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Developmental Biology

RNA 2'-O-मेथिलेशन का DNAzyme-निर्भर विश्लेषण

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59700
Automatic Translation
1, 1
1School of Biosciences, University of Birmingham

Summary

यहाँ हम आरएनए के DNAzyme-निर्भर दरार के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह आरएनए 2 'ओ-मेथिलेशन के तेजी से और साइट पर निर्भर विश्लेषण सक्षम बनाता है। इस दृष्टिकोण snoRNA गतिविधि के प्रारंभिक या प्रमुख आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

गाइड बॉक्स C/D छोटे न्यूक्लिओलर आरएनए (snoRNAs) रिबोसोमल और छोटे परमाणु आरएनए के 2'-O-मिथाइलेशन उत्प्रेरित। हालांकि, उच्च यूकैरियोट में snoRNA की एक बड़ी संख्या promiscuously अन्य आरएनए प्रजातियों और 2 'ओ-मेथिलेट कई लक्ष्यों को पहचान सकते हैं. यहाँ, हम साइट के तेजी से और गैर महंगा विश्लेषण के लिए कदम दर कदम गाइड प्रदान करते हैं विशिष्ट 2'-O-methylation एक अच्छी तरह से स्थापित विधि का उपयोग कर कम डीएनए oligonucleotides DNAzymes बुलाया रोजगार. इन डीएनए टुकड़ों में उत्प्रेरक अनुक्रम होते हैं जो विशिष्ट आम सहमति स्थितियों पर आरएनए को छोड़ देते हैं, साथ ही परिवर्तनीय होमोलोजी आर्म्स जो डीएनएजीएम को अपने आरएनए लक्ष्यों के लिए निर्देशित करते हैं। DNAzyme गतिविधि आरएनए में दरार साइट के निकट न्यूक्लिओटाइड के 2-'O-मेथिलेशन द्वारा बाधित है। इस प्रकार, DNAzymes, केवल cleaved अनुक्रम की आम सहमति से सीमित, snoRNA-मध्यस्थ आरएनए 2'-O-मेथिलेशन के त्वरित विश्लेषण के लिए एकदम सही उपकरण हैं. हम snoRNA snR13- और snR47 निर्देशित 2'-O-methylation के 25S ribosomal आरएनए Saccharomyces cerevisiae में तकनीक की सादगी का प्रदर्शन करने के लिए और DNAzyme-निर्भर परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए विश्लेषण किया.

Introduction

आरएनए संशोधन जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। आरएनए 2'-ओ-मेथिलेशन और स्यूडोयूरिडिलेशन, जो बॉक्स सी/डी और बॉक्स एच/एसीए छोटे न्यूक्लिओलर आरएनए (स्नोआरएन) द्वारा क्रमशः निर्देशित किया जाता है, आरएनए को निम्नीकरण से बचाता है और उनके उच्च-क्रम संरचनाओं को स्थिर करताहै 1,2,3 . स्नोरना लक्ष्यों की पहचान मुख्य रूप से रिबोसोमल आरएनए (आरआरएनए) और छोटे परमाणु आरएनए (एसआरएनए) में की गई है। हालांकि, उच्च यूकैरियोट में, कोई असाइन किए गए कार्यों के साथ snoRNA के संभावित सैकड़ों रहे हैं और उनमें से कुछ कई RNAs1,4,5,6,7पहचान सकते हैं . इसलिए, तरीकों जो पहचान और snoRNA निर्देशित संशोधनों के विश्लेषण के लिए अनुमति सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित तंत्र को उजागर करने में महत्वपूर्ण उपकरण हैं.

एक बॉक्स C/D snoRNA निर्देशित putative 2'-O-मेथिलेशन साइट bioinformatically पहचान की जा सकती है और कई तकनीकों द्वारा प्रयोगात्मक पुष्टि की, RNase एच निर्देशित दरार, या साइट विशेष और जीनोम व्यापक तरीकों सहित, जो रिवर्स प्रतिलेखन को रोजगार कम न्यूक्लिओटाइड (डीएनटीपी) संकेंद्रण में8,9,10,11. इन तकनीकों को बहुत संवेदनशील हैं, लेकिन यह भी कठिन और महंगा है, इसलिए, प्रारंभिक या त्वरित परीक्षण के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है. 2'-ओ-मेथिलेशन साइटों की पहचान करने के लिए सबसे सरल और कम लागत वाले तरीकों में से एक DNAzyme-निर्भर आरएनए क्लीवेज12है। DNAzymes छोटे, एकल फैला हुआ है और उत्प्रेरक सक्रिय डीएनए अणुओं विशिष्ट पदों पर आरएनए के endonucleolytic दरार करने में सक्षम हैं. इनमें एक संरक्षित और उत्प्रेरक रूप से सक्रिय कोर अनुक्रम और 5' और 3' बाध्यकारी आर्म ्स शामिल हैं जो वाणस-क्रिक बेस द्वारा आरएनए लक्ष्य (चित्र 1)के लिए हाइब्रिड बनाने के लिए डिज़ाइन किए गए चर अनुक्रमों से बने हैं। इस प्रकार, 5' और 3' हथियार विशिष्ट आरएनए साइट के लिए उत्प्रेरक अनुक्रम उद्धार. DNAzyme-निर्भर दरार दरार साइट12,13के सीधे ऊपर तैनात न्यूक्लिओटाइड के 2'-O-मिथाइलेशन द्वारा बाधित है। यह putative या ज्ञात आरएनए 2'-O-मेथिलेशन साइटों के विश्लेषण के लिए DNAzymes बहुत व्यावहारिक उपकरण बनाता है.

