Summary
Här presenterar vi ett protokoll för DNAzyme-beroende klyvning av RNA. Detta möjliggör snabb och plats beroende analys av RNA 2 '-O-metylering. Denna metod kan användas för den preliminära eller större bedömningen av snoRNA aktivitet.
Abstract
Guide Box C/D liten nukleolära rnas (snornas) katalysera 2 '-O-metylering av ribosomal och små nukleära RNA. Emellertid, ett stort antal snoRNA i högre Eukaryoter kan promiscuously erkänna andra RNA arter och 2 '-O-metylera flera mål. Här, vi ger steg-för-steg guide för snabb och icke-dyr analys av platsspecifika 2 '-O-metylering med hjälp av en väl etablerad metod att anställa korta DNA oligonukleotides kallas DNAzymes. Dessa DNA-fragment innehåller katalytiska sekvenser som klyver RNA vid specifika kon sen SUS positioner, samt variabla homologiska armar som riktar DNAzyme till dess RNA-mål. DNAzyme aktivitet hämmas av 2-' O-metylering av nukleotid intill klyvning plats i RNA. Sålunda, dnazymes, begränsas endast av konsensus i klyvs sekvens, är perfekta verktyg för snabb analys av snorna-medierad RNA 2 '-O-metylering. Vi analyserade snoRNA snR13-och snR47-guidad 2 '-O-metylering av 25S ribosomalt RNA i Saccharomyces cerevisiae att demonstrera enkelheten i tekniken och att ge ett detaljerat protokoll för DNAzyme-beroende analysen.
Introduction
RNA-ändringar leker viktiga roller i regleringen av genuttryck. RNA 2 '-O-metylering och pseudouridylation, som styrs av Box C/D och Box H/ACA små nukleolära rnas (snorna) respektive, skydda RNA från nedbrytning och stabilisera deras högre ordningens strukturer1,2,3 . SnoRNA mål har identifierats främst i ribosomal RNAs (rRNA) och små nukleära RNAs (snRNAs). Men i högre Eukaryoter, det finns potentiellt hundratals snorna utan tilldelade funktioner och några av dem kan känna igen flera rnas1,4,5,6,7. Därför är metoder som möjliggör identifiering och analys av snoRNA-guidade modifieringar viktiga verktyg i att avslöja mekanismer som reglerar cellulära processer.
En ruta C/D snorna-guidad förmodade 2 '-O-metylering plats kan identifieras bioinformatiskt och bekräftas experimentellt av många tekniker, inklusive RNase H-riktad klyvning, eller platsspecifika och genomhela metoder, som sysselsätter omvänd Transkription i låga nukleotider (dNTPs) koncentrations metod8,9,10,11. Dessa tekniker är mycket känsliga men också mödosamma och dyra, därför, kanske inte lämpar sig för den inledande eller snabb testning. En av de enklaste och lågkostnads metoder för att identifiera 2 '-O-metylering platser är DNAzyme-beroende RNA klyvning12. DNAzymes är korta, enkelsträngade och katalytiskt aktiva DNA-molekyler som kan endonukleolytiska klyvning av RNA vid specifika positioner. De består av en bevarad och katalytiskt aktiv kärnsekvens och 5 ' och 3 ' bindnings armar som består av variabla sekvenser konstruerade för att hybridisera av Watson-Crick Base-para ihop till RNA-målet (figur 1). Sålunda, 5 "och 3" armar leverera katalytisk sekvens till den specifika RNA platsen. Dnazyme-beroende klyvning hämmas av 2 '-O-metylering av nukleotiden placerad direkt uppströms klyvning plats12,13. Detta gör dnazymes mycket praktiska verktyg för analys av förmodade eller kända RNA 2 '-O-metylering platser.
