Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

DNAzyme-avhengig analyse av rRNA 2 '-O-metylering

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59700
Automatic Translation
1, 1
1School of Biosciences, University of Birmingham

Summary

Her presenterer vi en protokoll for DNAzyme-avhengig kløft av RNA. Dette muliggjør rask og nettsteds avhengig analyse av RNA 2 '-O-metylering. Denne tilnærmingen kan brukes for den foreløpige eller større vurderingen av snoRNA aktivitet.

Abstract

Guide boks C/D liten nucleolar RNAs (snoRNAs) katalysere 2 '-O-metylering av ribosomal og små kjernefysiske RNA. Et stort antall snoRNA i høyere Landplantenes kan imidlertid promiscuously gjenkjenne andre RNA-arter og 2 '-O-methylate flere mål. Her gir vi steg-for-steg guide for rask og ikke-kostbar analyse av de områdespesifikke 2 '-O-metylering ved hjelp av en veletablert metode ansette kort DNA oligonukleotider kalt DNAzymes. Disse DNA-fragmentene inneholder katalysator som Cleave RNA på bestemte konsensus posisjoner, samt variable homologi armer regissere DNAzyme til sine RNA mål. DNAzyme aktivitet er hemmet av 2-' O-metylering av nukleotid ved siden av kløften i RNA. Således, DNAzymes, begrenset bare av konsensus av kløyvde sekvensen, er perfekte verktøy for rask analyse av snoRNA-mediert RNA 2 '-O-metylering. Vi analyserte snoRNA snR13-og snR47 2 '-O-metylering av 25S ribosomal RNA i Saccharomyces cerevisiae for å demonstrere enkelheten i teknikken og for å gi en detaljert protokoll for DNAzyme-avhengige analysen.

Introduction

RNA modifikasjoner spiller en viktig rolle i regulering av genuttrykk. RNA 2 '-O-metylering og pseudouridylation, som styres av boks C/D og boks H/ACA Small nucleolar RNAs (snoRNAs) henholdsvis, beskytter RNA fra fornedrelse og stabiliserer deres høyere-Order strukturer1,2,3 . SnoRNA mål har blitt identifisert hovedsakelig i ribosomal RNAs (rRNA) og små kjernefysiske RNAs (snRNAs). Imidlertid, inne høyere Landplantenes, der er muligheter flere hundre av snoRNA med nei bestemt funksjonene og noen av seg kanskje anerkjenne mangfoldig RNAs1,4,5,6,7. Derfor metoder som tillater identifisering og analyse av snoRNA-guidede modifikasjoner er viktige verktøy i å avdekke mekanismer som regulerer cellulære prosesser.

En boks C/D snoRNA-guidet antatte 2 '-O-metylering området kan identifiseres bioinformatically og bekreftet eksperimentelt av mange teknikker, inkludert RNase H-regissert kløft, eller område-spesifikke og Genova-brede metoder, som benytter omvendt transkripsjon i lav nukleotider (dNTPs) konsentrasjon tilnærming8,9,10,11. Disse teknikkene er svært følsomme, men også arbeidskrevende og kostbart, derfor kan ikke være egnet for den innledende eller rask testing. En av de enkleste og rimelige metoder for å identifisere 2 '-O-metylering nettsteder er DNAzyme-avhengig RNA kløft12. DNAzymes er korte, enkelt-strandet og katalytisk aktive DNA molekyler i stand til endonucleolytic kløft av RNA på bestemte posisjoner. De består av en bevart og katalytisk aktiv kjerne sekvens og 5 ' og 3 ' bindende armer bestående av variable sekvenser utformet for å hybridize av Watson-Crick base-sammenkobling med RNA målet (figur 1). Således leverer de 5 ' og 3 ' armene katalysatoren til den spesifikke RNA-siden. DNAzyme-avhengig kløft er hemmet av 2 '-O-metylering av nukleotid plassert direkte oppstrøms av kløften området12,13. Dette gjør DNAzymes svært praktiske verktøy for analyse av antatte eller kjente RNA 2 '-O-metylering nettsteder.