आरएनए संशोधनों के विश्लेषण12के लिए दो प्रकार के DNAzymes का उपयोग किया जाता है। 10-23 DNAzyme के सक्रिय अनुक्रम (चित्र 1A) 15 न्यूक्लिओटाइड (5'RGGCTAGCTACAACGA3') जो लक्षित आरएनए प्यूरीन-पाइरीमिडीन (आरवाई) dinucleotide के आसपास एक पाश फार्म और इन दो न्यूक्लिओटाइट्स के बीच दरार उत्प्रेरित होते हैं। आरएनए प्यूरीन (आर) DNAzyme के साथ आधार-युग्मित नहीं है और DNAzyme पर 2'-O-मिथाइलेशन प्रस्तुत करता है क्लीवेज को रोकता है। 10-23 DNAzymes के बाध्यकारी हथियार आमतौर पर 10-15 न्यूक्लिओटाइड लंबे होते हैं। द्वितीय DNAzyme वर्ग, 8-17 DNAzymes (चित्र 1B) 14-न्यूक्लिओटाइड उत्प्रेरक अनुक्रम (5'TCCGAGCCGA3') होते हैं। न्यूक्लिओटाइड्स सी2, सी3 और जी4 जोड़ी के साथ सी9 जी10 और जी11 एक छोटी स्टेम-लूप संरचना का निर्माण। 8-17 DNAzymes किसी भी guanine कि अपूर्ण रूप से DNAzyme सक्रिय अनुक्रम से पहले थाइमीन के साथ जोड़ा जाता है के आरएनए को छोड़ दें। ग्वानीन के ऊपर आरएनए न्यूक्लिओटाइड DNAzyme के साथ आधार-युग्मित नहीं है और इसके 2'-O-मिथाइलेशन दरार को ख़राब कर देता है। 8-17 DNAzymes अपने विशिष्ट अनुक्रम के लिए DNAzyme निर्देशित करने के लिए लगभग 20 न्यूक्लिओटाइड के लंबे समय तक होमोलोजी हथियारों की आवश्यकता होती है।

यहाँ, हम 10-23 और 8-17 DNAzyme-निर्भर दृष्टिकोण12,13 (चित्र 1C) का उपयोग कर Saccharomyces सेरेविएसिया ई में Rनए के 2'-O-मेथिलेशन के विश्लेषण के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य जीवों और आरएनए प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और साइट-विशिष्ट आरएनए 2'-ओ-मेथिलेशन के तेजी से, प्रारंभिक या प्रमुख विश्लेषण के लिए नियोजित किया जा सकता है।

Protocol

1. तनाव, मीडिया, और बफर व्यंजनों

  1. खमीर तैयार करें (एस cerevisiae) मीडिया के रूप में यहाँ विस्तृत: YP (1% w/v खमीर निकालने, 2% w/v बैक्टीरियोलॉजिकल पेपटोन), और ग्लूकोज और गैलेक्टोज स्टॉक पर 20% w/
  2. सोडियम एसीटेट (NaAc)-EDTA (एई) बफर के रूप में यहाँ विस्तृत तैयार करें: 50 m NaAc पीएच 5.3 और 10 m EDTA.
  3. 10-23 DNAzyme 4x इनक्यूबेशन बफर के रूप में यहाँ विस्तृत तैयार करें: 24 एमएम Tris पीएच 8.0, 60 एम NaCl और 10-23 DNAzyme 4x प्रतिक्रिया बफर: 200 m M Tris पीएच 8.0 और 600 एम एम NaCl.
  4. तैयार 8-17 DNAzyme 2x प्रतिक्रिया बफर के रूप में विस्तृत यहाँ: 200 एम एम KCl, 800 मीटर NaCl, 100 m HEPES pH 7.0, 15 m M MgCl2, और 15 m MnCl2.
  5. यहाँ विस्तृत के रूप में 10x MOPS बफर तैयार करें: 200 एमएम MOPS, 50 m NaAc, 1 एमएम EDTA; पीएच 7.0 और 1.5x नमूना Denaturing बफर: 50% v/v formamide, 20% v/v formaldehyde, 1.5x MOPS बफर.
  6. प्राप्त एस सेरेविसी उपभेदों, BY4741(MATa उसके 3 ]1 leu2]0 met15 [0 ura3]0); GAL1::SNR13 (के रूप में BY4741 लेकिन GAL1::SNR13:KANmX); GAL1::SNR47 (के रूप में BY4741 लेकिन GAL1::SNR47:HIS3mX| किसी भी अन्य खमीर तनाव इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