Två typer av DNAzymes används för RNA-modifieringar analyser12. Den aktiva sekvensen av 10-23 DNAzyme (figur 1a) består av 15 nukleotider (5 ' RGGCTAGCTACAACGA3 ') som bildar en slinga runt den riktade RNA purin-pyrimidin (ry) dinucleo tid och katalysera klyvning mellan dessa två nukleotider. RNA purin (R) är inte Base-parade med DNAzyme och 2 '-O-metylering presenterar på DNAzyme hämmar klyvning. Det bindande beväpnar av 10-23 dnazymes är vanligt 10-15 nukleotider Long. Den andra DNAzyme-klassen, 8-17 DNAzymes (figur 1b) innehåller 14-nukleotidkatalytisk sekvens (5 ' TCCGAGCCGGACGA3 '). Nukleotider C2, c3 och g4 par med c9 G10 och g11 bildar en kort stam-loop struktur. 8-17 DNAzymes klyva RNA uppströms någon guanin som är ofullständigt ihopkopplad med den första tymin från DNAzyme aktiv sekvens. RNA-nukleotiden uppströms guanin är inte Base-parade med DNAzyme och dess 2 '-O-metylering försämrar klyvning. 8-17 DNAzymes kräver längre homologi armar av cirka 20 nukleotider att rikta DNAzyme till dess specifika sekvens.
Här ger vi ett steg-för-steg-protokoll för analys av 2 '-O-metylering av rRNA i Saccharomyces cerevisiae med 10-23 och 8-17 dnazyme-beroende metoder12,13 (figur 1c). Detta protokoll kan lätt anpassas för andra organismer och RNA-arter och används för snabba, preliminära eller större analyser av platsspecifik RNA 2-O-metylering.
Protocol
1. stammar, media och buffert recept
- Förbered jäst (S. cerevisiae) media som beskrivs här: YP (1% w/v jästextrakt, 2% w/v bakteriologisk Peptone), och glukos och galaktos bestånd på 20% w/v.
- Förbered natriumacetat (NaAc)-EDTA (AE) buffert som beskrivs här: 50 mM NaAc pH 5,3 och 10 mM EDTA.
- Förbered 10-23 DNAzyme 4x inkubations buffert som beskrivs här: 24 mM Tris pH 8,0, 60 mM NaCl och 10-23 DNAzyme 4x reaktions buffert: 200 mM Tris pH 8,0 och 600 mM NaCl.
- Förbered 8-17 DNAzyme 2x reaktionsbuffert som beskrivs här: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,0, 15 mM MgCl2, och 15 mm mncl2.
- Förbered 10X MOPS buffert som beskrivs här: 200 mM moppar, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7,0 och 1.5 x prov denaturerande buffert: 50% v/v formamid, 20% v/v formaldehyd, 1.5 x MOPS buffert.
- Få S. cerevisiae stammar, BY4741 (MATa His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1:: SNR13 (som BY4741 men GAL1:: SNR13: KANmX); GAL1:: SNR47 (som BY4741 men GAL1:: SNR47: HIS3mX). Någon annan jäst stam kan användas för denna analys.
2. DNAzyme design
- Hitta RNA-sekvens av intresse eller förmodade metylering webbplats med hjälp av en lämplig databas. För S. cerevisiae snorna mål, använda jäst snorna databas: http://People.Biochem.UMass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14
- För att hitta den metylering plats av intresse, t ex snR13-beroende webbplats, välj "snR13" och anteckna positionen för den modifierade nukleotid (t. ex., snR13-guidad en2281 i 25s rRNA).
- Hitta sekvenser uppströms och nedströms av den modifierade nukleotiden med hjälp av lämplig databas. För S. cerevisiae, använda den Saccharomyces Genome databas: https://www.yeastgenome.org/
- Sök efter mål gen namn t. ex., RDN25 (kodning 25S rRNA).
- Från "sekvens" fliken, Välj 10-15 nukleotider uppströms (5 ' arm) och nedströms (3 ' arm) av metylering platsen när du använder en 10-23 DNAzyme analys och 20 nukleotider uppströms (5 ' arm) och nedströms (3 ' arm) av metylering platsen för en 8-17 DNAzyme.
- Skapa kompletterande sekvenser av 5 ' och 3 ' armar.
- Flank 10-23 eller 8-17 DNAzyme katalytisk sekvens med kompletterande sekvenser av 5 ' och 3 ' armar.
- Beställ DNAzyme som en normal DNA oligonukleotid från leverantören.
