Summary
Qui viene descritto un protocollo per il campionamento continuo del sangue durante l'imaging PET/T dei ratti per misurare la funzione di input arterioso (AIF). Vengono dimostrati la cateterizzazione, la calibrazione e l'impostazione del sistema e l'analisi dei dati della radioattività sanguigna. I dati generati forniscono parametri di input per la successiva modellazione bio-cinetica.
Abstract
Per l'analisi quantitativa e la modellazione biocinetica della tomografia a emissione di positroni/dati di tomografia computerizzata (PET/CT), la determinazione della concentrazione temporale temporale temporale temporale temporale-attività nota anche come funzione di input arterioso (AIF) è un punto chiave, in particolare per la caratterizzazione dei modelli di malattie animali e l'introduzione di radiotracciatori di recente sviluppo. La conoscenza della disponibilità di radiotracer nel sangue aiuta a interpretare i dati PET/CT-derivati dell'attività tissutale. A tale scopo, si consiglia di misurare l'AIF durante l'imaging PET/T. A differenza del campionamento manuale del sangue e degli approcci derivati dall'immagine, il campionamento continuo del sangue online presenta diversi vantaggi. Oltre alla perdita di sangue ridotta al minimo, c'è una risoluzione migliorata e una precisione superiore per la misurazione dell'attività sanguigna. Tuttavia, il principale inconveniente del prelievo di sangue online è la preparazione costosa e dispendiosa in termini di tempo per cateterizzare i vasi femorali dell'animale. Qui, descriviamo un flusso di lavoro facile e completo per la cateterizzazione e il campionamento continuo del sangue durante la piccola imaging PET/CT animale e lo confrontamo con il campionamento manuale del sangue e un approccio derivato dall'immagine. Utilizzando questo flusso di lavoro altamente standardizzato, viene dimostrata ladeterminazione dell'AIF fluorodeossiassia ([18 F]FDG). Inoltre, questa procedura può essere applicata a qualsiasi radiotracciatore in combinazione con diversi modelli animali per creare una conoscenza fondamentale delle caratteristiche cinetica e del modello tracciante. Ciò consente una valutazione più precisa del comportamento dei prodotti farmaceutici, sia per gli approcci diagnostici che terapeutici nella ricerca preclinica delle malattie oncologiche, neurodegenerative e miocardiche.
Introduction
La tomografia a emissione di positroni/tomografia computerizzata (PET/CT) è una tecnologia di imaging nucleare che consente la visualizzazione dei processi metabolici nel corpo in seguito all'iniezione di un ligando etichettato radioattivamente, chiamato anche tracciante. Mentre il ligando è una molecola che è coinvolta in una via metabolica o si rivolge alle proteine della superficie cellulare, l'etichetta radioattiva è un radionuclide che emette positrone. I raggi gamma sono emessi indirettamente dal decadimento del positrone e consentono di rilevare la sua distribuzione nell'organismo con rivelatori PET extracorporei. In questo modo, diverse molecole cellulari possono essere mirate: recettori e trasportatori di neurotrasmettitori, processi metabolici come glicolisi o proteine mitocondriali come la proteina traslocatore 18 kDa (TSPO) per rilevare le cellule glia attivate.
Nella ricerca preclinica, il PET/TC è un metodo interessante per studiare i processi biochimici in modo non invasivo in vivo, consentendo così studi longitudinali. I dati PET/CT supportano l'analisi dei meccanismi della malattia, la valutazione delle caratteristiche e della farmacocinetica dei nuovi farmaci e la convalida di entrambi i radiotracciatori attuali e nuovi per la ricerca traslazionale.
Durante le analisi PET/T È possibile definire tre stati di tracciante (esempio del modello di compartimento a 2 tessuti): in primo luogo, il tracciante scorre all'interno del sangue dopo la sua applicazione (stato 1; conc.[sangue]). In secondo luogo, entra nel tessuto attraverso il letto capillare e può esserci liberamente muoversi all'interno dello spazio extracellulare o è inspecifico legato a diverse strutture cellulari o extracellulari (stato 2; conc.[non spec]). In terzo luogo, il tracciante può essere specificamente legato (con o senza intrappolamento metabolico) alla sua molecola bersaglio (stato 3, conc.[spec]). Tutti questi processi dinamici tra i compartimenti sono in una certa misura bidirezionali e i processi di diffusione sono descritti da costanti di frequenza (K1, k2, k3 e k4). Mentre la concentrazione del tracciante nel sangue (cioè lo stato 1) è chiamata "Input", la concentrazione di tracciante inspecifico e specificamente legato (cioè stato 2 e stato 3) è chiamata "Output" e può essere derivata direttamente dall'immagine PET. Questa relazione fisiologica può essere visualizzata nel modello di compartimento a 2 tessuti (Figura 1).
Figura 1 : Il modello compartimentale a due tessuti. Vengono visualizzate le condizioni fisiologiche dei tre diversi stati di tracciante e i processi dinamici tra di essi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nel caso ideale, il conc.[spec] è proporzionale alla concentrazione della sua molecola bersaglio. Tuttavia, l'output della misura PET/CT è la somma di conc.[spec] e conc.[unspec]. Per determinare la conc.[spec] nella regione di interesse, in parallelo viene determinato il conc. Utilizzando equazioni matematiche appropriate è ora possibile calcolare il conc. Tuttavia, in molti casi, tale regione di riferimento priva della proteina bersaglio non è disponibile1,2. In questi casi, il conc.[sangue] puòessere utilizzato per determinare il conc. Dal momento che il conc.[sangue] varia a causa di diversa distanza del fegato e dei reni, escrezione, flusso sanguigno, diversa penetrazione della barriera rom-sangue cerebrale e fattori correlati alla malattia3, l'attuale gold standard è quello di misurare il conc. sangue in parallelo alla scansione PET/TC mediante campionamento continuo del sangue. Questo dà la funzione di input arterioso (AIF), che è definita come conc.[sangue] nel tempo4. Da notare che l'esecuzione di un campionamento continuo del sangue è considerato tecnicamente altamente impegnativo, soprattutto in piccoli animali come ratti o topi5.