2. DNAzyme डिजाइन

  1. एक उपयुक्त डेटाबेस का उपयोग कर ब्याज या putative मिथाइलेशन साइट के आरएनए अनुक्रम का पता लगाएं। एस cerevisiae snoRNA लक्ष्य के लिए, खमीर snoRNA डेटाबेस का उपयोग करें: http://people.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14
  2. ब्याज के मिथाइलेशन साइट को खोजने के लिए, उदा., snR13-निर्भर साइट, "snR13" का चयन करें और संशोधित न्यूक्लिओटाइड की स्थिति का एक नोट करें (उदा., snR13-निर्देशित A2281 में 25S rRNA).
  3. उपयुक्त डेटाबेस का उपयोग करके संशोधित न्यूक्लिओटाइड के ऊपर और नीचे के दृश्यों का पता लगाएं। एस सेरेविएसियाई के लिए, Saccharomyces जीनोम डाटाबेस का उपयोग करें: https://www.yeastgenome.org/
  4. लक्ष्य जीन नाम के लिए खोज उदाहरण के लिए, RDN25 (कोडिंग 25S rRNA).
  5. "क्रम" टैब से, 10-15 न्यूक्लिओटाइड्स अपस्ट्रीम (5' हाथ) और मिथाइलेशन साइट के डाउनस्ट्रीम (3 'आर्म) का उपयोग करते समय 10-23 DNAzyme परख और 20 न्यूक्लिओटाइड अपस्ट्रीम (5' आर्म) और डाउनस्ट्रीम (3'आर्म) के लिए मिथाइलेशन साइट के 8-17 DNAme का उपयोग करते हैं।
  6. 5' और 3' हथियारों के पूरक दृश्यों बनाएँ.
  7. Flank 10-23 या 8-17 DNAzyme उत्प्रेरक अनुक्रम 5' और 3' हथियारों के पूरक दृश्यों के साथ.
  8. आदेश DNAzyme आपूर्तिकर्ता से एक सामान्य डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के रूप में।

3. एस सेरेविएसिया विकास की स्थिति

नोट: एस cerevisiae BY4741 तनाव डेरिवेटिव इस्तेमाल किया गया, जिसमें या तो SNR13 या SNR47 snoRNA की अभिव्यक्ति induible GAL1 प्रमोटर से प्रेरित है. प्रेरित करने के लिए या उनके संश्लेषण को बाधित करने के लिए, galactose युक्त मध्यम पर कोशिकाओं को विकसित(GAL1पर निर्भर प्रतिलेखन) या ग्लूकोज (GAL1-निर्भर प्रतिलेखन बंद). एक नियंत्रण के रूप में, जंगली प्रकार तनाव का उपयोग करें (BY4741) या तो गैलाक्टोज या ग्लूकोज पर हो.

  1. एक उपयुक्त मध्यम और परिस्थितियों में खमीर उपभेदों हो जाना. GAL1 का विश्लेषण करने के लिए::SNR13 और GAL1::SNR47 उपभेदों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से isogenic जंगली प्रकार तनाव, या तो 2% ग्लूकोज (YPD) या गैलाक्टोज (YPGal) के साथ YP मीडिया के 50 एमएल में कोशिकाओं को बढ़ने के मध्य घातीय चरण के लिए 30 डिग्री सेल्सियस.
  2. 1,000 x ग्रामपर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं , 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए।
  3. महादलित को त्यागें और छर्रों रखें।
  4. तरल नाइट्रोजन में कोशिका छर्रों को फ्रीज करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    चेतावनी: तरल नाइट्रोजन गंभीर क्रायोजेनिक जलने का कारण बन सकता है। हमेशा सुरक्षात्मक कपड़े पहनते हैं और सुरक्षा सावधानियों का प्रयोग करते हैं।
    नोट: सेल छर्रों को 1 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है यदि आवश्यक हो.