3. S. cerevisiae tillväxtvillkor
Anmärkning: S. cerevisiae BY4741 stam derivat användes, där uttrycket av antingen SNR13 eller SNR47 snorna drivs från den inducerbara GAL1 promotorn. För att framkalla eller hämma deras syntes, växer celler på medlet som innehåller galaktose (GAL1-anhörigen transkription på) eller glukos (GAL1-anhörigen transkription av). Som en kontroll, använda den vilda typen stam (BY4741) odlas antingen på galaktos eller glukos.
- Odla jäststammar i ett lämpligt medium och villkor. För att analysera GAL1:: SNR13 och GAL1:: SNR47 stammar samt den isogena vildtyp stammen, odla celler i 50 ml YP-media med antingen 2% glukos (YPD) eller galaktos (ypgal) vid 30 ° c till mitten exponentiell fas.
- Centrifugera celler vid 1 000 x g, under 3 min vid 4 ° c.
- Kassera supernatanten och behåll pellets.
- Frys cell pellets i flytande kväve och förvara dem vid-80 ° c.
Försiktighet: Flytande kväve kan orsaka allvarliga kryogena brännskador. Använd alltid skyddskläder och iaktta säkerhetsföreskrifter.
Anmärkning: Cell pellets kan förvaras vid-80 ° c upp till 1 månad. Protokollet kan pausas här om det behövs.
4. RNA-isolering15
Anmärkning: Använd den lämpligaste metoden för att isolera RNA. För jäst S. cerevisiae, kan hot-fenol RNA utvinning användas.
- Tillsätt 1 mL iskallt vatten, Omsuspendera pelletsen och överför tillbaka cellerna till 1,5 mL-mikrotuber.
- Centrifugera på 20 000 x g i 10 s vid 4 ° c och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 400 μL AE-buffert och Omsuspendera cellerna.
Anmärkning: Steg 4.4-4.15 utförs i rumstemperatur om inget annat anges. - Tillsätt 40 μL 10% SDS och 400 μL syra fenol (pH 4,5).
Försiktighet: Fenol är giftigt och bör hanteras under ett draghuv. Använd alltid en labbrock, skyddshandskar och glasögon när du arbetar med fenol. Avfallshantera avfallet enligt de institutionella föreskrifterna. - Blanda väl genom vortexa för 20 s.
- Inkubera vid 65 ° c i 10 min. Var 2 min, försiktigt öppna och stänga röret för att frigöra trycket och vänd röret 2-3 gånger för att blanda faserna.
- Överför rören till-80 ° c och inkubera i 10 minuter.
- Avfrosta rören på bänken och centrifugera vid 20 000 x g, för 5 min vid rumstemperatur.
- Överför den övre fasen till ett nytt rör som innehåller 400 μL syra fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1). Stör inte interfasen.
Försiktighet: Kloroform är giftig och bör hanteras under ett draghuv. Använd alltid en labbrock, skyddshandskar och glasögon när du arbetar med kloroform. Avfallshantera avfallet enligt institutionella föreskrifter. - Blanda väl genom vortexa för 30 s och centrifugera vid 20 000 x g i 10 min vid rumstemperatur.
- Överför den övre fasen (~ 400 μL) till ett nytt rör som innehåller 400 μL kloroform.
- Blanda väl genom vortexa för 30 s och centrifugera vid 20 000 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Överför den övre fasen (~ 300-350 μL) till ett nytt rör innehållande 1 mL EtOH och 40 μL på 7,5 M ammoniumacetat (NH4AC). Blanda genom att vrida röret några gånger.
- Inkubera vid-80 ° c i 2 h eller över natten vid-20 ° c.
Anmärkning: Proceduren kan pausas här. - Centrifugera vid 20 000 x g, under 10 min vid 4 ° c. En liten, vit RNA-pellet blir synlig på undersidan av röret.
- Ta EtOH genom pipettering för att undvika att störa pelleten.
- Tillsätt 1 mL 70% EtOH och centrifugera vid 20 000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort 70% EtOH genom pipettering.
- Centrifugera vid 20 000 x g i 15 s och ta bort resterande EtOH med 2-20 μl pipett.
- Lämna röret öppet på bänken i 5 min för att torka RNA pelleten.
Anmärkning: RNA pelleten ändrar sin färg från vitt till transparent när det är torrt. - Omsuspendera RNA-pelleten i 30 μL RNase/DNase-fritt H2O, överför röret omedelbart på isen och mät RNA-koncentrationen på mikrospektrofotometer.