To typer DNAzymes brukes til RNA modifikasjoner analyser12. Den aktive sekvensen av 10-23 DNAzyme (figur 1a) består av 15 nukleotider (5 ' RGGCTAGCTACAACGA3 ') som danner en løkke rundt den målrettede RNA purine-PYRIMIDIN (ry) dinucleotide og katalysere kløften mellom disse to nukleotider. RNA-purine (R) er ikke koblet sammen med DNAzyme, og de 2 '-O-metylering presenterer på DNAzyme hemmer kløften. Den bindende armene på 10-23 DNAzymes er vanligvis 10-15 nukleotider lang. Den andre DNAzyme klassen, 8-17 DNAzymes (figur 1B) inneholder 14-nukleotid katalysator (5 ' TCCGAGCCGGACGA3 '). Nukleotider C2, c3 og g4 par med C9 G10 og g11 danner en kort stilk-løkke struktur. 8-17 DNAzymes Cleave RNA oppstrøms for alle Guanin som er ufullkomment sammenkoblet med den første thymine fra DNAzyme aktive sekvens. RNA-nukleotid oppstrøms for Guanin er ikke base-sammenkoblet med DNAzyme, og dens 2-O-metylering svekker kløften. 8-17 DNAzymes krever lengre homologi armer på rundt 20 nukleotider for å dirigere DNAzyme til sin spesifikke sekvens.

Her gir vi en trinnvis protokoll for analysen av 2 '-O-metylering av rRNA i Saccharomyces cerevisiae ved hjelp av 10-23 og 8-17 DNAzyme-avhengige tilnærminger12,13 (figur 1C). Denne protokollen kan enkelt tilpasses for andre organismer og RNA arter og ansatt for rask, foreløpig eller større analyser av nettstedet-spesifikke RNA 2 '-O-metylering.

Protocol

1. stammer, Media og buffer oppskrifter

  1. Forbered gjær (S. cerevisiae) medier som beskrevet her: YP (1% w/v gjærekstrakt, 2% w/v bakteriologiske peptone), og glukose og galaktose bestandene på 20% w/v.
  2. Forbered natrium acetate (NaAc)-EDTA (AE) buffer som beskrevet her: 50 mM NaAc pH 5,3 og 10 mM EDTA.
  3. Forbered 10-23 DNAzyme 4X Inkubasjons buffer som beskrevet her: 24 mM Tris pH 8,0, 60 mM NaCl og 10-23 DNAzyme 4X reaksjons buffer: 200 mM Tris pH 8,0 og 600 mM NaCl.
  4. Forbered 8-17 DNAzyme 2x reaksjons buffer som beskrevet her: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,0, 15 mM MgCl2og 15 mm MnCl2.
  5. Forbered 10x MOPPER buffer som beskrevet her: 200 mM MOPPER, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7,0 og 1.5 x sample denaturering buffer: 50% v/v formamid, 20% v/v formaldehyd, 1,5 x MOPPER buffer.
  6. Skaff S. cerevisiae stammer, BY4741 (MATa His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1:: SNR13 (som BY4741 men GAL1:: SNR13: KANmX); GAL1:: SNR47 (som BY4741 men GAL1:: SNR47: HIS3mX). Enhver annen gjær stamme kan brukes til denne analysen.

2. DNAzyme design

  1. Finn RNA sekvens av interesse eller antatte metylering nettsted ved hjelp av en passende database. For S. cerevisiae snoRNA mål, bruk gjær snoRNA database: http://People.Biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14
  2. For å finne metylering stedet av interesse, for eksempel, snR13-avhengige området, velger du "snR13" og noter plasseringen av den modifiserte nukleotid (f. eks, snR13-guidet A2281 i 25S rRNA).
  3. Finn sekvenser oppstrøms og nedstrøms for den endrede nukleotid ved hjelp av riktig database. For S. cerevisiae, bruk Saccharomyces Genova Database: https://www.yeastgenome.org/
  4. Søk etter målet genet navn f. eks RDN25 (koding 25S rRNA).
  5. Fra "sekvens"-kategorien, Velg 10-15 nukleotider oppstrøms (5 ' arm) og nedstrøms (3 ' arm) av metylering området når du bruker en 10-23 DNAzyme-analysen og 20 nukleotider oppstrøms (5 ' arm) og nedstrøms (3 ' arm) av metylering stedet for en 8-17 DNAzyme.
  6. Lag utfyllende sekvenser av 5 ' og 3 ' armer.
  7. Flanke 10-23 eller 8-17 DNAzyme katalysator med utfyllende sekvenser av 5 ' og 3 ' armer.
  8. Bestill DNAzyme som et vanlig DNA-oligonukleotid fra leverandøren.