4. आरएनए अलगाव15

नोट: आरएनए को अलग करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि का उपयोग करें। खमीर एस cerevisiaeके लिए, गर्म-फीनल आरएनए निष्कर्षण इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. बर्फ ठंडा पानी के 1 एमएल जोड़ें, छर्रों को फिर से निलंबित और 1.5 एमएल microtubes के लिए resuspended कोशिकाओं हस्तांतरण.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 s के लिए 20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant हटा दें।
  3. एई बफर के 400 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    नोट: चरण 4-4.15 कमरे के तापमान पर तब तक निष्पादित किए जाते हैं जब तक अन्यथा न कहा गया हो।
  4. 10% एसडीएस के 40 डिग्री एल और एसिड फीनॉल (पीएच 4.5) के 400 डिग्री एल जोड़ें।
    चेतावनी: Phenol विषाक्त है और एक धूआं हुड के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए. हमेशा एक प्रयोगशाला कोट पहनते हैं, सुरक्षात्मक दस्ताने, और चश्मा जब फिनोल के साथ काम कर रहे. संस्थागत विनियमों के अनुसार अपशिष्ट का निपटान।
  5. 20 s के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
  6. 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। हर 2 मिनट, धीरे खोलने के लिए और दबाव जारी है और चरणों मिश्रण करने के लिए 2-3 बार ट्यूब फ्लिप करने के लिए ट्यूब बंद करें।
  7. -80 डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए ट्यूबों स्थानांतरण।
  8. बेंच पर ट्यूबों को defrost और 20,000 x gपर अपकेंद्रित्र, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए.
  9. ऊपरी चरण को 400 डिग्री सेल्सियस अम्ल फीनॉल युक्त एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें:क्लोरोफॉर्म:आइसोमिल अल्कोहल (25:24:1)। अंतर-चरण को बाधित न करें।
    चेतावनी: क्लोरोफॉर्म विषाक्त है और एक धूआं हुड के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए। क्लोरोफॉर्म के साथ काम करते समय हमेशा एक प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक दस्ताने, और चश्मा पहनते हैं। संस्थागत विनियमों के अनुसार अपशिष्ट का निपटान।
  10. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर 30 s और अपकेंद्रित्र के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  11. ऊपरी चरण ($400 डिग्री एल) को 400 डिग्री एल क्लोरोफॉर्म युक्त एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  12. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर 30 s और अपकेंद्रित्र के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  13. ऊपरी चरण ($300-350 जेडएल) को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल एटोएच और 7.5 एम अमोनियम एसीटेट (एनएच4एसी) का 40 एमएल है। ट्यूब flipping द्वारा मिश्रण कई बार.
  14. -80 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच या रात -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: प्रक्रिया यहाँ रोका जा सकता है.
  15. 20,000 x gपर सेंट्रीफ्यूज , 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए। एक छोटा सा, सफेद आरएनए गोली ट्यूब के तल पर दिखाई देगा.
  16. गोली परेशान करने से बचने के लिए पाइपिंग द्वारा EtOH निकालें.
  17. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर 70% EtOH और अपकेंद्रित्र का 1 एमएल जोड़ें।
  18. पाइपिंग द्वारा 70% EtOH निकालें।
  19. 15 s के लिए 20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज और 2-20 डिग्री एल पिपेट के साथ शेष EtOH हटा दें।
  20. आरएनए गोली सुखाने के लिए 5 मिनट के लिए बेंच पर ट्यूब खुला छोड़ दें।
    नोट: आरएनए गोली सफेद से पारदर्शी करने के लिए जब सूखी अपने रंग बदल जाता है।
  21. RNase/DNase-मुक्त H2O के 30 डिग्रीएल में आरएनए गोली को पुन: निलंबित करें, ट्यूब को बर्फ पर तुरंत स्थानांतरित करें और माइक्रोस्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर आरएनए सांद्रता को मापें।
  22. -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को फ्रीज करें।
    नोट: आरएनए को 1 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस और 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। प्रक्रिया यहाँ रोका जा सकता है या सीधे अगले चरण के लिए आगे बढ़ना.

5. DNAzyme पाचन

  1. 10-23 DNAzyme पाचन
    1. 1.5 एमएल ट्यूबमें आरएनए के 5 डिग्री ग्राम, 10-23 DNAzyme के 200 pmol (2 $L 100 एमएम स्टॉक समाधान) और 4x 10-23 इनक्यूबेशन बफर की कुल मात्रा में 10 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा में ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    2. ट्यूबों को 95 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक शुष्क ऊष्मा ब्लॉक में स्थानांतरित करें और 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. ट्यूबों को तुरंत बर्फ पर स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. संक्षेप में नीचे स्पिन और बर्फ पर वापस ट्यूब डाल दिया.
    5. RNase अवरोध करनेवाला के 20 यू जोड़ें (उदा., 0.5 $L RiboLock RNase अवरोध करनेवाला).
    6. 25 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक सूखी गर्मी ब्लॉक में ट्यूब प्लेस और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    7. इस बीच, एक प्रतिक्रिया मिश्रण को 1.5 डिग्री एल ट्यूब में 4x 10-23 रिएक्शन बफर के 5 डिग्री एल को 300 उम् ब्ब्क्2 के 4 डिग्री सेल्सियसके साथ मिलाकर तथा 1 ख्ब् ब्2व् ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट किए गए शुष्क ब्लॉक में रखें।
    8. ऊष्मायन मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट किए गए शुष्क ऊष्मायन ब्लॉक में स्थानांतरित करें और प्री-वार्म्ड अभिक्रिया मिश्रण के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    9. 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    10. बर्फ पर ट्यूब स्थानांतरण और 5.3.1 कदम पर आगे बढ़ना.
  2. 8-17 DNAzyme पाचन
    1. 6 डिग्री सेल्सियस की कुल आयतन में आरएनए के 5 डिग्री ग्राम के साथ 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब तैयार कीजिए। ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    2. 8-17 DNAzyme (4 $ 100 मीटर स्टॉक से बाहर 400 pmol के साथ एक 1.5 एमएल microtube तैयार). ट्यूब बर्फ पर रखें.
    3. ट्यूबों को 95 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट किए गए शुष्क ऊष्मा ब्लॉक में स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. बर्फ पर आरएनए नमूना ले जाएँ.
    5. 5 s के लिए DNAzyme के साथ ट्यूब नीचे स्पिन और 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    6. उसी समय, 2x 8-17 रिएक्शन बफर के 10 डिग्री एल के साथ 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें और 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    7. DNAzyme के साथ ट्यूब के लिए पूर्व-वार्म्ड 2x रिएक्शन बफर के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़कर एक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें।
    8. RNA के साथ ट्यूब के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के 14 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण और RNase अवरोध करनेवाला के 20 उ जोड़ें.
    9. 2 ज के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    10. ट्यूब को बर्फ पर स्थानांतरित करें और आरएनए शोधन (चरण 5.3.1) पर आगे बढ़ें।
  3. आरएनए शोधन
    1. 350 डिग्री सेल्सियस जल और 400 डिग्री सेल्सियस क्लोरोफॉर्म को प्रतिक्रिया नली में मिलाकर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 30 s और अपकेंद्रण के लिए भ्रमिल करके अच्छी तरह मिला लें।
    2. ऊपरी चरण ($300-350 जेडएल) को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल एटीओएच, 7.5 एम एनएच4एसी का 40 डिग्री एल और ग्लाइकोजन का 1 डिग्री एल (10 ग्राम/ ट्यूब flipping द्वारा मिश्रण कई बार.
    3. -80 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच या रात -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      नोट: प्रक्रिया यहाँ रोका जा सकता है.
    4. 4.15 से 4.21 तक चरणों को दोहराएँ.
    5. आर.एन.ए.एस.ई./DNase-मुक्त H2O के 10 डिग्री एल में आरएनए गोली को पुन: स्थापित करें तथा ट्यूबों को तुरंत बर्फ पर स्थानांतरित कर दें।
    6. -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को फ्रीज करें।
      नोट: आरएनए को एक महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस और 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। प्रक्रिया यहाँ रोका जा सकता है या आरएनए इलेक्ट्रोफोरोसिस के लिए आगे बढ़ना.