- Frys proverna vid-20 ° c.
Anmärkning: RNA kan förvaras vid-20 ° c upp till 1 månad och vid-80 ° c upp till 1 år. Proceduren kan pausas här eller fortsättas direkt till nästa steg.
5. DNAzyme matsmältning
-
10-23 DNAzyme matsmältning
- I 1,5 mL rör förbereda en inkubering blandning genom att kombinera 5 μg RNA, 200 pmol av 10-23 DNAzyme (2 μL av 100 mM stamlösning) och 2,5 μL av 4x 10-23 inkubations buffert i en total volym av 10 μL. Håll rören på isen.
- Överför rören till ett torrt värmeblock inställt på 95 ° c och inkubera i 3 min.
- Överför rören omedelbart på is och inkubera i 5 minuter.
- Snurra kort och sätt tillbaka rören på isen.
- Tillsätt 20 U av RNase hämmare (t. ex. 0,5 μL RiboLock RNase hämmare).
- Placera rören i ett torrt värmeblock inställt på 25 ° c och inkubera i 10 min.
- Under tiden förbereder du en reaktionsblandning i ett 1,5 μL-rör genom att kombinera 5 μL 4x 10-23 reaktionsbuffert med 4 μL 300 mM MgCl2 och 1 μl H2O. Placera röret i ett torrt block inställt på 37 ° c.
- Överför inkuberingblandningen till ett torrt värmeblock som är inställt på 37 ° c och tillsätt 10 μL förvärmda reaktionsblandning.
- Inkubera reaktionen vid 37 ° c i 1 h.
- Överför rören på isen och gå vidare till steg 5.3.1.
-
8-17 DNAzyme matsmältning
- Bered en 1,5 mL mikrotub med 5 μg RNA i en total volym på 6 μL. Håll röret på is.
- Förbered en 1,5 ml mikrorör med 400 pmol av 8-17 dnazyme (4 μl av 100 mm lager). Håll röret på is.
- Överför rören till en torr värmeblock för 95 ° c och inkubera i 2 min.
- Flytta RNA-provet på is.
- Snurra röret med DNAzyme i 5 s och inkubera vid 25 ° c i 10 minuter.
- Bered samtidigt ett 1,5 mL-rör med 10 μL 2x 8-17-reaktionsbuffert och inkubera vid 25 ° c.
- Förbered en reaktionsblandning genom att tillsätta 10 μL förvärmd 2x reaktionsbuffert till röret med DNAzyme.
- Överför 14 μL av reaktionsblandningen till röret med RNA och tillsätt 20 U RNase hämmare.
- Inkubera reaktionen vid 25 ° c i 2 timmar.
- Överför röret på isen och fortsätt till RNA-rening (steg 5.3.1).
-
RNA rening
- Tillsätt 350 μl vatten och 400 μl kloroform till reaktionsröret, blanda väl med vortexa för 30 s och centrifugera vid 20 000 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Överför den övre fasen (~ 300-350 μL) till ett nytt rör som innehåller 1 mL EtOH, 40 μL av 7,5 M NH4AC och 1 μl glykogen (10 μg/μl). Blanda genom att vrida röret några gånger.
- Inkubera vid-80 ° c i 2 h eller över natten vid-20 ° c.
Anmärkning: Proceduren kan pausas här. - Upprepa steg från 4,15 till 4,21.
- Omsuspendera RNA-pelleten i 10 μL RNase/DNase-fritt H2O och överför rören omedelbart på isen.
- Frys proverna vid-20 ° c.
Anmärkning: RNA kan förvaras vid-20 ° c upp till en månad och vid-80 ° c upp till 1 år. Proceduren kan pausas här eller gå vidare till RNA-elektrofores.
6. RNA-elektrofores
- Spraya elektrofores utrustning (tank, bricka, kam) med 1% SDS, låt verka i 15 min och skölj med rikligt med ddH2O.
- Lös 1,5 g aguppstod i 127,5 mL ddH2O genom att värma upp den i mikrovågsugnen.
- Tillsätt 15 mL 10X MOPS och 7,5 mL 37% formaldehyd till Agros-lösningen (total volym är 150 mL).
Försiktighet: Formaldehyd är giftig och bör hanteras under ett draghuv. Använd alltid en labbrock, skyddshandskar och glasögon när du arbetar med formaldehyd. Avfallshantera avfallet enligt institutionella föreskrifter. - Tillsätt en lämplig mängd av en gel som du väljer till aguppstod-lösningen (t. ex. 15 μL SYBR Safe DNA-gelfläck). Blanda väl och häll aguppstod till facket.
- Sätt i en kam i gelen omedelbart.
- Låt den vara 45 min under draghuven. Täck brickan med aluminiumfolie när du använder en ljuskänslig gel fläck.
- Förbered 600 mL 1x MOPS buffert.
-
RNA provberedning
- I ett 1,5 mL-rör, kombinera 10 μL av det nedsmälta och renade RNA-provet, 5 μL prov denaturerande buffert och 0,5 μL 6x-Lastfärg.
Försiktighet: Formamid är giftigt och bör hanteras under ett draghuv. Använd alltid en labbrock, skyddshandskar och glasögon när du arbetar med formamid. Avfallshantera avfallet enligt institutionella föreskrifter. - Inkubera RNA-prover vid 70 ° c i 5 min. överför proverna på isen. Inkubera i 5 minuter.
- Snurra kort innan du laddar på gelen.
- I ett 1,5 mL-rör, kombinera 10 μL av det nedsmälta och renade RNA-provet, 5 μL prov denaturerande buffert och 0,5 μL 6x-Lastfärg.
- Sätt gelen i elektrofores tanken och fyll med 1x MOPS buffert. Fyll på hela volymen av varje prov (15 μL) på gelen. Kör på 80 V tills bromofenol blå når 2/3 av Gelens längd.
- Avbilda gelen med hjälp av en Imager som lämpar sig för att detektera den valda gel fläcken (t. ex. UV-transilluminator).
Representative Results
Nyttan av DNAzyme-beroende klyvning i analysen av rRNA ändringar har visats nyligen i samband med snoRNAs mognad13. Den DNAzyme-beroende analysen användes för att visa att avsaknaden av 5 '-End pre-snoRNA behandling påverkar 2 '-O-metylering nivåer av 25S och 18S rRNA i S. cerevisiae13.
Här använde vi ett inducerbart snoRNA transkription system för att demonstrera effektiviteten och enkelheten i tekniken. Box C/D snR13 vägleder metylering vid två positioner i 25S rRNA, inklusive adenin 2281 (figur 2A). Denna nukleotid följs av uracil, som utgör konsensus--dinukleotid (ry) lånet av en 10-23 dnazyme. Box C/D snR47 också vägleder metylering av två nukleotider i 25S rRNA (figur 2b). Adenin i position 2220 följs av ett guaninrester och denna dinukleotid kan klyvas av en 8-17 DNAzyme. För att inducera eller hämma syntesen av antingen snR13 eller snR47 snoRNA, satte vi in den inducerbara GAL1 promotorn uppströms antingen snR13 eller snR47 gener och odlade celler i medium innehållande galaktos (GAL1beroende transkription på) eller glukos (GAL1-beroende transkription av). Nästa, RNA isolerade från GAL1:: SNR13 celler inkuberades med 10-23 dnazyme syftar till att klyva 25s rRNA på SNR13-beroende webbplats, mellan nukleotider 2281 och 2282 (figur 2C). RNA från GAL1:: SNR47 stam behandlades med 8-17 DNAzyme inriktning SNR47-beroende plats mellan nukleotider 2220 och 2221 (figur 2D). Som en kontroll, RNA från Wild-typ BY4741 stam som växer på antingen galaktos eller glukos inkuberades med både DNAzymes. Elektrofores av DNAzyme-behandlade RNA avslöjade att 25S rRNA utvinns ur GAL1:: SNR13 och GAL1:: SNR47 stammar som växer på GALAKTOS (GAL) förblev intakt (figur 3a,B; Lanes 3). I motsats, RNA isolerade från GAL1:: SNR13 och GAL1:: SNR47 celler som växer på glukos (GLC) smältes av respektive Dnazymes (figur 3a, B; körfält 4). I båda fallen minskade 25S rRNA band och 5 ' och 3 ' cut-off klyvning produkter (A och B) observerades. Detta indikerar att i GAL1:: SNR13 och GAL1:: SNR47 stammar, 25s rRNA var 2 '-O-metylerat på SNR13-eller SNR47-guidade platser när galaktos användes som kolkälla och dessa snorna uttrycktes. Avsaknaden av 25S rRNA metylering när snR13 eller snR47 uttryck stängdes av på glukos tillåts för DNAzyme-beroende klyvning. Ingen RNA-nedbrytning observerades för prover av vildtyp (figur 3a,B; körfält 1 och 2), eftersom uttrycket snR13 och snR47 är galaktos/glukos oberoende i denna stam. Därför, rRNA var normalt metylerade och så resistenta mot DNAzymes aktivitet.
Sammantaget visar vårt experiment att klyvning aktiviteten av 10-23 (figur 3a) och 8-17 (figur 3b) dnazymes korrelerade med frånvaron av Box C/D snR13 eller snR47, vilket tydligt indikerar att dessa snorna är ansvariga för 25s rRNA 2 '-O-metylering på vissa platser.
Figur 1: DNAzymes och deras RNA-substrat. A) 10-23DNAzymes klyva en purin-pyrimidin (ry) RNA dinukleotid. R i RNA är inte ihopkopplad med DNAzyme, medan Y är ett komplement till R-basen i DNAzyme. Metylering av purin (R) i RNA dämpar DNAzyme-beroende klyvning. (B) 8-17 dnazymes klyva RNA uppströms guanin som är ofullständigt ihopkopplad med den första tymin i dnazyme katalytisk sekvens. Den nukleotid före guanin är inte ihopkopplad och dess metylering skyddar från DNAzyme-beroende klyvning. RNA visas i grått (bortsett från metylering plats), DNAzyme visas i lila. N = någon nukleotid, R = purin: adenin eller guanine, Y = pyrimidin: cytosin eller uracil; CH3-betecknar RNA-metylering. Bas kopplingen i de aktiva sekvenserna i DNAzyme markeras med prickade linjer. En Blue Lightning Bolt markerar klyvning platsen. (C) ett flödesschema som visar stegen i en DNAzyme-beroende analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: DNAzymes inriktning snR13-och snR47-beroende metylering platser i 25S rRNA. (a, B) Browser skärmdumpar visar snR13-beroende (a) och snR47-beroende (B) metylering platser i 25s rRNA (C) 25s rRNA sekvens omgivande snR13-beroende metylering plats (a2281) och 10-23 dnazyme (visas i lila) Designad för att klyva RNA mellan en2281 och U2282. En2281 är inte parad med dnazyme medan U2282 bildar ett par med den första nukleotid från dnazyme aktiv sekvens (markerad med en blå linje). En Blue Lightning Bolt markerar klyvning. (D) 25s rRNA sekvens omgivande snR47-beroende metylering plats (a2220) och 8-17 dnazyme (visas i lila) för att klyva RNA mellan en2220 och G2221. En2220 är inte hybridiseras med dnazyme medan G2221 är ofullständigt ihopkopplad med Tymin (betecknade med en streckad linje). En Blue Lightning Bolt markerar klyvning platsen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: analys av platsspecifik 2 '-O-metylering av 25S rRNA med 10-23 och 8-17 DNAzyme-beroende analys. (A) analys av snR13-beroende 25s rRNA metylering med 10-23 DNAzyme. (B) analys av snR47-beroende 25s rRNA metylering med 8-17 DNAzyme. RNA visualiserades färgning i en denaturerande aguppkom gel. Klyvning produkter A och B är markerade med röda pilar. WT = vildtyp stam; GAL = galaktos, GLC = glukos. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Dnazyme-beroende matsmältning kan användas som en enkel och snabb metod för att analysera platsspecifika RNA 2 '-O-metylering12,13. DNAzymes klyva RNA om nukleotiden uppströms den klyvning platsen inte är metylerat. I motsats till andra metoder, inklusive RNase H-riktad matsmältning, alkalisk nedbrytning eller omvänd Transkription i låga nukleotider koncentration följt av kvantitativ PCR eller sekvensering8,10,11 ,16, dnazyme tillvägagångssätt kräver en enkel DNA oligonukleotid och grundläggande reagens som finns i någon molekylär biologi laboratorium. Dessutom kan DNAzymes användas på ett liknande sätt att analysera RNA pseudouridylation medierad av Box H/ACA snoRNA12, vilket gör dem mångsidiga verktyg för att studera snorna mål.
DNAzyme-beroende metoder begränsas bara av klyvning plats konsensus sekvenser17. 10-23 DNAzymes kan användas för att analysera 2 '-O-metylering endast vid position R av RY dinucleotide, medan 8-17 DNAzymes erkänna modifiering av nukleotid ligger uppströms guanin. Som ett resultat, modifieringar som 2 '-O-metylering av den första nukleotid i dinucleotides guanin-Adenine (GA), adenin-adenin (AA), pyrimidin-adenin (YA) och pyrimidin-pyrimidin (YY) kan inte analyseras. Dessutom bör den låga effektiviteten av DNAzyme-beroende klyvning12 övervägas. Även om vissa DNAzymes klyva RNA nästan helt (figur 3b), många dnazymes bara delvis smälta sina mål (figur 3b). Effektiviteten kan bero på sekvensen som omger klyvning platsen. Till exempel, RNA-regioner med sträckor av samma nukleotid kan påverka korrekt positionering av DNAzyme aktiv sekvens. Dessutom kan RNA-regioner som bildar stark sekundär struktur åter hybridisera och undertrycka DNAzyme bindning till målsekvensen. För att övervinna dessa frågor, cykler av uppvärmning och kylning av 10-23 DNAzyme och dess RNA-substrat kan tillämpas18.
Vi använde DNAzyme metod för att undersöka 2 '-O-metylering av rRNA. Man kan också använda denna teknik för att analysera andra RNA-modifieringar, såsom N6-methyladenosine19. Ribosomal RNA, på grund av dess överflöd, kan analyseras genom elektrofores och klyvning produkter kan visualiseras under UV-ljus. Detta gäller dock inte för mindre riklig RNAs som RNA-polymeras II-genererade kodning RNAs (mRNA) och icke-kodning RNAs (ncRNA). Dessa RNAs kan vanligtvis inte detekteras direkt genom RNA-färgning i Agor eller polyakrylamidgeler. I sådana fall kan DNAzyme-beroende klyvning visualiseras av nordliga blotting, indirekt detekteras av PCR/kvantitativ PCR eller analyseras med kvantitativ PCR med polymeraser (t. ex., KlenTaq DNA-polymeras) som kan diskriminera 2 ′-O-metylerat RNA från ometylerat RNA20,21.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Maya Wilson och Aneika Leney för den kritiska läsningen av manuskriptet. Detta arbete stöddes av en Sir Henry Dale Fellowship finansieras gemensamt av Wellcome Trust och Royal Society (200473/Z/16/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acid phenol | SIGMA | P4682 | |
| Agarose | VWR | A2114 | |
| Ammonium acetate | SIGMA | A1542 | |
| Chlorophorm | Fisher scientific | 10293850 | |
| DNase/RNase free water | Fischer Scientific | 10526945 | |
| DNAzyme | Integrated DNA Technology | Custom oligo DNA | |
| EDTA | SIGMA | E9884 | |
| Ethanol Absolute | Fisher scientific | 10437341 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Formamide | sigma | F9037 | |
| Galactose | SIGMA | G0750 | |
| Gel Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Glucose | SIGMA | G7021 | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | R0561 | |
| HEPES | SIGMA | H3375 | |
| Isoamyl | SIGMA | W205702 | |
| KCl | SIGMA | P9333 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| MnCl2 | SIGMA | 244589 | |
| MOPS | SIGMA | M1254 | |
| NaCl | SIGMA | S7653 | |
| Oxoid Peptone Bacteriological | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| Oxoid Yeast Extract Powder | Thermo Fisher Scientific | LP0021 | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
| SDS | SIGMA | 74255 | |
| Sodium acetate trihydrate | SIGMA | S8625 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| Tris base | SIGMA | TRIS-RO | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt | ||
| 152VR5C01M -80°C freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 250 mL Erlenmeyer flasks | Cole-Parmer | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Combicup VX200 vortex | Appleton Woods | ||
| DS-11 microspectrophotometer | Denovix | ||
| Electrophoresis chamber (20 cm tray) | SIGMA | ||
| FiveEasy F20 pH meter | Appleton Woods | ||
| Gel documentation system | Syngene | ||
| Heraeus Fresco 21 micro centrifuge | Fisher Scientific | ||
| Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | ||
| Mini Fuge Plus mini centrifuge | Starlab | ||
| Mixer HC thermal block | Starlab | ||
| OLS26 Shaking Water Bath | Grant | ||
| PowerPac power supplier | BioRad |
References
- Dieci, G., Preti, M., Montanini, B. Eukaryotic snoRNAs: a paradigm for gene expression flexibility. Genomics. 94 (2), 83-88 (2009).
