase), der er i stand til at diskriminere 2 ′-O-methyleret RNA fra ikke-methyleret RNA20,21.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Maya Wilson og Aneika Leney for den kritiske læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en Sir Henry dale Fellowship i fællesskab finansieret af Wellcome Trust og Royal Society (200473/Z/16/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acid phenol | SIGMA | P4682 | |
| Agarose | VWR | A2114 | |
| Ammonium acetate | SIGMA | A1542 | |
| Chlorophorm | Fisher scientific | 10293850 | |
| DNase/RNase free water | Fischer Scientific | 10526945 | |
| DNAzyme | Integrated DNA Technology | Custom oligo DNA | |
| EDTA | SIGMA | E9884 | |
| Ethanol Absolute | Fisher scientific | 10437341 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Formamide | sigma | F9037 | |
| Galactose | SIGMA | G0750 | |
| Gel Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Glucose | SIGMA | G7021 | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | R0561 | |
| HEPES | SIGMA | H3375 | |
| Isoamyl | SIGMA | W205702 | |
| KCl | SIGMA | P9333 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| MnCl2 | SIGMA | 244589 | |
| MOPS | SIGMA | M1254 | |
| NaCl | SIGMA | S7653 | |
| Oxoid Peptone Bacteriological | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| Oxoid Yeast Extract Powder | Thermo Fisher Scientific | LP0021 | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
| SDS | SIGMA | 74255 | |
| Sodium acetate trihydrate | SIGMA | S8625 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| Tris base | SIGMA | TRIS-RO | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt | ||
| 152VR5C01M -80°C freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 250 mL Erlenmeyer flasks | Cole-Parmer | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Combicup VX200 vortex | Appleton Woods | ||
| DS-11 microspectrophotometer | Denovix | ||
| Electrophoresis chamber (20 cm tray) | SIGMA | ||
| FiveEasy F20 pH meter | Appleton Woods | ||
| Gel documentation system | Syngene | ||
| Heraeus Fresco 21 micro centrifuge | Fisher Scientific | ||
| Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | ||
| Mini Fuge Plus mini centrifuge | Starlab | ||
| Mixer HC thermal block | Starlab | ||
| OLS26 Shaking Water Bath | Grant | ||
| PowerPac power supplier | BioRad |
References
- Dieci, G., Preti, M., Montanini, B. Eukaryotic snoRNAs: a paradigm for gene expression flexibility. Genomics. 94 (2), 83-88 (2009).
- Watkins, N. J., Bohnsack, M. T. The box C/D and H/ACA snoRNPs: key players in the modification, processing and the dynamic folding of ribosomal RNA. Wiley Interdisciplinary Review RNA. 3 (3), 397-414 (2012).
- Kufel, J., Grzechnik, P. Small Nucleolar RNAs Tell a Different Tale. Trends in Genetics. , (2018).
- Li, T., Zhou, X., Wang, X., Zhu, D., Zhang, Y. Identification and characterization of human snoRNA core promoters. Genomics. 96 (1), 50-56 (2010).
- Jorjani, H., et al. An updated human snoRNAome. Nucleic Acids Research. 44 (11), 5068-5082 (2016).
- Hubbard, T. J., et al. Ensembl 2009. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D690-D697 (2009).
- Makarova, J. A., Kramerov, D. A. SNOntology: Myriads of novel snoRNAs or just a mirage? BMC Genomics. 12, 543 (2011).
- Yu, Y. T., Shu, M. D., Steitz, J. A. A new method for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules. RNA. 3 (3), 324-331 (1997).
- Decatur, W. A., Liang, X. H., Piekna-Przybylska, D., Fournier, M. J. Identifying effects of snoRNA-guided modifications on the synthesis and function of the yeast ribosome. Methods in Enzymology. 425, 283-316 (2007).
- Dong, Z. W., et al. RTL-P: a sensitive approach for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules. Nucleic Acids Research. 40 (20), e157 (2012).
- Birkedal, U., et al. Profiling of ribose methylations in RNA by high-throughput sequencing. Angewandte Chemie International Edition, England. 54 (2), 451-455 (2015).
- Buchhaupt, M., Peifer, C., Entian, K. D. Analysis of 2'-O-methylated nucleosides and pseudouridines in ribosomal RNAs using DNAzymes. Analytical Biochemistry. 361 (1), 102-108 (2007).
- Grzechnik, P., et al. Nuclear fate of yeast snoRNA is determined by co-transcriptional Rnt1 cleavage. Nature Communication. 9 (1), 1783 (2018).
- Piekna-Przybylska, D., Decatur, W. A., Fournier, M. J. New bioinformatic tools for analysis of nucleotide modifications in eukaryotic rRNA. RNA. 13 (3), 305-312 (2007).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18 (10), 3091-3092 (1990).
- Maden, B. E. Mapping 2'-O-methyl groups in ribosomal RNA. Methods. 25 (3), 374-382 (2001).
- Santoro, S. W., Joyce, G. F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proceedings of the National Academy of Science, U. S. A. 94 (9), 4262-4266 (1997).
- Hengesbach, M., Meusburger, M., Lyko, F., Helm, M. Use of DNAzymes for site-specific analysis of ribonucleotide modifications. RNA. 14 (1), 180-187 (2008).
- Sednev, M. V., et al. N(6) -Methyladenosine-Sensitive RNA-Cleaving Deoxyribozymes. Angewandte Chemie International Edition, England. 57 (6), 15117-15121 (2018).
- Aschenbrenner, J., Marx, A. Direct and site-specific quantification of RNA 2'-O-methylation by PCR with an engineered DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 44 (8), 3495-3502 (2016).
- Lee, K. W., Bogenhagen, D. F. Assignment of 2'-O-methyltransferases to modification sites on the mammalian mitochondrial large subunit 16 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (36), 24936-24942 (2014).