Qui, forniamo un protocollo facile e pratico per campionare continuamente il sangue dai ratti attraverso uno shunt arteriovenoso (a-v) tra la vena femorale e l'arteria. Accoppiati a un sistema di rivelatore-pompa disponibile in commercio, siamo in grado di generare un AIF continuo in tempo reale durante la scansione dinamica [18F]fluorodeoxyglucose ([18 F]FDG)-PET/CT nei ratti e confrontarla con approcci alternativi. L'imaging PET/CT è stato eseguito in ratti sprague dawley maschi all'età di 4 mesi, con un peso medio di 462 g e 33 g (media deviazione standard) utilizzando uno scanner PET/CT multimodalità.
Poiché durante la serie di misurazioni viene utilizzata un'ampia gamma di dispositivi (calibratore di dose, campionatore di sangue online, PET/CT e contatore dei pozzi), è necessaria una procedura di controllo della qualità denominata taratura incrociata per verificare l'accuratezza quantitativa di tutti i sistemi e per compensare le differenze. La calibrazione incrociata nel contesto del campionamento del sangue online significa che il tasso di conteggio per una determinata concentrazione di attività misurata in immagini PET corrette può essere convertito nella concentrazione misurata con il sistema di twilite per la stessa concentrazione. Pertanto, è stata stabilita una procedura di calibrazione incrociata tra PET/TC, sistema di campionamento del sangue e contatore del pozzo.
Questa metodologia altamente standardizzata fornisce un potente approccio per quantificare i processi metabolici e cellulari nella ricerca preclinica su piccoli animali ed è un modo elegante per migliorare l'affidabilità e la riproducibilità dell'AIF. L'AIF può quindi essere utilizzato per quantificare il tracciante specificamente associato nel tessuto nei dati preclinici PET/TC utilizzando la modellazione bio-cinetica.
Protocol
Tutti i trattamenti e gli esperimenti degli animali sono stati approvati dal Comitato di Ricerca Animale dello Stato del Meclemburgo-Pomerania Occidentale (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, approvazione: 03.04.2018). Gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con le linee guida IN SONO state eseguite.
NOTA: Gli animali sono stati tenuti in condizioni standard (ciclo di 22 gradi centigradi, 12 h giorno e notte) con acqua e cibo ad libitum. Tutte le attrezzature necessarie per la preparazione del sistema di shunt, la procedura operativa e le misure effettive sono elencate nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione e procedura chirurgica per la cateterizzazione dell'animale
- Veloce l'animale per almeno 12 h con libero accesso all'acqua. Per l'anestesia, mettere il ratto in una camera di induzione e riempirlo continuamente di miscela di ossigeno/isoflurane. Per l'avvio utilizzare 2.5-3.5% isoflurane e per la manutenzione 1.5-3.0% (velocità di flusso di 1.2-1.5 L/min).
NOTA: Il digiuno è necessario per gli studi che utilizzano il tracciante [18F]FDG ma non per altri traccianti. La misurazione dei livelli ematici del glucosio utilizzando estrazioni ematiche manuali descritte nella sezione 4 è consigliata per garantire valori stabili o per correggere nella modellazione cinetica. - Posizionare il ratto anetizzato in posizione dorsale su un tappetino riscaldante, sotto il microscopio chirurgico e aggiungere unguento veterinario sui suoi occhi. Monitorare e mantenere la temperatura corporea del ratto in modo continuo durante l'esperimento (37 x 0,5 gradi centigradi) con una sonda rettale.
- Nastro le gambe del ratto alla superficie di lavoro per tenere le gambe in posizione. Disinfettare il sito operativo con un disinfettante mucosale e radere la gamba e il cavallo (lato operazione) del ratto. Terminare con una pulizia finale con il disinfettante.
- Fare un'incisione di circa 20 mm utilizzando pinze chirurgiche e forbici all'inguine del ratto. Dissezionare gli strati sottili della pelle ed esporre la vena femorale, l'arteria e il nervo con le micro pinze. Mettere due filamenti fini sotto ogni vena femorale e arteria.
- Sigillare la vena e l'arteria con ogni filamento distale e tenere sotto tensione con un morsetto bulldog.
Utilizzare i filamenti di sutura prossimali per far tensionare la nave utilizzando i morsetti bulldog (senza un nodo). - Bloccare la vena con un morsetto aneurisma prossimale, ma 2-3 mm disfal dalla sutura con il morsetto bulldog. Utilizzare le forbici corneali per fare una piccola incisione nella vena (1/3 del diametro) e rimuovere il sangue che perde con uno scambio di cotone sterile. Dilatare la vena con una pinze opache e tenerla aperta. Inserire il catetere affilato (diametro interno [ID]: 0,58 mm, diametro esterno [OD]: 0,96 mm) nella vena e spingerlo in direzione prossimale, fino alla clip aneurisma.
- Aprire la clip aneurisma e spingere ulteriormente il catetere in direzione prossimale (circa 2-3 cm), se il catetere è posizionato a destra, il sangue scorrerà nel catetere. Fissare il catetere con la sutura prossimale facendo due nodi; se necessario, mettere un'ulteriore sutura intorno alla vena e al catetere. Controllare la funzionalità del catetere vampate di calore e aspirando con una siringa di insulina (30 G di ago) riempita con 100 l di soluzione salina eparanata (50 unità/mL).