- Watkins, N. J., Bohnsack, M. T. The box C/D and H/ACA snoRNPs: key players in the modification, processing and the dynamic folding of ribosomal RNA. Wiley Interdisciplinary Review RNA. 3 (3), 397-414 (2012).
- Kufel, J., Grzechnik, P. Small Nucleolar RNAs Tell a Different Tale. Trends in Genetics. , (2018).
- Li, T., Zhou, X., Wang, X., Zhu, D., Zhang, Y. Identification and characterization of human snoRNA core promoters. Genomics. 96 (1), 50-56 (2010).
- Jorjani, H., et al. An updated human snoRNAome. Nucleic Acids Research. 44 (11), 5068-5082 (2016).
- Hubbard, T. J., et al. Ensembl 2009. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D690-D697 (2009).
- Makarova, J. A., Kramerov, D. A. SNOntology: Myriads of novel snoRNAs or just a mirage? BMC Genomics. 12, 543 (2011).
- Yu, Y. T., Shu, M. D., Steitz, J. A. A new method for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules. RNA. 3 (3), 324-331 (1997).
- Decatur, W. A., Liang, X. H., Piekna-Przybylska, D., Fournier, M. J. Identifying effects of snoRNA-guided modifications on the synthesis and function of the yeast ribosome. Methods in Enzymology. 425, 283-316 (2007).
- Dong, Z. W., et al. RTL-P: a sensitive approach for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules. Nucleic Acids Research. 40 (20), e157 (2012).
- Birkedal, U., et al. Profiling of ribose methylations in RNA by high-throughput sequencing. Angewandte Chemie International Edition, England. 54 (2), 451-455 (2015).
- Buchhaupt, M., Peifer, C., Entian, K. D. Analysis of 2'-O-methylated nucleosides and pseudouridines in ribosomal RNAs using DNAzymes. Analytical Biochemistry. 361 (1), 102-108 (2007).
- Grzechnik, P., et al. Nuclear fate of yeast snoRNA is determined by co-transcriptional Rnt1 cleavage. Nature Communication. 9 (1), 1783 (2018).
- Piekna-Przybylska, D., Decatur, W. A., Fournier, M. J. New bioinformatic tools for analysis of nucleotide modifications in eukaryotic rRNA. RNA. 13 (3), 305-312 (2007).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18 (10), 3091-3092 (1990).
- Maden, B. E. Mapping 2'-O-methyl groups in ribosomal RNA. Methods. 25 (3), 374-382 (2001).
- Santoro, S. W., Joyce, G. F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proceedings of the National Academy of Science, U. S. A. 94 (9), 4262-4266 (1997).
- Hengesbach, M., Meusburger, M., Lyko, F., Helm, M. Use of DNAzymes for site-specific analysis of ribonucleotide modifications. RNA. 14 (1), 180-187 (2008).
- Sednev, M. V., et al. N(6) -Methyladenosine-Sensitive RNA-Cleaving Deoxyribozymes. Angewandte Chemie International Edition, England. 57 (6), 15117-15121 (2018).
- Aschenbrenner, J., Marx, A. Direct and site-specific quantification of RNA 2'-O-methylation by PCR with an engineered DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 44 (8), 3495-3502 (2016).
- Lee, K. W., Bogenhagen, D. F. Assignment of 2'-O-methyltransferases to modification sites on the mammalian mitochondrial large subunit 16 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (36), 24936-24942 (2014).