3. S. cerevisiae vekstforhold

Merk: S. cerevisiae BY4741 stamme derivater ble brukt, der uttrykket av enten SNR13 eller SNR47 snoRNA er drevet fra induserbart GAL1 promoter. For å indusere eller hemme deres syntese, vokse celler på medium som inneholder galaktose (GAL1-avhengig transkripsjon på) eller glukose (GAL1-avhengig transkripsjon av). Som en kontroll, bruk den ville type stamme (BY4741) vokst enten på galaktose eller glukose.

  1. Grow gjær stammer i et passende medium og forhold. For å analysere GAL1:: SNR13 og GAL1:: SNR47 stammer så vel som isogenic ville type belastning, vokser celler i 50 ml av YP medier med enten 2% glukose (YPD) eller galaktose (YPGal) ved 30 ° c til midten eksponentiell fase.
  2. Sentrifuger celler ved 1 000 x g, i 3 min ved 4 ° c.
  3. Kast supernatanten og hold pellets.
  4. Frys celle pellets i flytende nitrogen og oppbevar dem ved-80 ° c.
    Forsiktig: Flytende nitrogen kan forårsake alvorlige kryogene brannskader. Bruk alltid verneklær og sikkerhetsforanstaltninger for treningen.
    Merk: Celle pellets kan oppbevares ved-80 ° c opp til 1 måned. Protokollen kan stanses midlertidig her hvis nødvendig.

4. RNA-isolasjon15

Merk: Bruk den metoden som passer best til å isolere RNA. For gjær S. cerevisiae, varm-fenol RNA ekstraksjon kan brukes.

  1. Tilsett 1 mL iskaldt vann, resuspend pellets og Overfør resuspendert celler til 1,5 mL mikrorør.
  2. Sentrifuger på 20 000 x g for 10 s ved 4 ° c og fjern supernatanten.
  3. Tilsett 400 μL av AE buffer og resuspend cellene.
    Merk: Trinn 4.4-4.15 utføres ved romtemperatur med mindre annet er oppgitt.
  4. Tilsett 40 μL av 10% SDS og 400 μL av syre fenol (pH 4,5).
    Forsiktig: Fenol er giftig og bør håndteres under en avtrekksvifte. Bruk alltid Laboratoriefrakk, vernehansker og briller når du arbeider med fenol. Kast avfallet i henhold til de institusjonelle forskriftene.
  5. Bland godt av virvlingen for 20 s.
  6. Ruge ved 65 ° c i 10 min. Hver 2 min, forsiktig åpne og lukke røret for å løsne trykket og snu røret 2-3 ganger for å blande fasene.
  7. Overfør rørene til-80 ° c og ruge i 10 min.
  8. Tin rørene på benken og sentrifuger ved 20 000 x g, i 5 min ved romtemperatur.
  9. Overfør den øvre fasen til et nytt rør som inneholder 400 μL syre fenol: kloroform: isoamylacetat alkohol (25:24:1). Ikke forstyrre Interphase.
    Forsiktig: Kloroform er giftig og bør håndteres under en avtrekksvifte. Bruk alltid Laboratoriefrakk, vernehansker og briller når du arbeider med kloroform. Kast avfallet i henhold til institusjonens forskrifter.
  10. Bland godt av virvlingen for 30 s og sentrifuger på 20 000 x g i 10 min ved romtemperatur.
  11. Overfør den øvre fasen (~ 400 μL) til et nytt rør som inneholder 400 μL kloroform.
  12. Bland godt av virvlingen for 30 s og sentrifuger på 20 000 x g i 5 min ved romtemperatur.
  13. Overfør den øvre fasen (~ 300-350 μL) til et nytt rør som inneholder 1 mL EtOH og 40 μL av 7,5 M ammonium acetate (NH4AC). Bland ved å bla røret et par ganger.
  14. Ruge ved-80 ° c for 2 t eller over natten ved-20 ° c.
    Merk: Prosedyren kan stanses midlertidig her.
  15. Sentrifuger ved 20 000 x g, i 10 min ved 4 ° c. En liten, hvit RNA-pellet blir synlig på undersiden av slangen.
  16. Fjern EtOH av pipettering for å unngå å forstyrre pellet.
  17. Tilsett 1 mL 70% EtOH og sentrifuge ved 20 000 x g i 5 min ved romtemperatur.
  18. Fjern 70% EtOH av pipettering.
  19. Sentrifuger på 20 000 x g for 15 s og Fjern de resterende EtOH med 2-20 μL pipette.
  20. La slangen stå åpen på benken i 5 minutter for å tørke RNA-pellet-en.
    Merk: RNA pellet skifter farge fra hvitt til gjennomsiktig når det er tørt.
  21. Resuspend RNA-pellet-en i 30 μL av RNase/DNase-Free H2O, Overfør røret umiddelbart på isen og mål RNA-konsentrasjonen på microspectrophotometer.
  22. Fryse prøvene ved-20 ° c.
    Merk: RNA kan oppbevares ved-20 ° c opp til 1 måned og ved-80 ° c opp til 1 år. Prosedyren kan stanses midlertidig her eller gå direkte til neste trinn.