6. आरएनए इलेक्ट्रोफोरोसिस

  1. इलेक्ट्रोफोरोसिस उपकरण (टैंक, ट्रे, कंघी) को 1% एसडीएस के साथ स्प्रे करें, 15 मिनट के लिए छोड़ दें और डीडीएच2ओ के बहुत सारे के साथ कुल्ला करें।
  2. 127.5 एमएल डीएच2ओ में 1.5 ग्राम अगोरो को माइक्रोवेव में गर्म करके घोल लें।
  3. 10x MOPS के 15 एमएल और 37% formaldehyde के 7.5 एमएल agarose समाधान करने के लिए जोड़ें (कुल मात्रा 150 एमएल है).
    चेतावनी: Formaldehyde विषाक्त है और एक धूआं हुड के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए. हमेशा एक प्रयोगशाला कोट पहनते हैं, सुरक्षात्मक दस्ताने, और चश्मा जब formaldehyde के साथ काम कर रहे. संस्थागत विनियमों के अनुसार अपशिष्ट का निपटान।
  4. agarose समाधान करने के लिए पसंद की एक जेल दाग की एक उचित राशि जोड़ें (उदा., SYBR सुरक्षित डीएनए जेल दाग के 15 डिग्री एल). अच्छी तरह से मिलाएं और ट्रे में agarose डालना.
  5. जेल में तुरंत एक कंघी डालें।
  6. धूआं हुड के तहत 45 मिनट के लिए छोड़ दें। एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील जेल दाग का उपयोग करते समय एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्रे कवर.
  7. 1x MOPS बफर के 600 एमएल तैयार करें.
  8. आरएनए नमूना तैयारी
    1. 1.5 एमएल ट्यूब में, पचाए गए और शुद्ध आरएनए नमूने के 10 डिग्री सेल्सियस, नमूना डेनिंग बफर के 5 डिग्री एल और 6x लोडिंग डाई के 0.5 डिग्री एल को संयोजित करें।
      चेतावनी: Formamide विषाक्त है और एक धूआं हुड के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए. हमेशा एक प्रयोगशाला कोट पहनते हैं, सुरक्षात्मक दस्ताने, और चश्मा जब formamide के साथ काम कर रहे. संस्थागत विनियमों के अनुसार अपशिष्ट का निपटान।
    2. 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट आरएनए नमूने बर्फ पर नमूने स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    3. जेल पर लोड करने से पहले संक्षेप में स्पिन करें।
  9. इलेक्ट्रोफोरोसिस टैंक में जेल रखो और 1x MOPS बफर के साथ भरें। जेल पर प्रत्येक नमूने (15 जेडएल) की पूरी मात्रा लोड करें। 80 V पर चलाएँ जब तक ब्रोमोफीनॉल नीला जेल लंबाई के 2/
  10. चुने गए जेल दाग (उदा., यूवी ट्रांसलियुमिनेटर) का पता लगाने के लिए उपयुक्त एक इमेजर का उपयोग करके जेल को छवि करें।

Representative Results

RNA संशोधनों के विश्लेषण में DNAzyme-निर्भर दरार की उपयोगिता हाल ही में snoRNAs परिपक्वता13के संदर्भ में दिखाया गया है. DNAzyme-निर्भर परख को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि 5'end पूर्व snoRNA प्रसंस्करण की कमी को प्रभावित करता है 2'-O-मेथिलस्तर स्तर 25S और 18S rRNA में S. cerevisiae13.