- Posizionare il catetere nell'arteria ripetendo i passaggi 1.6 e 1.7.
- Quando entrambi i cateteri sono posizionati correttamente, chiudere la gamba con le suture e portare l'animale al PET/CT.
NOTA: Prestare il più attenzione possibile con i cateteri durante il trasporto dell'animale, altrimenti potrebbe verificarsi lo spostamento del catetere.
2. Configurazione del sistema di shunt
Figura 2 : schema dell'impostazione della misurazione. (A) Disegno schematico dell'impostazione di misurazione. (B) Foto del sistema di shunt collegato con il rilevatore di twilite, pompa peristaltica e diversi tipi di connettori. Il corso temporale della radioattività nel sangue di un ratto viene rilevato mentre l'animale (1) viene scansionato nel PET/CT (2). Pertanto il catetere arterioso (a) e venoso (b) è collegato al sistema di pompa del rivelatore tramite pezzi dell'adattatore (connettore arancione, connettore blu e connettore verde). Il sangue arterioso viene quindi pompato dal catetere arterioso attraverso il rivelatore (3) a una pompa peristale (4) e di nuovo nel corpo attraverso il catetere venoso. Una valvola a 3 vie (7) è integrata nel sistema di tubi per eseguire l'iniezione del tracciante, le estrazioni manuali di sangue e il risciacquo. Un pezzo a T (8) viene assemblato per iniettare attività. Il rilevatore è collegato a un computer per visualizzare, calibrare e correggere i dati ematici continui. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Tagliare 6 parti del tubo in politene foro fine (FBPT) (ID: 0,58 mm, OD: 0,96 mm) con una lunghezza di c - 735 mm; e 100 mm; f : 171 mm, g , 875 mm; h 90 mm e i 75 mm (Figura2). Tagliare 8 parti dei tubi pompa in silicone (nero/nero/nero, ID: 0,76 mm, OD: 2,48 mm) con una lunghezza di circa 20 mm.
- Posizionare i connettori di riduzione (da ID 2,5 mm a ID 1,5 mm) su entrambe le estremità del tubo pompa in silicone d (giallo/blu/giallo, ID: 1,52 mm, OD: 3,20 mm). Mettere una parte preparata da 20 mm dei tubi in silicone (nero/nero/nero) sull'altra estremità dei connettori di riduzione utilizzati (vedere connettore blu nella Figura2).
- Posizionare la parte preparata c dell'FBPT nel connettore assemblato blu su un'estremità del tubo pompa in silicone d (giallo/blu/giallo) e la parte preparata e del FBPT nel connettore assemblato blu sul l'altra estremità. Mettere una parte preparata da 20 mm dei tubi in silicone (nero/nero/nero) alle estremità di due t-pezzi 5 e 6 (ID connettore T tubo: 1,5 mm; vedere connettore verde nella Figura 2).
- Collegare l'estremità libera della parte e della FBPT al lato sinistro del connettore assemblato verde (5) e posizionare la parte preparata f del FBPT sul lato opposto del connettore verde (5). Posizionare l'estremità libera della parte f della FBPT sul lato sinistro del connettore assemblato verde (6) e posizionare la parte preparata g del FBPT sul lato opposto del connettore verde (6). Aggiungere la parte preparata h dell'FBPT all'estremità libera del connettore assemblato verde (5) e la parte preparata i dell'FBPT all'estremità libera del connettore assemblato verde (6).
- Collegare un combi-stopper ad un ago ipodermico (G 23 x 1/4''/0,60 mm x 30 mm) e aggiungerlo a una valvola a tre vie. Posizionare la valvola a tre vie preparata con l'ago all'estremità libera della parte h dell'FBPT. Collegare un combi-stopper ad un ago ipodermico e posizionare l'ago all'estremità libera della parte i del FBPT.
NOTA: prima di iniziare il prelievo del sangue online, vedere la sezione 5. - Mettere le estremità libere della parte c e g della FBPT in un becher da 100 mL riempito con 20 mL di soluzione salina eparana (50 unità/mL). Avviare la pompa peristaltica con una portata di 1,52 mL/min in modo che il sistema di shunt sia completamente riempito con la soluzione salina fisiologica. Successivamente impostare tre morsetti a forbice alle estremità della parte c e g e nel mezzo della parte i della FBPT.
- Rilasciare i morsetti a forbice dalla parte c e g della FBPT. Collegare il catetere arterioso a all'estremità libera della parte c del FBPT e collegare il catetere venoso b all'estremità libera della parte g del FBPT (vedere connettore arancione in Figura 2).
3. Acquisizione e ricostruzione delle immagini
- Posizionare l'animale in posizione prona sulla valvola del letto navetta (70 mm). Controllare la respirazione del ratto e mantenere la temperatura corporea a 37 : 0,5 gradi centigradi utilizzando un pad di riscaldamento e una sonda rettale durante l'acquisizione dell'immagine. Spostare il letto navetta nella posizione del letto esteso per l'iniezione (pre-acquisizione) e collegare i cateteri inseriti al sistema di shunt.
- Tenere l'animale in anestesia con isoflurane (2,5% isoflurane in ossigeno, portata 1,2-1,5 L/min) tramite un cono naso.
- Avviare la pompa peristaltica con una portata di 1,52 mL/min per riempire il sistema di shunt con il sangue dell'animale. Spostare il letto navetta al centro del campo visivo dell'anello di rilevamento PET e avviare il sistema di campionamento del sangue online (vedere la sezione 5).
- Avviare il flusso di lavoro PET/CT utilizzando i parametri descritti nella sezione 3.5 dopo 60 s e successivamente iniettare una dose di circa 22 MBq [18F]FDG in un volume di circa 0,5 x 0,1 mL per via endovenosa tramite il pezzo T. Svuotare il pezzo a T con circa 150 gradi l di soluzione salina eparinizzata in seguito.