5. DNAzyme fordøyelse

  1. 10-23 DNAzyme fordøyelsen
    1. I 1,5 mL rør klargjør en inkubasjons blanding ved å kombinere 5 mikrogram RNA, 200 pmol på 10-23 DNAzyme (2 μL av 100 mM lager oppløsning) og 2,5 μL av 4X 10-23 Inkubasjons buffer i et total volum på 10 μL. Hold rørene på is.
    2. Overfør rørene til en tørr varme blokk satt til 95 ° c og ruge i 3 min.
    3. Overfør rørene umiddelbart på is og ruge i 5 min.
    4. Spinn kort og sett rørene tilbake på isen.
    5. Tilsett 20 U av RNase-hemmer (f.eks. 0,5 μL RiboLock RNase-hemmer).
    6. Plasser rørene i et tørt varme blokk sett for 25 ° c og ruge i 10 min.
    7. I mellomtiden klargjør du en reaksjons blanding i et 1,5 μL-rør ved å kombinere 5 μL av 4X 10-23 reaksjons buffer med 4 μL 300 mM MgCl2 og 1 μL H2O. Plasser røret i en tørr blokk som er satt til 37 ° c.
    8. Overfør inkubasjons blandingen til et tørt varme blokk sett for 37 ° c og tilsett 10 μL av forvarmet reaksjons miks.
    9. Ruge reaksjonen ved 37 ° c for 1 time.
    10. Overfør rørene på is og gå videre til trinn 5.3.1.
  2. 8-17 DNAzyme fordøyelsen
    1. Klargjør en 1,5 mL microtube med 5 mikrogram RNA i et total volum på 6 μL. Hold slangen på is.
    2. Forbered en 1,5 mL microtube med 400 pmol på 8-17 DNAzyme (4 μL ut av 100 mM lager). Hold røret på isen.
    3. Overfør rørene til et tørt varme blokk sett for 95 ° c og ruge i 2 min.
    4. Flytt RNA-prøven på is.
    5. Snurr ned røret med DNAzyme for 5 s og ruge ved 25 ° c i 10 min.
    6. Samtidig klargjør du en 1,5 mL rør med 10 μL av 2x 8-17 reaksjons buffer og ruge ved 25 ° c.
    7. Forbered en reaksjons blanding ved å legge til 10 μL forvarmet 2x reaksjons buffer til røret med DNAzyme.
    8. Overfør 14 μL av reaksjonsblandingen til røret med RNA og tilsett 20 U av RNase-hemmer.
    9. Ruge reaksjonen ved 25 ° c for 2 timer.
    10. Overfør røret på isen og Fortsett til RNA rensing (trinn 5.3.1).
  3. RNA-rensing
    1. Tilsett 350 μL av vann og 400 μL av kloroform til reaksjonsrøret, bland godt med virvlingen for 30 s og sentrifuge ved 20 000 x g i 5 min ved romtemperatur.
    2. Overfør den øvre fasen (~ 300-350 μL) til et nytt rør som inneholder 1 mL EtOH, 40 μL av 7,5 M NH4AC og 1 μL av glykogen (10 μg/μL). Bland ved å bla røret et par ganger.
    3. Ruge ved-80 ° c for 2 t eller over natten ved-20 ° c.
      Merk: Prosedyren kan stanses midlertidig her.
    4. Gjenta trinn fra 4,15 til 4,21.
    5. Resuspend RNA pellet-en i 10 μL av RNase/DNase-Free H2O og Overfør rørene umiddelbart på is.
    6. Fryse prøvene ved-20 ° c.
      Merk: RNA kan oppbevares ved-20 ° c opp til en måned og ved-80 ° c opp til 1 år. Prosedyren kan stanses midlertidig her eller fortsette til RNA-elektroforese.