यहाँ, हम एक inducible snoRNA प्रतिलेखन प्रणाली का इस्तेमाल किया प्रभावशीलता और तकनीक की सादगी का प्रदर्शन. बॉक्स C/D snR13 25S rRNA में दो पदों पर मेथिलेशन का मार्गदर्शन करता है, जिसमें एडेनिन 2281 (चित्र 2क) शामिल हैं। इस न्यूक्लिओटाइड के बाद यूरेसिल है, जो एक 10-23 DNAzyme द्वारा आम सहमति dinucleotide (आरवाई) cleavable का गठन किया है. बॉक्स ब्/डी स्नआर47 25S rRNA में दो न्यूक्लिओटाइडों के मेथिलेशन का मार्गदर्शन भी करता है (चित्र 2ख) । स्थिति 2220 में adenine एक guanine अवशेषों के बाद है और इस dinucleotide एक 8-17 DNAzyme द्वारा cleaved किया जा सकता है. या तो snR13 या snR47 snoRNA के संश्लेषण को प्रेरित या बाधित करने के लिए, हम या तो SNR13 या SNR47 जीनऔर खेती की कोशिकाओं के instreamed inducable GAL13 - निर्भर पर प्रतिलेखन) या ग्लूकोज(GAL1- निर्भर प्रतिलेखन बंद). अगला, जीएनए से अलग::SNR13 कोशिकाओं को 10-23 DNAzyme के साथ इनक्यूबेट किया गया था जिसे एनएनआर13-निर्भर स्थल पर 25S RRNA को छोड़ने के लिए डिज़ाइन किया गया था, न्यूक्लिओटाइड 2281 और 2282 के बीच में (चित्र 2C)। आरएनए GAL1 से::: SNR47 तनाव न्यूक्लिओटाइड 2220 और 2221 के बीच में 8-17 DNAzyme लक्ष्यीकरण snR47-निर्भर साइट के साथ इलाज किया गया था 2220 और 2221 (चित्र 2D) . एक नियंत्रण के रूप में, जंगली प्रकार BY4741 तनाव से आरएनए या तो गैलिक्टोज या ग्लूकोज पर बढ़ रहा है दोनों DNAzymes के साथ incubated था. DNAzyme-उपचारित आरएनए के इलेक्ट्रोफोरोसिस से पता चला कि GAL1 से निकाले गए 25S RRNA:SNR13 और GAL1::SNR47 तनाव गैलेक्टोस पर बढ़ रहा है (GAL) बरकरार रहा (चित्र 3A,बी; गलियों 3). इसके विपरीत, आरएनए GAL1 से अलग::SNR13 और GAL1::SNR47 कोशिकाओं ग्लूकोज पर बढ़ रहा है (GLC) संबंधित DNAzymes द्वारा पचा गया था (चित्र 3A,B; गलियों 4). दोनों ही मामलों में, 25S rRNA बैंड में कमी आई और 5' और 3' कट-ऑफ क्लीवेज उत्पाद (ए और बी) देखे गए। यह इंगित करता है कि GAL1::SNR13 और GAL1::SNR47 उपभेदों, 25S rRNA था 2'-O-methylated पर snR13- या snR47 निर्देशित साइटों जब galactose एक कार्बन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया था और इन snoRNA व्यक्त किए गए. 25S rRNA मिथाइलेशन की कमी जब snR13 या snR47 अभिव्यक्ति DNAzyme पर निर्भर दरार के लिए अनुमति दी ग्लूकोज पर बंद कर दिया गया था. जंगली प्रकार के नमूनों के लिए कोई आरएनए पाचन नहीं देखा गया(चित्र 3क,बी; लेन 1 और 2), के रूप में snR13 और snR47 की अभिव्यक्ति इस तनाव में गैलाक््टोस / इसलिए, rRNA सामान्य रूप से methylated और इतना DNAzymes गतिविधि के लिए प्रतिरोधी था.

कुल मिलाकर, हमारे प्रयोग से पता चलता है कि 10-23 के दरार गतिविधि (चित्र 3ए) और 8-17 (चित्र 3ख) DNAzymes बॉक्स C/D snR13 या snR47 की अनुपस्थिति के साथ सहसंबद्ध, स्पष्ट रूप से संकेत मिलता है कि इन snoRNA के लिए जिम्मेदार हैं 25S rRNA 2'-ओ-मेथिलेशन विशेष स्थलों पर।

Figure 1
चित्र 1: DNAzymes और उनके आरएनए substrates. (ए) 10-23 DNAzymes एक प्यूरीन-पाइरीमिडीन (आरवाई) आरएनए dinucleotide छोड़ दें। आरएनए में DNAzyme के साथ नहीं बनती है, जबकि Y DNAzyme में R आधार के पूरक है. आरएनए में प्यूरीन (आर) का मेथिलेशन DNAzyme-निर्भर दरार को दबाता है। (बी) 8-17 DNAzymes cleave RNA upstream of guanine कि अपूर्ण रूप से DNAzyme उत्प्रेरक अनुक्रम में पहली थाइमीन के साथ युग्मित है. न्यूक्लिओटाइड पूर्ववर्ती ग्वानीन युग्मित नहीं होता है और इसका मिथाइलेशन DNAzyme-निर्भर क्लीवेज से बचाता है। आरएनए ग्रे में दिखाया गया है (मेथिलेशन साइट के अलावा), DNAzyme बैंगनी में दिखाया गया है. छ किसी भी न्यूक्लिओटाइड, आर जेड प्यूरीन: एडेनिन या ग्वानीन, वाई - पाइरिमिडीन: साइटोसाइन या यूरेसिल; CH3- आरएनए मिथाइलेशन को दर्शाता है। DNAzyme सक्रिय अनुक्रम के भीतर बेस युग्मन डॉटेड लाइनों द्वारा चिह्नित किया गया है। एक नीली बिजली बोल्ट क्लीवेज साइट को चिह्नित करता है। (ग)एक प्रवाहचार्ट जो एक DNAzyme-निर्भर विश्लेषण के चरणों को दर्शाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: DNAzymes snR13- और snR47 पर निर्भर मिथाइलसाइट साइटों को लक्षित 25S rRNA में. (ए, बी) ब्राउज़र स्क्रीनशॉट दिखा snR13-निर्भर (ए) और snR47-निर्भर (बी) 25S rRNA में मिथाइलसाइट साइटों (सी) 25S rRNA अनुक्रम snR13-निर्भर मिथाइलेशन साइट (A2281)और 10-23 DNAzyme (पर्पल में दिखाया गया है) आरएनए को2281 और यू2282के बीच छोड़ने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक2281 DNAzyme के साथ युग्मित नहीं है, जबकि U2282 DNAzyme सक्रिय अनुक्रम (एक नीली रेखा द्वारा चिह्नित) से पहले न्यूक्लिओटाइड के साथ एक जोड़ी रूपों. एक नीली बिजली बोल्ट दरार के निशान. (डी) 25S आरआरएनए अनुक्रम एसएनआर47-निर्भर मिथाइलेशन साइट (ए2220) और 8-17 DNAzyme (पर्पल में दिखाया गया है) के आसपास के आरएनए अनुक्रम ए2220 और जी2221के बीच आरएनए को छोड़ने के लिए डिज़ाइन किया गया है । एक2220 DNAzyme के साथ संकरित नहीं है, जबकि जी2221 अपूर्ण थाइमीन के साथ जोड़ा जाता है (एक डैश्ड लाइन के साथ नोट किया गया). एक नीली बिजली बोल्ट क्लीवेज साइट को चिह्नित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: 10-23 और 8-17 DNAzyme-निर्भर परख का उपयोग कर 25S rRNA के साइट-विशिष्ट 2'-O-मेथिलेशन का विश्लेषण। (ए) 10-23 DNAzyme का उपयोग करs snR13-निर्भर 25S rRNA मिथाइलेशन का विश्लेषण। (ठ) 8-17 DNAzyme का उपयोग करs snR47-निर्भर 25S rRNA मिथाइलेशन का विश्लेषण। आरएनए एक denaturing agarose जेल में धुंधला कल्पना की गई थी. Cleavage उत्पादों A और B लाल तीरों द्वारा चिह्नित हैं. WT - जंगली प्रकार तनाव; GAL ] गैलाक्टोस, जीएलसी - ग्लूकोज। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

DNAzyme-निर्भर पाचन साइट-विशिष्ट आरएनए 2'-ओ-मेथिलेशन12,13का विश्लेषण करने के लिए एक सरल और त्वरित विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि क्लीवेज साइट के न्यूक्लिओटाइड अपस्ट्रीम को मेथिलेट नहीं किया जाता है तो डीएनएजाइजीज़ क्लीव आरएनए। RNase एच निर्देशित पाचन सहित अन्य दृष्टिकोण के विपरीत, क्षारीय गिरावट या कम न्यूक्लिओटाइड एकाग्रता में रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पीसीआर या अनुक्रमण8,10,11 के बाद ,16, DNAzyme दृष्टिकोण एक साधारण डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड और बुनियादी अभिकर्मकों कि किसी भी आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में मौजूद हैं की आवश्यकता है. इसके अलावा, DNAzymes एक समान तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है आरएनए pseudouridylation बॉक्स H/ACA snoRNA12द्वारा मध्यस्थता का विश्लेषण करने के लिए, जो उन्हें snoRNA लक्ष्यों का अध्ययन करने में बहुमुखी उपकरण बनाता है.

DNAzyme-निर्भर दृष्टिकोण केवल दरार साइट आम सहमति दृश्यों17द्वारा सीमित कर रहे हैं. 10-23 DNAzymes केवल RY dinucleotide की स्थिति आर पर 2'-O-methylation का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि 8-17 DNAzymes ग्वानी नली के ऊपर स्थित न्यूक्लिओटाइड के संशोधन को पहचान. नतीजतन, dinucleotides ग्वानीन-एडेनिन (जीए), एडेनिन-एडेनीन (एए), पाइरिमिडीन-एडेनीन (वाईए) और पाइरिमिडीन-पिरिमिडीन (वाईवाई) में पहले न्यूक्लिओटाइड के 2'-ओ-मेथिलेशन जैसे संशोधनों का विश्लेषण नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, DNAzyme पर निर्भर दरार12 की कम दक्षता पर विचार किया जाना चाहिए. यद्यपि कुछ DNAzymes cleave RNA लगभग पूरी तरह से (चित्र 3B) कई DNAzymes केवल आंशिक रूप से अपने लक्ष्य ों को पचाने (चित्र 3ख) . दक्षता दरार साइट के आसपास के अनुक्रम पर निर्भर हो सकता है. उदाहरण के लिए, एक ही न्यूक्लिओटाइड के खंडों वाले आरएनए क्षेत्र DNAzyme सक्रिय अनुक्रम की सही स्थिति को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, आरएनए क्षेत्रों मजबूत माध्यमिक संरचना बनाने फिर से संकर ासाकीना और लक्ष्य अनुक्रम के लिए DNAzyme बाइंडिंग को दबा सकते हैं. इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए, 10-23 DNAzyme और उसके आरएनए सब्सट्रेट के हीटिंग और ठंडा करने के चक्र18लागू किया जा सकता है।

हम DNAzyme दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया जांच करने के लिए 2'-O-methylation के RNA. कोई भी इस तकनीक का उपयोग अन्य आरएनए संशोधनों का विश्लेषण करने के लिए भी कर सकता है, जैसे N6-मेथिलडेनोसाइन19. रिबोसोमल आरएनए, इसकी बहुतायत के कारण, इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है और क्लीवेज उत्पादों को यूवी प्रकाश के तहत कल्पना की जा सकती है। तथापि, यह आरएनए पॉलिमरेज II-जनरेट किए गए कोडिंग आरएनए (एमआरएनए) और गैर-कोडिंग आरएनए (एनएनआरएनए) जैसे कम प्रचुर मात्रा में आरएनए के लिए लागू नहीं है। इन आरएनए आमतौर पर agarose या polyacrylamide जैल में आरएनए धुंधला द्वारा सीधे पता नहीं किया जा सकता है. ऐसे मामलों में, DNAzyme-निर्भर दरार उत्तरी blotting द्वारा कल्पना की जा सकती है, परोक्ष रूप से पीसीआर द्वारा पता लगाया / मात्रात्मक पीसीआर द्वारा polymerases के साथ विश्लेषण (जैसे, KlenTak डीएनए पॉलिमरेज) 2 से भेदभाव करने में सक्षम-O-मिथाइल आरएनए अमेथिलित आरएनए20,21.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए माया विल्सन और Aneika Leney धन्यवाद. इस काम को वेलकम ट्रस्ट और रॉयल सोसायटी द्वारा संयुक्त रूप से वित्त पोषित एक सर हेनरी डेल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था (200473/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acid phenol SIGMA P4682
Agarose VWR A2114
Ammonium acetate SIGMA A1542
Chlorophorm Fisher scientific 10293850
DNase/RNase free water Fischer Scientific 10526945
DNAzyme Integrated DNA Technology Custom oligo DNA
EDTA SIGMA E9884
Ethanol Absolute Fisher scientific 10437341
Formaldehyde Sigma F8775
Formamide sigma F9037
Galactose SIGMA G0750
Gel Loading Dye Thermo Fisher Scientific R0611
Glucose SIGMA G7021
Glycogen Thermo Fisher Scientific R0561
HEPES SIGMA H3375
Isoamyl SIGMA W205702
KCl SIGMA P9333
MgCl2 SIGMA M8266
MnCl2 SIGMA 244589
MOPS SIGMA M1254
NaCl SIGMA S7653
Oxoid Peptone Bacteriological Thermo Fisher Scientific LP0037
Oxoid Yeast Extract Powder Thermo Fisher Scientific LP0021
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) Thermo Fisher Scientific EO0382
SDS SIGMA 74255
Sodium acetate trihydrate SIGMA S8625
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
Tris base SIGMA TRIS-RO
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
1.5 mL microtubes Sarstedt
152VR5C01M -80°C freezer Thermo Fisher Scientific
250 mL Erlenmeyer flasks Cole-Parmer
50 mL conical tubes Sarstedt
Combicup VX200 vortex Appleton Woods
DS-11 microspectrophotometer Denovix
Electrophoresis chamber (20 cm tray) SIGMA
FiveEasy F20 pH meter Appleton Woods
Gel documentation system Syngene
Heraeus Fresco 21 micro centrifuge Fisher Scientific
Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes Fisher Scientific
Mini Fuge Plus mini centrifuge Starlab
Mixer HC thermal block Starlab
OLS26 Shaking Water Bath Grant
PowerPac power supplier BioRad

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 151 आरएनए संशोधन 2'-ओ-मेथिलेशन आरआरएनए DNAzyme snoRNA आरएनए विश्लेषण
RNA 2'-O-मेथिलेशन का DNAzyme-निर्भर विश्लेषण
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Winczura, K., Grzechnik, P. DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2’-O-Methylation. J. Vis. Exp. (151), e59700, doi:10.3791/59700 (2019).

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