- Acquisire un PET dinamico di oltre 60 min e una TAC alla fine dell'imaging PET.
- Per l'acquisizione delle emissioni di PET, impostare 3600 s (60 min) nell'opzione acquire by time. Selezionare F-18 come isotopo di studio e utilizzare 350-650 keV come livello di energia e 3.438 ns come finestra di temporizzazione.
- Per l'acquisizione CT, selezionare la scansione attenuazione nell'opzione di acquisizione. Nel campo delle impostazioni di proiezione, scegliere 120 proiezioni per una metà rotazionetotale. Per le impostazioni di visualizzazione del campo visivo (FOV, Field of View) e della risoluzione, selezionare basso come ingrandimento e 4 x 4 come rilegatura con lunghezza di scansione assiale di 275 mm e 3328 px come dimensione CCD transassiale. Nel campo delle impostazioni di esposizione, impostare 500 A per corrente, 80 kV per la tensione e 180 ms per il tempo di esposizione.
- Per l'istogramma delle emissioni PET, impostare una serie di 20 fotogrammi (6 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 300 s e 1 x 1800 s) come telaio dinamico. Selezionare Sottrarre come ritardi. Scegliere nel campo delle impostazioni avanzate 128 come larghezza del sinogramma, 3 come intervallo, 79 come differenza ad anello e correzione del tempomorto.
- Per la ricostruzione PET, utilizzare la massimizzazione delle aspettative dei sottoinsiemi ordinati bidimensionali (2D-OSEM) con un sinogrammadi generazione, applicazione e salvataggio a dispersione, 4 iterazioni e Fourier come algoritmodi ricostruzione. Selezionate 128 x 128 come dimensione della matrice e utilizzate 1 come zoom immagine,tutte come fotogrammi e tutte come segmenti.
4. Procedura di campionamento manuale del sangue
- Eseguire il campionamento manuale del sangue 30 s, 60 s, 90 s, 600 s e 1800 s dopo aver avviato l'acquisizione di imaging.
NOTA: L'aumento del numero di estrazioni manuali di sangue, soprattutto entro il primo minuto dopo l'iniezione del tracciante, è altamente raccomandato, se possibile. Pertanto, il volume del campione di sangue deve essere ridotto a 20-30 l per campione6.- Aprire la prima valvola a tre vie e raccogliere 100 l di sangue arterioso in una raccolta di sangue capillare EDTA tubo 30 s dopo l'iniezione del tracciante. Ripetere l'operazione per gli altri punti temporali. Determinare il peso del tubo vuoto e del tubo pieno di sangue.
- Misurare l'attività (conteggi/unità di tempo) dell'intero sangue per 180 s in un contatore di pozzo, che viene successivamente incrociato calibrato per ottenere i dati in kBq/mL. Registrare l'ora di inizio della misurazione del contatore del pozzo. Calcolare l'attività del sangue intero per ogni punto temporale del campionamento del sangue manuale in kBq/mL, applicare la correzione del decadimento e trasferire i dati in una curva di attività temporale.
5. Procedura del prelievo di sangue online
- Posizionare il tubo nel rilevatore utilizzando la guida del tubo. Avviare il software del campionatore del sangue (ad esempio, PSAMPLE) e aprire l'interfaccia di acquisizione. Assicurarsi che il computer della configurazione del campionamento del sangue online e del PET/CT sia sincronizzato in base all'ora.
- Premere il pulsante di avvio esattamente 60 s prima che il tracciante venga iniettato per acquisire dati sufficienti per la correzione in background. Salvare i dati grezzi tramite il pulsante Salva nel database PMOD dopo la misurazione.
- Per la correzione e la calibrazione dei dati ematici online, passare all'interfaccia di correzione. Attivare la correzione decadimento e selezionare 18 F. Definire l'ora di inizio dell'acquisizione dell'immagine e abilitare il pulsante media per eseguire la correzione dello sfondo. Attivare la calibrazione e digitare il fattore di calibrazione precedentemente determinato (vedere la sezione 7.1).
- Salvare i dati ematici corretti e calibrati utilizzando il pulsante Salva TAC e scegliere il file blood.crv. Questo file può quindi essere caricato come curva di input del sangue intero nello strumento di modellazione cinetica ed è possibile eseguire la modellazione cinetica. Disaccoppiare i cateteri dal sistema di shunt caporale extra.
- Staccare l'animale dallo scanner PET/CT e eutanasia con pentobarbital.
NOTA: In questo esperimento, gli animali sono stati eutanasia dopo le misurazioni in quanto i cervelli sono stati utilizzati per analisi in vitro nella progettazione sperimentale. Con questa configurazione, le misurazioni ripetute negli studi longitudinali sono implementabili anche7. Utilizzare un sistema di tubi completamente nuovo per il prossimo animale.
6. Funzione Input derivata dall'immagine
- Aprire lo strumento Fusibile su PMOD. Caricare l'immagine PET come input e la CT come riferimento. Fare clic su già corrispondente.
- Aprire lo strumento voxel of interest (VOI). Posizionare il cursore all'interno dell'aorta ascendente nella CT. Fare clic su VOI sferica predefinito. Definire un raggio di esattamente 0,7 mm. Estrarre le informazioni sull'attività temporale con il pulsante statistico VOI e copiare i valori medi negli Appunti.