6. RNA-elektroforese

  1. Spray elektroforese utstyr (tank, brett, kam) med 1% SDS, la i 15 min og skyll med rikelig med ddH2O.
  2. Løs opp 1,5 g agarose i 127,5 mL ddH2O ved å varme den opp i mikrobølgeovnen.
  3. Tilsett 15 mL 10x MOPPER og 7,5 mL 37% formaldehyd til den agarose løsningen (totalt volum er 150 mL).
    Forsiktig: Formaldehyd er giftig og bør håndteres under en avtrekksvifte. Bruk alltid en Laboratoriefrakk, vernehansker og briller når du arbeider med formaldehyd. Kast avfallet i henhold til institusjonens forskrifter.
  4. Legg en passende mengde av en gel flekk av valget til den agarose løsningen (f. eks 15 μL av SYBR safe DNA gel flekken). Bland godt og hell agarose i skuffen.
  5. Sett en kam i gelen umiddelbart.
  6. La den være for 45 min under avtrekks panseret. Dekk skuffen med aluminiumsfolie når du bruker en lysfølsom gel flekken.
  7. Klargjør 600 mL 1x MOPPER-buffer.
  8. RNA prøveforberedelse
    1. I et 1,5 mL rør, Kombiner 10 μL av fordøyd og renset RNA sample, 5 μL av sample denaturering buffer og 0,5 μL av 6 ganger loading Dye.
      Forsiktig: Formamid er giftig og bør håndteres under en avtrekksvifte. Bruk alltid Laboratoriefrakk, vernehansker og briller når du arbeider med formamid. Kast avfallet i henhold til institusjonens forskrifter.
    2. Ruge RNA-prøver ved 70 ° c i 5 min. Overfør prøvene på is. Ruge i 5 min.
    3. Snurr ned kort før du legger på gelen.
  9. Sett gelen i elektroforese tanken og fyll med 1x MOPPER buffer. Legg hele volumet av hver prøve (15 μL) på gelen. Kjør på 80 V til bromophenol blå når 2/3 av gel lengde.
  10. Image gelen ved hjelp av et imager hensiktsmessig å oppdage den valgte gel flekken (f. eks UV transilluminator).

Representative Results

Nytten av den DNAzyme-avhengige kløft i analysen av rRNA modifikasjoner har blitt vist nylig i sammenheng med snoRNAs modning13. Den DNAzyme-avhengige analysen ble brukt til å vise at mangel på 5 '-end pre-snoRNA behandling påvirker 2 '-O-metylering nivåer av 25S og 18S rRNA i S. cerevisiae13.

Her har vi brukt en induserbart snoRNA transkripsjon system for å demonstrere effektiviteten og enkelhet av teknikken. Boks C/D snR13 guider metylering på to posisjoner i 25S rRNA, inkludert adenine 2281 (figur 2a). Denne nukleotid etterfølges av uracil, som utgjør konsensus dinucleotide (RY) spaltbare av en 10-23 DNAzyme. Box C/D snR47 guider også metylering av to nukleotider i 25S rRNA (figur 2b). Adenine i posisjon 2220 etterfølges av en Guanin rest, og denne dinucleotide kan kløyvde av en 8-17 DNAzyme. For å indusere eller hemme syntese av enten snR13 eller snR47 snoRNA, satte vi inn induserbart GAL1 promoter oppstrøms av enten snR13 eller snR47 gener og dyrket celler i medium inneholdende galaktose (GAL1-avhengige transkripsjon på) eller glukose (GAL1-avhengig transkripsjon av). Deretter RNA isolert fra GAL1:: SNR13 celler ble inkubert med 10-23 DNAzyme designet for å holde 25S RRNA på SNR13-avhengige området, mellom nukleotider 2281 og 2282 (figur 2C). RNA fra GAL1:: SNR47 stamme ble behandlet med 8-17 DNAzyme målretting SNR47-avhengige området mellom nukleotider 2220 og 2221 (figur 2D). Som en kontroll, ble RNA fra den ville-type BY4741-belastningen som vokser på enten galaktose eller glukose inkubert med begge DNAzymes. Elektroforese av DNAzyme-behandlet RNA avslørte at 25S rRNA utvunnet fra GAL1:: SNR13 og GAL1:: SNR47 stammer som vokser på galaktose (gal) forble intakt (figur 3a,B; kjørefelt 3). I kontrast, RNA isolert fra GAL1:: SNR13 og GAL1:: SNR47 celler vokser på glukose (GLC) ble fordøyd av respektive DNAzymes (figur 3a, B; Lanes 4). I begge tilfeller ble 25S rRNA-bandet redusert, og det ble observert 5 ' og 3 ' cut-off-produkter (A og B). Dette indikerer at i GAL1:: SNR13 og GAL1:: SNR47 stammer, 25S rRNA var 2 '-O-denaturert på SNR13-eller SNR47-guidede steder da galaktose ble brukt som karbon kilde og disse snoRNA ble uttrykt. Mangelen på 25S rRNA metylering når snR13 eller snR47 uttrykk ble slått av på glukose tillatt for DNAzyme-avhengig kløft. Ingen RNA fordøyelsen ble observert for vill-type prøver (figur 3a,B; Lanes 1 og 2), som uttrykk for snR13 og snR47 er galaktose/glukose-uavhengig i denne belastningen. Derfor var rRNA normalt denaturert og så motstandsdyktig mot DNAzymes aktivitet.

Totalt sett viser eksperimentet at kløften aktiviteten til 10-23 (figur 3a) og 8-17 (figur 3b) DNAzymes korrelert med fravær av boksen C/D snR13 eller snR47, tydelig indikerer at disse SnoRNA er ansvarlig for 25S rRNA 2 '-O-metylering på bestemte steder.

Figure 1
Figur 1: DNAzymes og deres RNA-underlag. (A) 10-23 DNAzymes Cleave en purine-PYRIMIDIN (ry) RNA-dinucleotide. R i RNA-en er ikke paret med DNAzyme, mens Y er komplementær til R-basen i DNAzyme. Metylering av purine (R) i RNA undertrykker DNAzyme-avhengig kløft. (B) 8-17 DNAzymes Guanin som er ufullkomment sammenkoblet med den første Thymine i DNAzyme katalysator. Nukleotid foregående Guanin er ikke sammenkoblet og dens metylering beskytter mot DNAzyme-avhengig kløft. RNA vises i grått (bortsett fra metylering IDen), DNAzyme vises i lilla. N = alle nukleotid, R = purine: adenine eller Guanin, Y = pyrimidin: cytosin eller uracil; CH3-betegner RNA-metylering. Base paring innenfor DNAzyme aktive sekvenser er markert med stiplede linjer. En blå lyn bolt markerer kløften stedet. (C) et flytdiagram som viser trinnene i en DNAzyme-avhengig analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: DNAzymes rettet mot snR13-og snR47-avhengige metylering områder i 25S rRNA. (A, B) Nettleser skjermbilder viser snR13-avhengige (A) og snR47-avhengige (B) metylering områder i 25S rRNA (C) 25S rRNA sekvens rundt SnR13-avhengige metylering nettsted (A2281) og 10-23 DNAzyme (vist i lilla) utformet for å holde RNA mellom A2281 og U2282. En2281 er ikke sammenkoblet med DNAzyme mens U2282 danner et par med den første nukleotid fra DNAzyme aktive sekvens (markert med en blå linje). En blå lyn bolt markerer kløften. (D) 25S rRNA sekvens rundt snR47-avhengige metylering nettsted (en2220) og 8-17 DNAzyme (vist i lilla) designet for å holde RNA mellom en2220 og G2221. En2220 er ikke hybridisert med DNAzyme mens G2221 er ufullkomment sammenkoblet med thymine (betegnet med en stiplet linje). En blå lyn bolt markerer kløften stedet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: analyse av områdespesifikke 2 '-O-metylering av 25S rRNA med 10-23 og 8-17 DNAzyme-avhengige analysen. (A) analyse av snR13-avhengige 25S rRNA metylering ved hjelp av 10-23 DNAzyme. (B) analyse av snR47-avhengige 25S rRNA metylering ved hjelp av 8-17 DNAzyme. RNA var i en farge i en denaturering agarose gel. Kløft produkter A og B er merket med røde piler. WT = stamme av vill-type; GAL = galaktose, GLC = glukose. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

DNAzyme-avhengig fordøyelse kan brukes som en enkel og rask metode for å analysere nettstedets spesifikke RNA 2 '-O-metylering12,13. DNAzymes holde RNA hvis nukleotid oppstrøms av kløften er ikke denaturert. I motsetning til andre tilnærminger, inkludert RNase H-regissert fordøyelse, alkalisk degradering eller omvendt transkripsjon i lav nukleotider konsentrasjon etterfulgt av kvantitative PCR eller sekvensering8,10,11 ,16, DNAzyme tilnærming krever en enkel DNA oligonukleotid og grunnleggende reagenser som er til stede i noen molekylærbiologi laboratorium. Videre kan DNAzymes brukes på en lignende måte å analysere RNA pseudouridylation mediert av boksen H/ACA snoRNA12, noe som gjør dem allsidige verktøy i å studere snoRNA mål.