7. Procedura di calibrazione incrociata del sistema twilite, PET/CT e contatore pozzi
- Twilite-PET/CT-calibrazione
NOTA: il flusso di lavoro presentato per la calibrazione della twilite è in parte basato sulle procedure descritte nel manuale di riferimento del modulo PSAMPLE di PMOD.- Riempire una siringa con circa 100 MBq di [18F]FDG. Misurare l'attività esatta AF con un calibratore di dose calibrato e documentarlo insieme alla data e all'ora della misurazione e al volume della siringa completa. Il tempo registrato è il punto temporale di riferimento per tutte le correzioni di decadimento da eseguire.
- Riempire un becher con 500 mL di acqua di rubinetto. Il volume esatto è determinato dal metodo di pesatura. Misurare il peso del becher vuoto con una bilancia di precisione appropriata e calibrata (almeno precisione classe II). Riempire il becher con l'acqua del rubinetto e misurare il peso mf del becher completo.
- Calcolare il volume Vb del becher utilizzando la differenza tra la massa e la densità dell'acqua del rubinetto (r - 0,998 g/mL a 20 gradi centigradi):
- Iniettare il [18F]FDG nel becher riempito e riempire la siringa vuota nel suo volume originale con acqua di rubinetto inattiva e misurare l'attività AE della siringa riempita nel calibratore della dose. La concentrazione di attività cb della soluzione
nel becher è data da , che dovrebbe essere di circa 200 kBq/mL. - Riempire un tubo centrifuga conico da 50 mL con la soluzione del becher (evitare grandi bolle d'aria) e posizionarlo centralmente nel campo visivo dello scanner PET/CT. Riempire un catetere identico al tipo utilizzato nell'esperimento di imaging PET/CT e posizionarlo nella guida del tubo del sistema di twilite. Riempire il catetere con la soluzione di tracciamento dal becher utilizzando la pompa peristaltica.
- Iniziare la misurazione della curva di attività temporale come descritto nella sezione 5, utilizzando lo stesso parametro per il tempo di integrazione e riincitare come nell'esperimento, senza una guida del catetere all'interno della testina di misura. Questo passaggio garantisce l'acquisizione di dati sufficienti per un'adeguata correzione in background. Dopo 2 min, senza interrompere l'acquisizione dei dati del sistema twilite, posizionare la guida del catetere con il tubo riempito nella testina di misurazione e continuare l'acquisizione dei dati per circa 5 min.
- Avviare un'acquisizione PET di 10 min del tubo di centrifuga conica conical da 50 mL in parallelo, seguita da un'acquisizione standard di CT per la correzione dell'attenuazione. Ricostruire un'immagine PET statica del tubo di centrifuga conical da 50 mL utilizzando lo stesso algoritmo di ricostruzione PET e gli stessi parametri descritti nella sezione 3. Utilizzare uno strumento di imaging post-elaborazione (ad esempio, PVIEW) e posizionare una VOI cilindrica che copre circa il 70% del volume all'interno delle immagini PET ricostruite del tubo di centrifuga conica da 50 mL. Estrarre la concentrazione media dell'attività cPET in kBq/mL all'interno del VOI.
- Tornare al software del campionatore del sangue e utilizzare la modalità di calibrazione per correggere il TAC acquisito per il decadimento, la frazione di ramificazione e lo sfondo. Aggiungere tutte le informazioni necessarie per la concentrazione di nuclide, la concentrazione dell'attività e l'ora di inizio dell'acquisizione PET. Internamente, il software estrae il tasso di conteggio misurato con il sistema twilite (CRtwilite) e calcola il fattore di calibrazione incrociata per IL sistema PET e twilite (CFPET/twilite):
NOTA: È importante che lo stesso isotopo venga utilizzato sia per la calibrazione che per gli esperimenti PET/CT, poiché la frazione di ramificazione varia tra i diversi isotopi, che viene corretto nel processo di ricostruzione del PET. Questa procedura deve essere ripetuta regolarmente in termini di controllo di qualità, se vengono modificati importanti componenti del sistema (ad esempio, tubi, parametri di acquisizione e ricostruzione) e dopo i lavori di riparazione.
- Calibrazione contatore PET/CT-well
- Per calcolare il fattore di calibrazione CFben contatore del contatore pozzo, utilizzare la stessa soluzione di attività che è stato prodotto nel becher per la calibrazione del sistema twilite. Attendere circa 6 h per consentire la riduzione di attività specifiche di decadimento per ridurre al minimo gli effetti del tempo morto del rilevatore scintillatore del contatore pozzo. Coperchio del becher per evitare l'evaporazione.
- Calcolare l'esatta differenza di orario rispetto al punto di riferimento e determinare l'effettiva concentrazione di attività cb(t ) della soluzione del becher mediante decadimento correggendo la concentrazione di attività originale. Pipette volumi predefiniti (campioneV) identici al volume dei campioni di sangue misurati all'interno degli esperimenti (ad es., 200 l), dal becher a cinque tubi di blocco sicuro. Misurare l'attività di ciascuno dei cinque tubi con il contatore del pozzo per 180 s.
NOTA: se il coefficiente di variazione per una singola misurazione è superiore all'1%, il tempo di misurazione deve essere aumentato. Registrare la frequenza di conteggio misurata in conteggi al minuto [cpm] per ogni tubo e l'ora di inizio della misurazione. Eseguire una correzione di decadimento. - Calcolare il fattore di calibrazione CFbencontatore per ogni misura dividendo il decadimento corretto conteggio tasso CR bencontatore del contatore pozzi osta dal decadimento corretto concentrazione di attività del becher cbecher (t):
- Media dei cinque fattori di calibrazione per ottenere il fattore di calibrazione medio.
nel becher è data da , che dovrebbe essere di circa 200 kBq/mL.
Representative Results
La configurazione del sistema di shunt viene visualizzata nella Figura 2. I risultati rappresentativi dei dati di campionamento del sangue continuo rispetto ai dati di campionamento ematico manuale in tre ratti selvatici in un arco di tempo di 30 min sono presentati nella Figura 3A, C. All'inizio del campionamento continuo del sangue, un picco iniziale (massimo di concentrazione di radioattività) può essere visto a 5 s dopo l'iniezione del tracciante. Successivamente, l'attività nel sangue diminuisce rapidamente e raggiunge un altopiano a circa 15 min. Nei dati di campionamento ematico manuale il picco rilevato è più piccolo e l'altopiano non è facile da definire (Figura 3A,C). Il confronto tra il campionamento continuo del sangue e i dati derivati dall'immagine viene visualizzato nella figura 3B,D. Nei dati derivati dall'immagine, il picco e il punto di partenza dell'altopiano sono chiaramente visibili, tuttavia il massimo del picco è più piccolo rispetto ai dati di campionamento del sangue continuo per tutti gli animali (Figura 3B,D).
Un risultato non ottimale del campionamento continuo del sangue con la nostra configurazione è illustrato nella Figura 3E,F. All'inizio del campionamento continuo del sangue, non era possibile alcuna acquisizione di dati entro i primi 3,5 min a causa della coagulazione del sangue. Scollegando il sistema di tubi a arancione del connettore e galleggiando con soluzione salina emainizzata, il flusso nel sistema tubo è stato riavviato e la misurazione è continuata. Un picco può essere visto a circa 4 min, che non registra il massimo di radioattività nel sangue (Figura 3E,F). Il campionamento del sangue manuale (Figura 3E) e le analisi ricavate dall'immagine (Figura 3F) erano ancora possibili e comparabili ai risultati corretti.
Figura 3 : Risultati rappresentativi del prelievo continuo del sangue rispetto al prelievo ematico manuale. Vengono mostrate le funzioni di input arterioso tipiche derivate dal campionamento continuo del sangue rispetto al campionamento manuale del sangue (colonna sinistra) e al campionamento continuo del sangue rispetto all'approccio derivato dall'immagine (colonna destra). I gruppi di esperti A-D dimostrano i risultati della corretta attuazione del protocollo in due diversi animali. I pannelli E e F illustrano un risultato non ottimale della misurazione. Tutti i dati mostrati sono stati corretti per il fattore di calibrazione incrociata e lo sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
I risultati presentati sono estratti da un progetto su larga scala sull'attività neuronale in un modello animale transgenico della malattia di Huntington rispetto ai ratti di tipo selvatico. Complessivamente sono stati cateterizzati 30 ratti transgenici e selvatici ed è stato eseguito il campionamento del sangue manuale e online in parallelo a[18F]FDG-PET/CT. Tre AIF di ratti wildtype sono mostrati qui per dimostrare la gamma dei possibili esiti del protocollo. I risultati del progetto completo sui cambiamenti dell'attività neuronale in un modello animale della malattia di Huntington saranno pubblicati altrove.
Il metodo qui descritto consente un campionamento continuo del sangue rapido e preciso in una grande coorte e fornisce un AIF senza spazi per la modellazione cinetica dei dati PET/CT dinamici nei piccoli animali. Viene generata una circolazione sanguigna esterna per rilevare l'effettiva attività temporale nel sangue degli animali; di conseguenza si evita una perdita di sangue. La procedura chirurgica si basa su Jespersen et al.8 ed è stata modificata per soddisfare le esigenze di campionamento del sangue arterioso durante le misurazioni PET/TC. Il sistema di shunt è stato convalidato da Weber etal. Con la configurazione qui usato usato, un volume di sangue esterno di circa 1,1 mL è in esecuzione attraverso il sistema di rilevatore-pompa. Un ratto di 4 mesi ha un volume sanguigno totale di circa 30 mL. Il diametro della vena femorale e dell'arteria è di circa 0,45-0,6 mm10 e deve essere un po 'inamidata per inserire il catetere utilizzato.
L'AIF può anche essere misurato attraverso sporadica raccolta manuale del sangue o essere ricostruito dai primi tempi delle immagini PET stesse (derivata dall'immagine). Entrambi gli approcci sono stati eseguiti con i dati qui presentati e confrontati con il campionamento continuo del sangue.
Rispetto al campionamento manuale del sangue, con il campionamento del sangue online una risoluzione temporale notevole (qui: 1800 punti dati per 30 min) diventa possibile. Le estrazioni manuali di sangue (qui: 5 punti dati per 30 min) sono limitate al volume sanguigno presente nel piccolo animale, in quanto questi campioni non vengono pompati nella circolazione dell'animale. Inoltre, un intervallo massimo di 10-15 s è tecnicamente attuabile e le informazioni importanti per la modellazione cinetica sono mancate. Questo può essere visto anche nei dati presentati, come una differenza nel numero massimo rilevato di campionamento continuo e manuale del sangue è evidente (Figura 3A,C,E). Con il campionamento del sangue online il picco rilevato era superiore rispetto alla funzione di input derivata dall'immagine dell'aorta ascendente11 (Figura 3B,D,F). La funzione di input derivata da Imaged è limitata alla risoluzione spaziale degli scanner PET, che si traduce in effetti di volume parziali12 ed è influenzata dagli intervalli di tempo ricostruiti.
Un vantaggio generale di questa procedura di campionamento continuo del sangue è che il tracciante può essere applicato tramite il catetere, che è meno incline al disturbo rispetto all'iniezione attraverso la vena posteriore della coda laterale. Tenete a mente che il tracciante deve essere applicato in un volume moderato per evitare che il tracciante rimanga all'inizio del sistema di tubi. Per garantire che nessuna attività rimanga nel volume morto del pezzo a T, viene lavato con soluzione salina eparinizzata in seguito. Inoltre, si consiglia l'utilizzo di una pompa di infusione in quanto consente la regolazione della velocità dell'iniezione del tracciante e può contribuire ad un'acquisizione più coordinata del picco massimo di radioattività con campionamento manuale del sangue13.
Esistono alcune possibili difficoltà che potrebbero verificarsi durante l'elaborazione del protocollo e possono essere gestite dalla risoluzione dei problemi seguente. Una posizione non ottimale dei cateteri potrebbe portare ad un'esecuzione incompleta del protocollo, quindi assicurarsi che siano fissati accuratamente con la sutura prossimale e che il catetere sia spinto 2-3 cm propimali nel recipiente. Inoltre, è possibile utilizzare l'adesivo di fibrina. Anche la formazione di trombi può ostigare i cateteri. Questo può essere gestito aumentando la concentrazione di eparina e il successivo lavaggio dei cateteri o del sistema di tubi. Tale risultato non ottimale a causa di intasamento dei cateteri è mostrato nei risultati, il picco massimo è mancato (Figura 3E). Un altro punto critico per quanto riguarda la protezione e il benessere degli animali è la lunghezza del flusso sanguigno extracorporeo. Si consiglia quindi di ridurre al minimo la lunghezza del sistema di tubi.
Quando viene eseguito il campionamento del sangue, è necessario prendere in considerazione tre correzioni dell'AIF risultante. In primo luogo, la correzione del plasma. I traccianti equilibrati tra plasma e cellule del sangue, principalmente eritrociti. A seconda della velocità di questi processi di diffusione, il tracciante disponibile è presente principalmente nel plasma. Per alcuni traccianti, il rapporto tra plasma e sangue intero deve essere considerato, come quelli più lipofilici. In questi casi, l'attività plasmatica deve essere determinata. Se si usa [18F]FDG, non è necessario centrifugiare il sangue per determinare l'attività plasmatica, in quanto esegue un elibrismo molto rapido tra plasma e globuli rossi e la disponibilità di [18F]FDG nel plasma è simile a quella dell'intero sangue. In secondo luogo, la correzione dei metaboliti. Molti traccianti sono metabolizzati nel sangue intero e alcuni di questi metaboliti sono ancora etichettati radioattivamente14. Questa frazione è presente nell'AIF, ma non è disponibile per l'assorbimento dei tessuti. Per alcuni traccianti i metaboliti devono essere determinati nel sangue intero o nel plasma e l'AIF deve essere corretto. In terzo luogo, la correzione della dispersione. La dispersione è causata da diversi fattori, tra cui (a) la differenza di tempo sistematica tra i tempi di arrivo del tracciante nel tessuto rispetto al sito di campionamento periferico (correzione del ritardo) e (b) e la sbisciazione della forma dell'AIF, in quanto il trasporto tracciante all'interno del sistema di tubi èinfluenzato dalla sua cinetica di ritardo di primo ordine (PT 1). Sono state proposte diverse correzioni basate sulla deconvoluzione, basate principalmente sul modello di Iida et al.15, ma la maggior parte di esse sono soggette al rumore. Un metodo di correzione che elude la deconvoluzione ed è quindi meno soggetto al rumore è stato proposto da Munk et al.16. Le misurazioni necessarie per stimare i parametri di correzione devono essere eseguite per ogni combinazione di tubi e traccianti utilizzati. La correzione della dispersione deve essere eseguita prima della correzione del ritardo di tempo17. Tuttavia, principalmente i processi di perfusione dei tessuti veloci sono influenzati dalla dispersione ed è stato anche dimostrato che per la modellazione di [18F]FDG studi una correzione di dispersione non è assolutamente necessario18. Pertanto, negli esempi presentati la correzione della dispersione dell'AIF non è stata applicata.
Una corretta calibrazione del calibratore della dose in loco e il suo regolare controllo di qualità sono un prerequisito per il tipo di procedure di calibrazione incrociata qui presentate. Tuttavia, se l'attività somministrata all'animale viene misurata con lo stesso calibratore della dose, qualsiasi deviazione di precisione verrà annullata, a condizione che la deviazione sia costante e che sia stata seguita la procedura completa di calibrazione incrociata, correzioni specifiche del nuclide (ad esempio, per emivita variabile o rapporto di ramificazione diverso). Utilizzando una tale procedura di calibrazione per armonizzare i sistemi PET/CT utilizzati nell'assistenza e nella ricerca sulla salute umana, si potrebbe ottenere una precisione di almeno il 5-10%19,20.
Gli AIF calibrati e corretti generati dalla corretta attuazione di questo protocollo consentono la quantificazione dei dati PET/CT per la caratterizzazione dei modelli di malattie animali, la sperimentazione di nuove opzioni terapeutiche, la creazione di nuovi traccianti e il trasferimento di traccianti esistenti in un'altra specie. Apparentemente, il campionamento continuo del sangue in [18]FDG-PET/CT nei ratti fornisce le informazioni più affidabili per il calcolo dell'input nella modellazione bio-cinetica. Tenendo conto del metabolismo individuale, in particolare lo sgombero del fegato, è possibile una valutazione più precisa degli effetti patologici o terapeutici rilevanti. Con questo protocollo praticabile, una maggiore efficienza dell'analisi preclinica dei dati PET/CT è facilmente attuabile.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine Susann Lehmann, Iloana Klamfue e Petra Wolff per l'edilizia e la cura degli animali e Matthias Wyss per il supporto durante la creazione del sistema di campionamento del sangue online. Il piccolo animale PET/CT è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (INST 2268/6-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sugery for arteriovenous shunt | |||
| anesthesia station | Groppler | ||
| aneurysm clips | Aesculap | FT190T | 5 mm, closing force 70 g |
| bulldog clamp | Aesculap | 35 mm | |
| dissectiong scissors BC165 | Aesculap | 490-866 | dull, for skin preparation |
| heating mat | |||
| insulin syringe | Braun | 30G | |
| needle holder | medicon | 11.62.18 | micro surgical |
| pliers for aneurysm clips | Aesculap | FT 470T | Yasargil |
| portex fine bore polythene tubing | Smith Medical | 800/100/200 | ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing |
| surgical microscope with camera | Leica | M50 + MC120 HD | |
| suture filaments 6.0 | 6.0, polypropylene | ||
| suture filaments 3.0 | 3.0, absorbable, braided | ||
| two anatomical forceps | Hammacher Soling | HSC601-11 | micro surgery, 45° |
| vascular or corneal scissors | Geuder | G19605 | micro surgery scissors |
| PET/CT imaging | |||
| dose calibrator ISOMED 2010 | nivia instruments GmbH | for tracer portioning | |
| Inveon PET/CT | Siemens | ||
| tracer (e.g. 18F-FDG) | |||
| manuel bloodsampling | |||
| capillary blood collection EDTA tube | KABE Labortechnik GmbH | GK 150 EDTA 200 µl | |
| test tubes | SARSTEDT | 5 ml, 75 x 12 mm, PS | |
| well counter CAPTUS 700t | Capintec | manuel measurement of blood activity | |
| automatic blood sampling | |||
| BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm) | BD | 3932269 | luer connections (to fit in t-connections) |
| bloodsampler twilite two | swisstrace GmbH | ||
| combi stopper | Braun | 4495101 | |
| heparin | 50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery | ||
| hypodermic needle | G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm | ||
| microprocessor controlled tubing pump | Ismatec/Cole-Parmer | ISM596 | 12 rollers, 2 channels |
| PSAMPLE modul of PMOD | PMOD | ||
| reduction connectors | Ismatec/Cole-Parmer | ISM569A | from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm |
| silicone pump tubes | Ismatec/Cole-Parmer | 070535-17-ND /SC0065N | for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm) |
| silicone pump tubes - adapter tubing | Ismatec/Cole-Parmer | SC 0107 | black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm |
| t-piece or t-connections | Ismatec/Cole-Parmer | ISM 693A | ID 2.5 mm |
References
- Schain, M., et al. Arterial input function derived from pairwise correlations between PET-image voxels. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (7), 1058-1065 (2013).
- Schain, M., Zanderigo, F., Mann, J. J., Ogden, R. T. Estimation of the binding potential BPND without a reference region or blood samples for brain PET studies. NeuroImage. 146, 121-131 (2017).
- Bentourkia, M. Determination of the Input Function at the Entry of the Tissue of Interest and Its Impact on PET Kinetic Modeling Parameters. Molecular Imaging and Biology. 17 (6), 748-756 (2015).
- Phelps, M. E. PET. , Springer New York. New York, NY. (2004).
- Laforest, R., et al. Measurement of input functions in rodents: challenges and solutions. Nuclear Medicine and Biology. 32 (7), 679-685 (2005).
- Napieczynska, H., et al. Impact of the Arterial Input Function Recording Method on Kinetic Parameters in Small-Animal PET. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 59 (7), 1159-1164 (2018).
- Sijbesma, J. W. A., et al. Novel Approach to Repeated Arterial Blood Sampling in Small Animal PET: Application in a Test-Retest Study with the Adenosine A1 Receptor Ligand [(11)C]MPDX. Molecular Imaging and Biology: MIB: the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (5), 715-723 (2016).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Weber, B., Burger, C., Biro, P., Buck, A. A femoral arteriovenous shunt facilitates arterial whole blood sampling in animals. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 29 (3), 319-323 (2002).
- Liu, H. -L. Microvascular anastomosis of submillimeter vessels-a training model in rats. Journal of Hand and Microsurgery. 5 (1), 14-17 (2013).
- van der Weerdt, A. P., et al. Image-derived input functions for determination of MRGlu in cardiac (18)F-FDG PET scans. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 42 (18), 1622-1629 (2001).
- Alf, M. F., et al. Quantification of brain glucose metabolism by 18F-FDG PET with real-time arterial and image-derived input function in mice. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 54 (1), 132-138 (2013).
- Eriksson, O., et al. A computerized infusion pump for control of tissue tracer concentration during positron emission tomography in vivo pharmacokinetic/pharmacodynamic measurements. BMC Medical Physics. 8, 2 (2008).
- Burger, C., Buck, A. Tracer kinetic modelling of receptor data with mathematical metabolite correction. European Journal of Nuclear Medicine. 23 (5), 539-545 (1996).
- Iida, H., et al. Error analysis of a quantitative cerebral blood flow measurement using H2(15)O autoradiography and positron emission tomography, with respect to the dispersion of the input function. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 6 (5), 536-545 (1986).
- Munk, O. L., Keiding, S., Bass, L. A method to estimate dispersion in sampling catheters and to calculate dispersion-free blood time-activity curves. Medical Physics. 35 (8), 3471-3481 (2008).
- Meyer, E. Simultaneous correction for tracer arrival delay and dispersion in CBF measurements by the H215O autoradiographic method and dynamic PET. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 30 (6), 1069-1078 (1989).
- Lanz, B., Poitry-Yamate, C., Gruetter, R. Image-derived input function from the vena cava for 18F-FDG PET studies in rats and mice. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (8), 1380-1388 (2014).
- Geworski, L., et al. Multicenter comparison of calibration and cross calibration of PET scanners. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 43 (5), 635-639 (2002).
- Boellaard, R. Standards for PET image acquisition and quantitative data analysis. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 50, Suppl 1 11-20 (2009).