DNAzyme-avhengige tilnærminger er begrenset bare av en kløft sted konsensus sekvenser17. 10-23 DNAzymes kan brukes til å analysere 2 '-O-metylering bare i posisjon R i RY-dinucleotide, mens 8-17 DNAzymes gjenkjenner endringen av nukleotid som ligger oppstrøms for Guanin. Som et resultat kan ikke endringer som 2 '-O-metylering i den første nukleotid i dinucleotides Guanin-adenine (GA), adenine-adenine (AA), pyrimidin-adenine (YA) og pyrimidin-pyrimidin (YY) analyseres. Videre bør den lave effektiviteten av DNAzyme-avhengige kløft12 vurderes. Selv om noen DNAzymes Cleave RNA nesten helt (figur 3b), mange DNAzymes bare delvis fordøye sine mål (figur 3b). Effektiviteten kan avhenge av sekvensen rundt kløften området. RNA-regioner med strekninger av samme nukleotid kan for eksempel påvirke riktig plassering av DNAzyme aktive sekvens. Videre kan RNA-regioner som danner sterk sekundær struktur, hybridize på nytt og undertrykke DNAzyme-binding til mål sekvensen. For å overkomme disse problemene, kan sykluser av oppvarming og kjøling av 10-23-DNAzyme og RNA-underlaget anvendes18.

Vi brukte DNAzyme tilnærming for å undersøke 2 '-O-metylering av rRNA. Man kan også bruke denne teknikken til å analysere andre RNA-modifikasjoner, for eksempel N6-methyladenosine19. Ribosomal RNA, på grunn av sin overflod, kan analyseres av elektroforese, og det kan være et eksempel på kløften under UV-lyset. Dette gjelder imidlertid ikke for mindre rikelig RNAs som RNA polymerase II-generert koding RNAs (mRNA) og ikke-koding RNAs (ncRNA). Disse RNAs kan vanligvis ikke oppdages direkte ved RNA farging i agarose eller polyakrylamid gels. I slike tilfeller kan DNAzyme-avhengige kløft være et eksempel på Nord-blotting, som indirekte oppdages av PCR/kvantitativ PCR eller analyseres av kvantitativ PCR med polymerases (for eksempel KlenTaq DNA polymerase) som kan diskriminerende 2 '-O-denaturert RNA fra metylerte RNA20,21.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Maya Wilson og Aneika Leney for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en Sir Henry Dale Fellowship i fellesskap finansiert av Wellcome Trust og Royal Society (200473/Z/16/Z).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acid phenol SIGMA P4682
Agarose VWR A2114
Ammonium acetate SIGMA A1542
Chlorophorm Fisher scientific 10293850
DNase/RNase free water Fischer Scientific 10526945
DNAzyme Integrated DNA Technology Custom oligo DNA
EDTA SIGMA E9884
Ethanol Absolute Fisher scientific 10437341
Formaldehyde Sigma F8775
Formamide sigma F9037
Galactose SIGMA G0750
Gel Loading Dye Thermo Fisher Scientific R0611
Glucose SIGMA G7021
Glycogen Thermo Fisher Scientific R0561
HEPES SIGMA H3375
Isoamyl SIGMA W205702
KCl SIGMA P9333
MgCl2 SIGMA M8266
MnCl2 SIGMA 244589
MOPS SIGMA M1254
NaCl SIGMA S7653
Oxoid Peptone Bacteriological Thermo Fisher Scientific LP0037
Oxoid Yeast Extract Powder Thermo Fisher Scientific LP0021
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) Thermo Fisher Scientific EO0382
SDS SIGMA 74255
Sodium acetate trihydrate SIGMA S8625
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
Tris base SIGMA TRIS-RO
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
1.5 mL microtubes Sarstedt
152VR5C01M -80°C freezer Thermo Fisher Scientific
250 mL Erlenmeyer flasks Cole-Parmer
50 mL conical tubes Sarstedt
Combicup VX200 vortex Appleton Woods
DS-11 microspectrophotometer Denovix
Electrophoresis chamber (20 cm tray) SIGMA
FiveEasy F20 pH meter Appleton Woods
Gel documentation system Syngene
Heraeus Fresco 21 micro centrifuge Fisher Scientific
Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes Fisher Scientific
Mini Fuge Plus mini centrifuge Starlab
Mixer HC thermal block Starlab
OLS26 Shaking Water Bath Grant
PowerPac power supplier BioRad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dieci, G., Preti, M., Montanini, B. Eukaryotic snoRNAs: a paradigm for gene expression flexibility. Genomics. 94 (2), 83-88 (2009).
  2. Watkins, N. J., Bohnsack, M. T. The box C/D and H/ACA snoRNPs: key players in the modification, processing and the dynamic folding of ribosomal RNA. Wiley Interdisciplinary Review RNA. 3 (3), 397-414 (2012).
  3. Kufel, J., Grzechnik, P. Small Nucleolar RNAs Tell a Different Tale. Trends in Genetics. , (2018).
  4. Li, T., Zhou, X., Wang, X., Zhu, D., Zhang, Y. Identification and characterization of human snoRNA core promoters. Genomics. 96 (1), 50-56 (2010).
  5. Jorjani, H., et al. An updated human snoRNAome. Nucleic Acids Research. 44 (11), 5068-5082 (2016).
  6. Hubbard, T. J., et al. Ensembl 2009. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D690-D697 (2009).
  7. Makarova, J. A., Kramerov, D. A. SNOntology: Myriads of novel snoRNAs or just a mirage? BMC Genomics. 12, 543 (2011).
  8. Yu, Y. T., Shu, M. D., Steitz, J. A. A new method for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules. RNA. 3 (3), 324-331 (1997).
  9. Decatur, W. A., Liang, X. H., Piekna-Przybylska, D., Fournier, M. J. Identifying effects of snoRNA-guided modifications on the synthesis and function of the yeast ribosome. Methods in Enzymology. 425, 283-316 (2007).
  10. Dong, Z. W., et al. RTL-P: a sensitive approach for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules. Nucleic Acids Research. 40 (20), e157 (2012).
  11. Birkedal, U., et al. Profiling of ribose methylations in RNA by high-throughput sequencing. Angewandte Chemie International Edition, England. 54 (2), 451-455 (2015).
  12. Buchhaupt, M., Peifer, C., Entian, K. D. Analysis of 2'-O-methylated nucleosides and pseudouridines in ribosomal RNAs using DNAzymes. Analytical Biochemistry. 361 (1), 102-108 (2007).
  13. Grzechnik, P., et al. Nuclear fate of yeast snoRNA is determined by co-transcriptional Rnt1 cleavage. Nature Communication. 9 (1), 1783 (2018).
  14. Piekna-Przybylska, D., Decatur, W. A., Fournier, M. J. New bioinformatic tools for analysis of nucleotide modifications in eukaryotic rRNA. RNA. 13 (3), 305-312 (2007).
  15. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18 (10), 3091-3092 (1990).
  16. Maden, B. E. Mapping 2'-O-methyl groups in ribosomal RNA. Methods. 25 (3), 374-382 (2001).
  17. Santoro, S. W., Joyce, G. F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proceedings of the National Academy of Science, U. S. A. 94 (9), 4262-4266 (1997).
  18. Hengesbach, M., Meusburger, M., Lyko, F., Helm, M. Use of DNAzymes for site-specific analysis of ribonucleotide modifications. RNA. 14 (1), 180-187 (2008).
  19. Sednev, M. V., et al. N(6) -Methyladenosine-Sensitive RNA-Cleaving Deoxyribozymes. Angewandte Chemie International Edition, England. 57 (6), 15117-15121 (2018).
  20. Aschenbrenner, J., Marx, A. Direct and site-specific quantification of RNA 2'-O-methylation by PCR with an engineered DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 44 (8), 3495-3502 (2016).
  21. Lee, K. W., Bogenhagen, D. F. Assignment of 2'-O-methyltransferases to modification sites on the mammalian mitochondrial large subunit 16 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (36), 24936-24942 (2014).

Tags

Utviklingsbiologi RNA modifikasjon 2 '-O-metylering rRNA DNAzyme snoRNA RNA-analyse
DNAzyme-avhengig analyse av rRNA 2 '-O-metylering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winczura, K., Grzechnik, P.… More

Winczura, K., Grzechnik, P. DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2’-O-Methylation. J. Vis. Exp. (151), e59700, doi:10.3791/59700 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter