Summary
هنا، نقدم العديد من الطرق البسيطة لتقييم الجدوى والموت في كروية الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد، والتي تحاكي التدرجات الفيزيائية الكيميائية للأورام الحية أفضل بكثير من الثقافة 2D. نموذج كروي, وبالتالي, يسمح تقييم فعالية المخدرات السرطان مع تحسين الترجمة إلى في ظروف الجسم الحي.
Abstract
الكرويات ثلاثية الأبعاد من الخلايا السرطانية هي أدوات هامة لكل من شاشات المخدرات السرطان واكتساب البصيرة الميكانيكية في بيولوجيا الخلايا السرطانية. قوة هذا الإعداد يكمن في قدرتهعلى تقليد العديد من جوانب الظروف في الجسم الحي من الأورام في حين يجري سريعة ورخيصة، وتنوعا بما فيه الكفاية للسماح فحص عالية الإنتاجية نسبيا. يمكن أن تلخص ظروف الثقافة الكروية التدرجات الفيزيائية الكيميائية في الورم، بما في ذلك الحموضة خارج الخلايا المتزايدة، وزيادة اللاكتات، وتقليل توافر الجلوكوز والأكسجين، من محيط كروي إلى جوهره. أيضا، يتم تقليد الخصائص الميكانيكية والتفاعلات خلية الخلية من الأورام في الجسم الحي جزئيا من قبل هذا النموذج. خصائص محددة، وبالتالي ظروف النمو الأمثل، من كروية 3D، تختلف على نطاق واسع بين أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية. وعلاوة على ذلك، فإن تقييم صلاحية الخلايا والموت في الكرويات ثلاثية الأبعاد يتطلب أساليب تختلف جزئياً عن تلك المستخدمة في الثقافات ثلاثية الأبعاد. هنا نحن وصف عدة بروتوكولات لإعداد كروية 3D من الخلايا السرطانية، واستخدام هذه الثقافات لتقييم قدرة الخلايا على البقاء والموت في سياق تقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان.
Introduction
استخدام نماذج متعددة الخلايا كروية في علم الأحياء السرطان هو عدة عقود من العمر1,2, ولكن اكتسبت زخما كبيرا في السنوات الأخيرة. وهذا يعكس إلى حد كبير زيادة الوعي بمدى قوة النمط الظاهري للخلايا السرطانية يعتمد على بيئتها الدقيقة وظروف نموها المحددة. البيئة الدقيقة في الأورام الصلبة تختلف اختلافا جوهريا عن تلك التي في الأنسجة العادية المقابلة. ويشمل ذلك الظروف الفيزيائية الكيميائية مثل درجة الألف الألف، وتوتر الأكسجين، وكذلك الضغط الخلالي، وتدرجات تركيز العوامل القابلة للذوبان مثل المواد الغذائية، ومنتجات النفايات، ومركبات الإشارات المفرزة (عوامل النمو، السيتوكينات). وعلاوة على ذلك، فإنه يشمل تنظيم المصفوفة خارج الخلية (ECM)، والتفاعلات الخلية الخلية والإشارات بين الخلايا، وجوانب أخرى من العمارة ثلاثية الأبعاد (3D) معينة للورم3،4، 5,6. الظروف البيئية الدقيقة المحددة التي توجد فيها الخلايا السرطانية، تؤثر بشكل عميق على ملامح التعبير الجيني والخصائص الوظيفية، ومن الواضح أنه، بالمقارنة مع تلك التي تنمو في الخلايا 2D، والنمط الظاهري من كروية 3D يحاكي عن كثب أن من الأورام في الجسم الحي7،8،9،10،11. نماذج 2D، حتى لو كانت تستخدم نقص الأكسجة، الحموضة الحمضية، والتركيزات اللاكتات عالية لتقليد الجوانب المعروفة من البيئة الدقيقة الورم، لا تزال تفشل في التقاط تدرجات المعلمات الفيزيائية الكيميائية الناشئة داخل الأورام، فضلا عن ورمها 3D الهندسه المعماريه. من ناحية أخرى، النماذج الحيوانية مكلفة، بطيئة، وإشكالية أخلاقيا، وعموما، لديها أيضا أوجه القصور في قدرتها على تلخيص ظروف الورم البشري. وبالتالي، تم تطبيق كرويات ثلاثية الأبعاد كنموذج تعقيد متوسط في دراسات مجموعة واسعة من خصائص معظم أنواع السرطان الصلبة9،11،12،13، 14,15,16,17.
استخدام المستخدمة على نطاق واسع من كروية 3D هو في فحص الاختبارات من فعالية العلاج بالسرطان9,18,19,20. الاستجابات العلاجية حساسة بشكل خاص للورم الميكروي، مما يعكس كل من تأثير التقصير، والانتشار المقيد، والضغط الخلالي العالي، ودرجة الحموضة البيئية الحمضية على تسليم الأدوية، وتأثير نقص الأكسجة وغيرها جوانب من البيئة الدقيقة على استجابة موت الخلية9,17. لأن البيئة داخل كروية 3D يتطور بطبيعتها كل هذه الخصائص7،8،9،10،11، يمكن توظيف الثقافات خلية 3D تحسين ترجمة النتائج إلى ظروف حية بشكل كبير، مع السماح بكفاءة وبأسعار معقولة عالية الإنتاجية الفرز من صافي النمو. ومع ذلك، لا تزال الغالبية العظمى من الدراسات على استجابة المخدرات من الخلايا السرطانية تجري في ظل ظروف 2D. وهذا يعكس على الأرجح أنه، في حين أن بعض الاختبارات يمكن تنفيذها بسهولة نسبيا لثقافات الخلايا 3D، وكثير، مثل اختبارات البقاء، والنشاف الغربية، وتحليل الفلور المناعي، يتم القيام به بشكل مريح أكثر بكثير في 2D مما كانت عليه في 3D.
والهدف من العمل الحالي هو توفير الفحوصات والبروتوكولات الدقيقة سهلة الملاءمة لتحليل تأثير العلاج بالأدوية المضادة للسرطان على قدرة الخلايا السرطانية على البقاء على قيد الحياة في بيئة محاكاة للورم ثلاثي الأبعاد. وعلى وجه التحديد، نقدم ونقارن ثلاث طرق مختلفة لتشكيل كروي، تليها طرق للتحليلات النوعية والكمية للنمو، والقدرة على البقاء، والاستجابة للمخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جيل من الكرويدات
- إعداد تعليق الخلية لتشكيل كروي
ملاحظة: خطوط الخلايا المختلفة لها خصائص التصاق مختلفة جداويجب أن يتم تأسيس بروتوكول تشكيل كروية مناسبة في كل حالة. لقد وجدنا أن خلايا MCF-7 و BxPC-3 مناسبة لتشكيل كرويتلقائي، في حين أن MDA-MB-231، SKBr-3، Panc-1 و MiaPaCa تتطلب إضافة غشاء الطابق السفلي المعاد تشكيله لتشكيل كروية بنجاح. فقط MDA-MB-231 وBxPC-3 الخلايا قد استخدمت لبروتوكول إسقاط شنقا، ولكن خطوط الخلايا الأخرى تنطبق بالتأكيد.- تنمو الخلايا كطبقة واحدة حتى 70-80% confluency.
- الخلايا المزودة بمحلول ملحي من الفوسفات (1× PBS، 5 مل ل25 سم2 أو 10 مل لقارورة 75 سم2)، إضافة انزيم فصل الخلية (0.5 مل ل 25 سم2 أو 1 مل ل75 سم2 قارورة) واحتضان الخلايا لمدة 2-5 دقيقة في 37 درجة مئوية في 5% ثاني2 و 95% رطوبة.
- تحقق من مفرزة الخلية تحت المجهر وتحييد انزيم الخلايا المنفصلة عن طريق إضافة متوسط النمو (6-10٪ مصل اعتمادا على خط الخلية) إلى حجم إجمالي 5 مل في 25 سم2 أو 10 مل ل75 سم2 قارورة.
- استخدام غرفة Bürker لحساب الخلايا وحساب 8 مربعات في غرفة لكل إعداد الخلية للحصول على استنساخ عالية من حجم الكرويات.
ملاحظة: وترد أدناه ثلاثة بروتوكولات تصف كل طريقة مختلفة لتشكيل كروية. ويمكن استخدام البروتوكولين 1-2 و1-3 في جميع البروتوكولات التحليلية اللاحقة المقدمة، في حين أن البروتوكول 1-4 هو الأنسب لتضمين الاستعدادات والتجهيز. اعتمادا على خط الخلية، وتشكيل كروي ة يستغرق 2-4 أيام، بغض النظر عن الطريقة المستخدمة.
- تشكيل كروي تلقائي
- تنفيذ الخطوات 1.1.1-1.1.4.
- تمييع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل للحصول على 0.5-2 X 104 خلايا / مل (الكثافة المثلى للخلايا يجب أن تحدد لكل خط خلية) (الشكل1ألف '2').
- ملء الحلقة الخارجية من الآبار مع 1X PBS أو متوسط النمو للحد من التبخر من الآبار المتبقية. نقل تعليق الخلية إلى خزان معقم، وباستخدام ماصة متعددة القنوات، اغنى 200 ميكرولتر/بئر إلى لوحات سفلية مستديرة ذات 96 بئر مرفقة منخفضة للغاية (الشكل1ألف '3').
- احتضان لوحة في حاضنة في 37 درجة مئويةمع 5٪ ثاني 2، 95٪ الرطوبة.
- كل 2-3 أيام الحصول على الصور المجهرية الخفيفة من كروية.
ملاحظة: يتم التقاط الصور في هذه الورقة في التكبير 11.5x، وهو مناسب لمعظم كروية أعدت باستخدام هذه البروتوكولات. - كل 2-3 أيام (بعد الحصول على الصور) استبدال 100 μL المتوسطة (إزالة 100 μL من المتوسط قضى واستبدال مع 100 ميكرولتر من المتوسطة الطازجة.
ملاحظة: لتجنب إزالة الكرويات عند استبدال المتوسطة، فإنه من المستحسن لإمالة لوحة قليلا ً في حين إزالة ببطء المتوسطة وفحص المتوسطة يستنشق في نصائح لكرويدات مرئية قبل التخلص منها.
- إعادة تشكيل غشاء القبو بوساطة تشكيل كروي.
ملاحظة: تم استخدام اللاكتوز dehydrogenase ارتفاع فيروس (LDEV) خالية من انخفاض معامل النمو غشاء الطابق السفلي (rBM). rBM حساسة لدرجة الحرارة، وينبغي أن تبقى دائما على الجليد، كما أنها سوف تتخثر إذا وصلت إلى 15 درجة مئوية. قم بذوبان rBM على الجليد إما بين عشية وضحاها عند درجة حرارة الغرفة أو 2-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الطلاء.- ثوّم [ربم] على جليد (رأيت طاولة ال [متريلس]).
- احتفظ بالألواح والخزانات (إذا كانت ملفوفة بشكل فردي) على الجليد قبل الاستخدام.
- تنفيذ الخطوات 1.1.1-1.1.4.
- ملء الحلقة الخارجية من الآبار مع 1X PBS أو متوسط النمو للحد من التبخر من الآبار المتبقية. تمييع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل للحصول على 0.5-2 X 104 خلايا / مل (الكثافة المثلى للخلايا يجب أن تحدد لكل خط خلية) (الشكل1ألف '2').
- ضع أنبوب 15 مل الذي يحتوي على تعليق الخلية المخفف على الجليد (على سبيل المثال، في كوب زجاجي) (الشكل1A (iia)).
- نقل الألواح المبردة والخزانات إلى غطاء محرك السيارة. شطف الحاويات البلاستيكية، وملء لهم مع الجليد ونقلها إلى غطاء محرك السيارة للسماح لوحات والخزانات لوضعها على الجليد خلال العملية بأكملها.
- إعادة تعليق rBM بلطف لضمان هلام متجانسة.
- إضافة 1-2٪ rBM (التركيز الأمثل يحتاج إلى تحديد لكل خط خلية) إلى تعليق الخلية المبردة (الشكل1ألف (iib)).
- عكس أنبوب 15 مل لضمان الخلط السليم من rBM وتعليق الخلية قبل الاستغناء عن تعليق في لوحة.
- نقل تعليق الخلية التي تحتوي على rBM إلى خزان معقم وصرف 200 ميكرولتر/بئر إلى لوحات مبردة منخفضة جداً 96 بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات (الشكل1ألف '3').
ملاحظة: إذا كان العمل مع تعليق الخلية عدة (على سبيل المثال، أكثر من خط خلية)، فمن الضروري الاستغناء عن كل تعليق الخلية مباشرة بعد إضافة rBM لمنع التبلور المبكر. - جهاز طرد مركزي لوحة لمدة 15 دقيقة في 750 x ز باستخدام 'لينة لائق'/ لا الكبح (إذا كان ذلك ممكنا، والطرد المركزي في 4 درجة مئوية للحفاظ على السائل rBM أطول ولكن ليس شرطا لتشكيل كروية ناجحة)، لضمان أن يتم تجميع الخلايا معا عندما rBM تصلب ، وتسهيل تشكيل كروية واحدة واحدة.
- احتضان لوحة في حاضنة (37 درجة مئوية،5٪ ثاني 2، 95٪ الرطوبة).
- كل 2-3 أيام الحصول على الصور المجهرية الخفيفة لتقييم النمو كروي.
- كل 2-3 أيام استبدال 100 μL المتوسطة (إزالة 100 ميكرولتر واستبدل مع 100 ميكرولتر من المتوسطة الطازجة).
- تعليق قطرة كروية.
- تنفيذ الخطوة 1.1.1-1.1.4.
- خلايا مخففة للحصول على تخفيف مناسب. والتخفيف العملي هو 50،000 خلية / مل.
- إزالة غطاء طبق ثقافة خلية 10 سم2 ووضعها حتى أنه يواجه صعودا. أضف 6 مل من 1x PBS إلى الطبق (الشكل 1B (ط)).
- صب تعليق الخلية في خزان معقم ووضع بعناية تصل إلى 30 قطرات من 40 ميكرولتر من تعليق الخلية على غطاء طبق ثقافة الخلية باستخدام ماصة متعددة القنوات (الشكل1B '2))،مما أدى إلى تركيز 2،000 خلية / قطرة. تجنب وضع قطرات قريبة جدا من حافة الغطاء وهذه قطرات هي أكثر عرضة لتفقد التوتر السطحي عند عكس الغطاء في الخطوة التالية.
- عكس الغطاء في حركة سريعة ولكن تسيطر عليها ووضعها على رأس 1X PBS التي تحتوي على طبق الخلية الثقافة (الشكل 1B '3').
- ضع الطبق في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون2 و95% الرطوبة دون إزعاج قطرات وتركها تنمو لمدة 4-6 أيام.
- إذا كان لاستخدامها لlysates البروتين أو التضمين، تجمع كروية عن طريق إزالة الغطاء وإمالة ذلك، من أجل غسل قطرات مع 1 مل من المتوسطة ساخنة. نقل المتوسط الناتج ة تحتوي على كروية إلى أنبوب 1.5 مل والسماح لهم ليستقر إلى أسفل الأنبوب. المضي قدما كما هو موضح في 4.4 و 6.2.2 لlysates البروتين وتضمينها، على التوالي.
2. علاج الزبة
ملاحظة: ويمكن تطبيق العلاج الطويل الأجل للمخدرات على الكروية من أجل فحص آثار المخدرات ذات الأهمية. قبل البدء في العلاج بالعقاقير ، من المستحسن إجراء تجربة استجابة الجرعة للدواء (الأدوية) ، من أجل العثور على جرعة مناسبة للعلاج التجريبي. يجب أن تستند الجرعات علىIC 50 /Ki المحددة من المخدرات وتتراوح من حوالي 0.2x-10x من هذه القيمة.
- إعداد 6-12 كروية لكل حالة المطلوب كما هو موضح في 1.2 أو 1.3 ومكان في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني2،95٪ الرطوبة) لمدة 2 أيام.
- في اليوم الثاني، خذ صورًا مجهرية خفيفة للكرويدات.
- إعداد جرعات العلاج الأولى (بعد الحصول على الصور).
ملاحظة: يجب أن يكون تركيز العلاج الأول ضعف التركيز النهائي المطلوب حيث سيتم تخفيف المحلول 1:2 عند إضافة إلى وسط 100 ميكرولتر الذي يحتوي على البئر. الفترات المقترحة لعلاج المخدرات (سوف تعتمد على نصف عمر المخدرات): اليوم 2 و 4 و 7. - باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة 100 ميكرولتر من المتوسط واستبدالها بـ 100 ميكرولتر من الأدوية التي تحتوي على متوسط.
- ضع لوحة 96 بئر مرة أخرى في الحاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و 95٪ الرطوبة وتكرار 2.3 و 2.4 في الأيام المختارة من العلاج ولكن الآن دون مضاعفة الجرعة للحصول على الجرعة النهائية الصحيحة.
- في اليوم الأخير من الجدول الزمني للبروتوكول / العلاج، واحد أو عدة من الاختبارات التالية يمكن إجراء.
3. خلية قابلية الثبات للكرويرويدات
- إعداد 4-6 كروية لكل حالة المطلوب كما هو موضح في 1.2 أو 1.3 ووضع في الحاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و 95٪ الرطوبة.
ملاحظة: وفي هذه الحالة، تم إجراء فحص مدى بقاء الخلية في اليوم 7 أو 9، بعد رصد نمو كروي كل يومين إلى ثلاثة أيام بواسطة المجهر الضوئي كما هو موضح أعلاه (النقطة 1-2-5 و1-3-13). - قم بذوبان الكاشف القابلة للبقاء (انظر جدولالمواد) والسماح لها بالتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
- اخلطي بلطف عن طريق المقلوب للحصول على حل متجانس.
- قبل إجراء الإنقازات، قم بإزالة 50% من الوسط الثقافي من الكرويات (100 ميكرولتر).
- إضافة الكاشف خلية قابلية البقاء لكل بئر بنسبة 1:3 إلى كمية من المتوسط الحاضر في البئر (الشكل 2A '1') للوحة 96 جيدا، إضافة 50 ميكرولتر من الكاشف إلى 100 μL من المتوسطة.
- اخلط المحتويات بقوة لمدة 5 دقائق للحث على تَرَكُس الخلايا (الشكل 2أ (2)).
- احتضان لمدة 25 دقيقة في RT لتحقيق الاستقرار في إشارة الانارة (الشكل 2ألف '3').
- تسجيل الإشارة الانارة (الشكل 2أ (4)).
4. إعداد الليسات البروتين لبقع الغربية من الثقافات كروية 3D
ملاحظة: عند جمع الكرويات، فإنه من المستحسن استخدام ماصة P200 وقطع نهاية الطرف للسماح بفتح أكبر وبالتالي التقاط أسهل من كرويرويدس دون إزعاج هيكلها.
- لكل حالة، تجمع ما لا يقل عن 12، من الناحية المثالية 18-24 كروية (اعتمادا على حجم كروي) في أنبوب 1.5 مل (تجنب 2 أنابيب مل، كما الخطوات التالية سوف تصبح أكثر صعوبة بسبب أسفل مدبب أقل).
ملاحظة: إذا كان مقدار متوسط يتجاوز 1.5 مل قبل بعد أن جمعت جميع كروية، والسماح للكرويدات التي تم جمعها لتسوية في الجزء السفلي (يحدث بسرعة كبيرة، الطرد المركزي غير ضروري) وتجاهل نصف حجم الأنبوب قبل الاستمرار في جمع الكرويات المتبقية. - وضع أنابيب على الجليد والسماح للكروية ليستقر في الجزء السفلي من أنبوب 1.5 مل.
- الانتقال من مختبر الخلية المعقمة إلى المختبر العادي.
- غسل كروية مرتين في 1 مل من الجليد الباردة 1X PBS. السماح كرويرويدس تسوية قبل إزالة 1X PBS بين كل خطوة الغسيل.
- استنشق أكبر عدد ممكن من 1X PBS دون إزعاج أو إزالة الكرويات.
- إضافة 5 μL من العازلة lysis ساخنة (LB) مع مثبطات الفوسفاتيز والبروتياز، لكل كروية (على سبيل المثال، 10 كروية = 50 ميكرولتر LB).
- كرر فترات الدوامة تليها تدور إلى أسفل حتى يتم حل كروية. أداء دورة من الدوامة لمدة 30 s تليها التمركز (تدور سريعة باستخدام جهاز طرد مركزي الطاولة كافية) لمدة 10 ق لحوالي 5-10 دقيقة اعتمادا على حجم والحجم والحجم من كروية.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. حافظ على الليسات عند -20 درجة مئوية حتى يتم تنفيذ هاونشن، تجانس، وتحديد البروتين كما هو الحال في بروتوكول lysate البروتين 2D القياسية، تليها النشاف الغربية باستخدام البروتوكولات القياسية.
5. الببوبيديوم يوديد (PI) تلطيخ من كروية
- إعداد 3-6 كروية لكل حالة المطلوب كما هو موضح في 1.2 أو 1.3 ووضع في الحاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و 95٪ الرطوبة.
- في مختبر معقم لزراعة الخلايا، قم بتسخين 1x PBS إلى 37 درجة مئوية.
- جعل حل PI من 4 ميكرومتر عن طريق تمييع حل الأسهم في 1X PBS: تمييع 1 مغ / مل مخزون مائي من PI 1:350 في 1X PBS.
ملاحظة: وسيتم تخفيض هذا التركيز إلى النصف عند إضافة الحل إلى الآبار مع التركيز النهائي من 2 ميكرومتر.
تحذير: يجب التعامل مع اليود (PI) في غطاء الدخان وارتداء القفازات. PI حساسة للضوء. حماية من الضوء عند التعامل معها. - إزالة 100 ميكرولتر من المتوسط من كل بئر في لوحة 96 جيدا دون إزالة الكرويات.
- اغسل الوسيط المتبقي بإضافة 100 ميكرولتر من 1x PBS ساخنة لجميع الآبار تليها إزالة 100 ميكرولتر من السائل في الآبار. كرر هذه الخطوة الغسيل 3 مرات.
- إضافة 100 ميكرولتر من حل PI لكل بئر، وتغطية لوحة في رقائق الألومنيوم ووضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و الرطوبة 95٪ لمدة 10-15 دقيقة.
- كرر 3 خطوات الغسيل الموصوفة في 4.5 لغسل حل PI، من أجل تقليل إشارة الخلفية عند التصوير.
- استخدام المجهر الفلوري لتصوير كروية. لتقييم قابلية بقاء الخلايا في جوهر كروي تأخذ z-stacks للحصول على الصور مع أعماق متفاوتة من كروي.
ملاحظة: من المستحسن أن يكون حجم الخطوة حوالي 18-35 ميكرومتر بين كل شريحة اعتمادا على حجم كروي، وإعطاء ما يقرب من 11-18 مداخن لكل كروية. يمكن معالجة Z-stacks في ImageJ باستخدام وظيفة الإسقاط z، والتي يمكن أن تجمع بين جميع z-stacks في صورة نهائية واحدة، وإعطاء لمحة عامة عن تلطيخ في جميع أنحاء كروي (لمزيد من المبادئ التوجيهية حول استخدام ImageJ لهذا الغرض، انظر (https://imagej.net/Z-functions).
6. تضمين الأغصان ثلاثية الأبعاد
-
إعداد هلام الأجاروز التي يتم تضمين كروية (فقط أول مرة ضرورية أداء البروتوكول).
- اخلط 1 جم من الباكتوجار في 50 مل من ddH2O.
- سخني ببطء في فرن الميكروويف حتى يذوب الباكتوجار ويتشكل هلام متجانس. لا تسمح يغلى الجل.
- حافظ على الباكتوجار دافئاً في حمام مائي عند 60 درجة مئوية.
- حافظ على درجة حرارة 4 درجة مئوية بين التجارب.
-
تضمين الأغصان.
- في اليوم 1، لكل حالة، تجمع ما لا يقل عن 12 كروية في أنبوب 1.5 مل.
- اغسل مرة واحدة مع 1 مل من الجليد الباردة 1X PBS.
- لإصلاح الكرويات، إضافة 1 مل من 4٪ بارافورمالديهايد.
ملاحظة: وينبغي أن يتم التعامل مع البارافورمالديهايد في غطاء محرك الدخان. - دعهم يحضنون لمدة 24 ساعة في RT.
- في اليوم الثاني، قم بتسخين هلام الأغاروز بعناية عن طريق وضعه في كوب مملوء بالماء في فرن ميكروويف. تأكد من أن الجل لا يغلي! يُحفظ دافئاً في طبق تسخين على سطح الطاولة، عند 60 درجة مئوية حتى يصبح للاستخدام.
- غسل كروية مرتين مع 1 مل من الجليد الباردة 1X PBS.
- يستنشق معظم 1X PBS (ترك ما يقرب من 100 ميكرولتر في هذه المرحلة هو عملي للتعامل مع كروية).
- إعداد ماصة 20 μL عن طريق قطع طرف ماصة في منحدر للحصول على طرف أكثر نقطة مع ثقب أكبر (انظر التوضيح).
ملاحظة: الجزء التالي يجب القيام به بسرعة لضمان نقل كروي الأمثل وتجنب صلابة قطرة هلام. إذا لم تتوفر كتلة التدفئة، فمن المستحسن أن أول التقاط كروية ثم جعل قطرة أجاروز (أي، تبديل ترتيب النقاط 6.2.9 و 6.2.10). - جعل قطرة هلام أجاروز على شريحة المجهر. ضع الشريحة على كتلة التدفئة الدافئة لمنع agarose من ترسيخ.
- باستخدام تلميح الماصة المعدل (انظر 6.2.8)، التقط أكبر عدد ممكن من الأغصان في حجم 15-20 ميكرولتر.
- حقن بعناية 15-20 ميكرونلتر كروية تحتوي على 1X PBS في وسط قطرة هلام أجاروز دون لمس الشريحة المجهر.
ملاحظة: وهذه نقطة صعبة بعض الشيء. سيتم فقدان الكرويات إذا كان طرف الماصة يلمس شريحة المجهر عند حقن الكرويدات في قطرة هلام. فمن المستحسن ممارسة عملية كاملة من جعل قطرة الأغاروز وحقن الكروية عن طريق حقن سائل ملون في قطرة. وهذا سوف يسمح تصور اختراق محتمل من خلال قطرة، كما السائل الملونة سوف يكون تسرب إلى الشريحة. - دع هلام الأغاروز يصلب باحتضان لمدة 5-10 دقيقة في RT أو عند 4 درجة مئوية. مرة واحدة وقد ترسخت قطرة هلام إلى حد ما (ولكن لا يزال لينة إلى حد ما)، ودفع بعناية قطرة هلام من الشريحة المجهر في كاسيت الأنسجة البلاستيكية مع مشرط.
- تغطية أشرطة الأنسجة البلاستيكية في 70٪ الإيثانول.
ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن استخدام كروية مباشرة أو تخزينها لعدة أشهر. - قم بتضمين الكروية المدمجة بالأغروس في البارافين، والقسم إلى شرائح طبقة سميكة 2-3 ميكرومتر وصمة عار مع الهيماتوكسيلين وإيوسين أو تخضع لتلطيخ مناعية- هيستوري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اختبارات النمو كروية على أساس بروتوكول تشكيل كروية موضحة تخطيطيا في الشكل 1ألف والشكل 1B، واستخدمت كنقطة انطلاق لتحليل آثار العلاجات المضادة للسرطان المخدرات في ورم 3D محاكاة الإعداد. السهولة التي يتم تشكيل هاون الكروية هو خط الخلية محددة، وبعض خطوط الخلايا تتطلب مكملات مع rBM من أجل تشكيل كرويات متماسكة22. تركيز rBM المضافة يمكن أن تؤثر تأثيرا عميقا على مورفولوجيا الكروية. كما هو مبين في الشكل 1جيم و الشكل 1D، فإن تغيير تركيز rBM بين 0 و 4٪ يغير من الثبات والمورفولوجيا للكرويات بطريقة تعتمد على نوع الخلية. الشكل 1 C يوضح كيف أن إضافة ما يصل إلى 2.5٪ rBM يسمح تشكيل كروي في خلايا سرطان الثدي SKBr-3، مع عدم وجود تأثير آخر في تركيزات فوق 2.5٪ rBM. وعلى النقيض من ذلك، فإن خلايا سرطان البنكرياس الغدي البَسَيَرِيَّة (PDAC) التي تظهر مورفولوجيا ظهارية، تشكل تلقائياً كرويات صغيرة ومدمجة (الشكل1دال،العلوي، اللوحة اليسرى). في هذا النوع من الخلية، وزيادة تركيز rBM إلى 1.5٪ أو أعلى يثير تغييرا ًيّا ًًا من الكروية إلى الهياكل الأكثر تعقيداً مع النتوءات والتبذير، تذكرنا بتكوين بنية أنبوبي القناة. وعلى العكس من ذلك، فإن إضافة rBM إلى خطين خلية PDAC أخرى، MiaPaCa و Panc-1، والتي لديها نمط ظاهري أكثر mesenchymal، يسمح للمجاميع الخلوية فضفاضة لتصبح أكثر إحكاما وتشكيل أكثر كروية المدمجة (الشكل 1D، الأوسط والسفلي لوحات). وتبين هذه النتائج أن كمية دقيقة من rBM مما يؤدي إلى تشكيل كروي الأمثل يجب أن تكون titrated لكل خط الخلية والشرط.
كان من الضروري إجراء تقييم كمي لصلاحية الخلايا داخل الكرويات على علاج المخدرات لتقييم تأثير العلاجات المضادة للسرطان. المقاييس الموصوفة هنا هي الإسهال القائم على لوسيفيرين-لوسيفيراز، والذي يقيس ATP المفرج عنه من الخلايا الحية داخل كرويرويد. ويتجلى مبدأ الشرح في الشكل 2ألف. والإشارة الانارة التي تم إنشاؤها في هذا العيار يتم تسجيلها بسهولة من قبل قارئ لوحة (الشكل2A)ويرتبط بشكل جيد مع القدرة على البقاء التي تقاس بطرق أخرى23. العلاقة الخطية بين تركيز ATP والإضاءة في نطاق التركيز ذات الصلة مبينة في الشكل 2B، في حين يبين الشكل 2C قدرة الخضوع على تقييم موت الخلايا في الكرويات ثلاثية الأبعاد المعالجة بـ علاج مضاد للسرطان. من أجل مواصلة تقييم خطية المقاييس في النطاق ذي الصلة، أجريت تجارب لإنشاء منحنيات قياسية للإشارة الانارة كدالة لعدد الخلايا (الشكل2دال والشكل 2هاء ). وتشير هذه النتائج إلى أن الاختبارات مناسبة لتقدير قدرة الخلية على البقاء في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد وأنها قابلة للتطبيق للتحقيق في فقدان قدرة الخلية على البقاء بسبب المخدرات.
مزيج من الصور المجهرية الخفيفة التي يتم الحصول عليها كل يومين إلى ثلاثة أيام، خلال فترة العلاج والتقييم الكمي النهائي لصلاحية الخلايا يسمح بالإشراف الوثيق على نمو الكروية والمورفولوجيا، فضلا عن تقييم العلاج الأمثل جرعه. ويتجلى هذا الأخير في الشكل 3ألف و الشكل 3B، حيث أجريت تجربة الجرعة والاستجابة لتحديد الجرعة اللازمة لقدرة الخلايا المخفضة بنسبة 50٪ في الأغصان سرطان الثدي MDA-MB-231. آثار العلاج على المورفولوجيا كروية وتصور في الشكل 3جيم والشكل 3D لMDA-MB-231 وMCF-7 كروية، على التوالي. أثناء العلاج مع كوكتيل العلاج الكيميائي المختار، يزيد ضغط الكرويات MDA-MB-231، بينما أثناء العلاج مع تاموكسيفين، تصبح كرويات MCF-7 متوترة وغير متساوية بشكل متزايد. وفي كلتا الحالتين، يظهر انخفاض واضح في قابلية بقاء الخلايا بعد 7 أيام (MDA-MB-231) أو 9 (MCF-7) (الشكل3هاء والشكل 3واو). وهذا يدل على الحاجة إلى كل من التقييم البصري والكمي للآثار بوساطة العلاج على قدرة الخلية الكروية على البقاء والمورفولوجيا، فضلا عن أن هذه المعلمات هي عالية الخلية والنوع العلاجي.
كمكمل لتقويم بقاء الخلية، تلطيخ الخلايا الميتة مع PI، والتي لا يمكن عبور الغشاء، وبالتالي البقع فقط الخلايا النخرية أو الخلايا المبرمجة في وقت متأخر مع سلامة الغشاء للخطر، يسمح لتقييم مكاني سريع من الخلايا الميتة في الاستجابة للعلاج، دون بروتوكول تستغرق وقتا طويلا من التضمين، وتقسيم وIHC. كما هو موضح في الشكل 4ألف الترتيب المكاني للخلايا الميتة على تركيز متزايد من مثبط، في هذه الحالة، Na+/ H+ مبادل 1 (NHE1) مثبط 5-(N-إيثيل-N-إيزوبروبيل)-amiloride (EIPA)، يمكن أن يكون تصور. كما رأينا، تظهر كرويات التحكم نواة بوبتوتيك محدودة/متأخرة، في حين يتم توزيع الخلايا الميتة في جميع أنحاء الكروية كما يتم زيادة تركيز EIPA.
من أجل تحديد كمية الاستقراء النسبي للإجهاد المبرمج بعد العلاجات المختلفة، تم lysed كرويدات وخضعت لSDS-صفحة هلام الكهربائي والنشاف الغربية لكامل طول وكليفد بولي (ADP-ريبوز) البلمرة (PARP). وترد النتائج التمثيلية في الشكل 4باء والشكل 4جيم. في هذه التجربة، تم إعداد كروية من خلايا MDA-MB-231 التي اللاكت-بروتون cotransporter MCT4 أو نا+، HCO3- تم إسقاط الناقل NBCn1 باستخدام سيرنا. تم تقييم الضربة القاضية من قبل النشاف الغربي لMCT4 وNBCn1 (بيانات غير منشورة). كما رأينا, الضربة القاضية من MCT4, ولكن ليس من NBCn1, يزيد بقوة انشقاق PARP, اتساقا مع مظاهرتنا السابقة أن ضربة قاضية مستقرة من MCT4 في الخلايا MDA-MB-231 يقلل نمو الورم في الجسم الحي24.
لمزيد من تحليل آثار العلاج والحصول على معلومات عن إشارات محددة، واعتقال النمو، ومسارات الموت تفعيلها، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من كرويدات بالإضافة إلى تحليل وصمة عار الغربية وإخضاعها لتحليل الكيمياء المناعية (IHC). تحليل IHC للأقسام كروي يسمح باستخدام الأجسام المضادة محددة أو علامات انتشار الخلايا، دورة الخلية وموت الخلايا المبرمجة، ويسهل تصور الترتيب المكاني للخلايا التكاثرية والمبرمجة في كروي.
ويرد في الشكل 5ألفرقم تخطيطي للبروتوكول التضمين لتحليل النفثالينات الهيدرولية للكرويات . صورة مجهرية خفيفة تمثيلية لحوالي 3 ميكروتومي مقطع من كروية جزءا لا يتجزأ يظهر في الشكل 5B، وصورة مناعية من كروية ملطخة لبروتين قمع الورم p53 (نوى ملطخة باستخدام DAPI)، يظهر كشكل 5C. أمثلة من دمسو والعلاج الكيميائي المعالجة كروية ملطخة لعلامة انتشار الخلية كي-67 أو لp53 وترد في الشكل 5D و الشكل 5هاء،على التوالي. بما يتفق مع تأثير مضاد التكاثرية للعلاج الكيميائي، فإن عدد الخلايا الإيجابية كي-67 أكبر في التحكم DMSO مما كانت عليه في كروية العلاج الكيميائي (الشكل5D). وعلى النقيض من ذلك، يتم زيادة التعبير p53 أثناء ظروف الإجهاد الخلية، المبرمج واعتقال النمو، وبالتالي، فإن عدد الخلايا الملطخة p53 أعلى بكثير في كروية العلاج الكيميائي العلاج مقارنة مع ضوابط DMSO (الشكل5 E).
توضح هذه النتائج أمثلة على كيفية الحصول على معلومات عن الآثار العلاجية للأدوية في الكرويات ثلاثية الأبعاد التي يتم حلها مكانياً (تلطيخ بي، IHC) أو المعلومات الكمية (البقعة الغربية).
الشكل 1 تشكيل كروي عفوي بوساطة RBM: (أ) تمثيل تخطيطي لتشكيل كروي باستخدام التعلق المنخفض جدا 96-جيدا لوحات مستديرة القاع، مع الاستخدام الاختياري للrBM. خطوات فردية تم وضع علامة عليها (i-iii). (ب) تمثيل تخطيطي لتشكيل كروي باستخدام طريقة إسقاط معلقة. يتم وضع علامة على الخطوات الفردية من قبل (i-iii) (C)صور تمثيلية لتشكيل كروية من خلايا SKBr-3 بوساطة rBM. تم زرع الخلايا في لوحات أسفل مستديرة منخفضة للغاية 96 بئر مع تركيزات متزايدة من rBM ونمت لمدة 9 أيام. مقياس شريط 100 ميكرومتر. (ن = 3). (D) صور تمثيلية لخلايا BxPC-3 وMiaPaCa وPanc-1 التي تم زرعها لتكوين كروي في لوحات قاع مستديرة ذات 96 بئر مرفق منخفضة للغاية مع تركيزات من rBM من 0.5-2.5%. تم زراعة الأغصان لمدة 4 أيام. مقياس شريط = 250 μm. (n = 3). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 مبدأ وتقييم تقييم تقييم بقاء الخلية. (أ) تمثيل تخطيطي للتقييم القابل للبقاء في الخلية ثلاثية الأبعاد. خطوات فردية تدل عليها (i-iv). (B) إشارة الانارة كدالة تركيز ATP. تم طلاء مخففات ATP في لوحة 96 جيدا وخلية قابلة للحياة كاشف وأضاف إلى كل بئر. تم تسجيل الإضاءة بعد 30 دقيقة في 405 نانومتر. 1 ن( ج) قابلية البقاء، تقاس الإضاءة، من السيطرة والعلاج الكيميائي MCF-7 كروية. تم زرع خلايا MCF-7 في لوحات منخفضة جداً من أسفل مستدير ة ونمت لمدة 7 أيام. العلاج الكيميائي (5 μM سيسبلاتين، 5 μM دوكسوروبيسين و 30 5-FU) تم تطبيقها في اليوم ين 2 و 4. تمثل القضبان القيم المتوسطة مع SD. 1 ن . (D)إشارة الانارة كدالة لعدد من خلايا MCF-7 بذر. تم زرع خلايا MCF-7 في لوحات 96 بئر في رقم الخلية المشار إليها وسمح لها بالنمو لمدة 48 ساعة، وبعد ذلك تم قياس قدرة الخلية على البقاء. تمثل أشرطة الخطأ SD.1 n. ( E) كما هو موضح في D لخلايا MDA-MB-231. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 آثار نظم العلاج على المورفولوجيا الكروية وبقاء الخلايا. (أ) صور تمثيلية لكرويات MDA-MB-231 في اليوم 2 و 4 و 7. تم زرع خلايا MDA-MB-231 في لوحات مستديرة ذات قاع 96 بئر. بدأ العلاج بجرعات متزايدة من العلاج الكيميائي في اليوم 2، وفي ذلك الوقت كانت جميع الأغصان ذات الحجم المماثل. الصفوف تظهر كروية في جرعات متزايدة من العلاج الكيميائي، والأعمدة تظهر كروية ممثل الحجم في اليوم 2، 4، و 7 في الجرعة المشار إليها. وكانت أقل جرعة 18.75 nM Cisplatin, 18.75 NM دوكسوروبيسين, 0.0625 NM 5-فلوروراسيل (5-FU) وتضاعفت هذه الجرعة لكل صورة مبين, مما أدى إلى جرعة قصوى من 0.3 μM Cisplatin, 0.3 μM Doxorubicin و 2 NM 5-FU. مقياس شريط = 100 μm. (2 ن). (ب) قابلية بقاء الكرويات MDA-MB-231، تقاس على أنها الإضاءة، بعد 7 أيام من العلاج الكيميائي. تمثل الأشرطة القيم المتوسطة مع SEM. 2 ن (C , D) صور تمثيلية من MDA-MB-231 (C)و MCF-7 spheroids (D)في اليوم 2 و 4 و 7 و لMCF-7 spheroids 9. الخلايا البذر كما هو الحال في (أ) وتعامل مع العلاج الكيميائي (تشيمو، 18.75 nM سيسبلاتين، 18.75 nM دوكسوروبيسين، 0.0625 NM 5-FU) في اليوم 2 و 4 (ج) أو مع 2 ميكروم تاموكسيفين (تام) في اليوم 2، 4 و 7 (D). مقياس شريط = 100 μm. (4 n و 3 n)، على التوالي. (E,F) قابلية البقاء، تقاس على أنها الإضاءة، فياليوم 7 و 9 ل (ج) و (د)، على التوالي. لاختبار الفرق المهم إحصائياً بين الظروف تم إجراء اختبار T الطالب غير المقترنة. يشير إلى p < 0.0001. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 بروبيديوم iodide تلطيخ وتحليل وصمة عار الغربية من كرويرويدس. (أ) صور تمثيلية لكرويات MCF-7 الملطخة بـ PI بعد 9 أيام من العلاج. تم زرع خلايا MCF-7 في لوحات 96-مرفق منخفضة جدا نمت لمدة 9 أيام وعولجت مع تركيزات متزايدة من EIPA في اليوم 2 و 4 و 7. في اليوم 9، كانت الكرويات ملطخة بPI وتم الحصول على الصور على مجهر الفلورسنت. مقياس شريط = 200 μm. (1 ن.) (B) البقع الغربية التمثيلية لخلايا MDA-MB-231 بعد الضربة القاضية/الضربة القاضية لناقلات الحمض. وقد خرج NHE1 من قبل CRISPR/Cas9 في خلايا MDA-MB-231 12 والخلايا في وقت لاحق عابرة مع سيرنا ضد MCT4 أو NBCn1، ونمت كما كروية لمدة 9 أيام قبل أن lysed وتخضع لطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة ةيلالما ةيلالما ةيلالما ةيلالما ةيلالما ةيلالما ةيلالما ةيلالما ةيلالما ةيلالما ة (ج) قياس نسبة cPARP إلى مستوى البروتين PARP، تطبيع إلى مراقبة التحميل (β-actin). (1 ن). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 تحديد وتضمين وتحاليل الكيمياء المناعية للكرويات. (أ) تمثيل تخطيطي للبروتوكول لتضمين الكرويات. وتوضع علامات على الخطوات الفردية بوصفها (ط-7). (B) صورة مضمنة MDA-MB-231 كروية. شريط مقياس: 50 μm. (C)صورة تمثيلية للعلاج الكيميائي MDA-MB-231 كروية تخضع لتحليل IHC مع الأجسام المضادة ضد ف-53. تظهر الخطوط المتقطعة محيط الكروية. شريط مقياس = 20 μm. (D,E) صور تمثيلية من DMSO- أو العلاج الكيميائي المعالجة (الألواح العليا والسفلية، على التوالي) MDA-MB-231 spheroids. تم زرع خلايا MDA-MB-231 في لوحات مرفق منخفضة للغاية 96 بئر، نمت لمدة 7 أيام وعلاجها مع العلاج الكيميائي في اليومين 2 و 4. في اليوم 7، تم تضمين الكرويات تليها تحليل من قبل IHCمع الأجسام المضادة الأولية ضد كي-67 (D) و p53 (هاء). تمثل الصناديق البيضاء صور التكبير/التصغير. شريط مقياس = 20 ميكرومتر في كل من التكبير، (n = 3). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد ثبت استخدام كرويرويدال الخلايا السرطانية 3D أداة قيمة وتنوعا ليس فقط لفحص المخدرات المضادة للسرطان، ولكن أيضا للحصول على البصيرة الميكانيكية في تنظيم موت الخلايا السرطانية والقدرة على البقاء في ظل ظروف تحاكي تلك الموجودة في الورم الصغرى البيئة. وهذا أمر حاسم بشكل خاص حيث تتأثر تأثيرات العلاج الكيميائي والتأثيرات داخل الخلايا داخل الخلايا بشكل كبير بالظروف الفيزيائية الكيميائية في الورم، بما في ذلك الـحال الـحَس، وتوتر الأكسجين، وتورطُر الجسم، والجسدية و التفاعلات الكيميائية الخلية الخلية9،17. على سبيل المثال، الحموضة من درجة الحموضة خارج الخلايا، والتي يمكن أن تصل إلى قيم منخفضة تصل إلى 6-6.5 في العديد من الأورام الصلبة25،26،27،28،29،يسبب العلاج الكيميائي الأساسي ضعيف مركبات, مثل دوكسوروبيسين, ميتوإكسانترون وباكليتاكسل zwitterion, أن تكون مشحونة. وهذا يقلل من تناولها في الخلايا السرطانية ويمكن أن تؤثر على نشاط البروتينات المقاومة للأدوية المتعددة مثل ف-جليكوبروتين30،31،32. أيضا انتشار الخلايا، وهو محوري في تأثير معظم المركبات العلاج الكيميائي، وتخفض عموما في 3D مقارنة مع ظروف 2D، وبالتالي من المرجح أن تقليد أفضل في الورم كروية مما كانت عليه في 2D خلية ثقافة8،33 34. وأخيراً، فإن البيئة الدقيقة الورم الكثيفة هي أصل العديد من الإشارات المادية والقابلة للذوبان التي توجه مسارات الإشارات داخل الخلايا التي تنظم نمو الخلايا والبقاء والموت. وهكذا, عند تحليل فعالية المخدرات, نظم الثقافة 3D هي خطوة محورية قبل الشروع في نماذج في الجسم الحي. العيب الرئيسي للثقافة 3D، ومع ذلك، زيادة تعقيد التحليل بالمقارنة مع ثقافة 2D. لقد وصفنا هنا تقنيات بسيطة وغير مكلفة نسبيا لتشكيل كروية باستخدام مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا السرطانية. لقد أظهرنا أمثلة لكيفية تشكيل كروي يجب أن يكون الأمثل لكل نوع من الخلايا التي تمت دراستها ووصفنا كيفية الحصول على البيانات الكمية حول قدرة الخلية على البقاء، وموت الخلايا، ومسارات الإشارات المرتبطة بها، في مثل هذه الكروية. لا توجد اختلافات واضحة في النمو أو المورفولوجيبين بين النماذج الثلاثة الموصوفة هنا. في أيدينا، قد يكون الاختلاف في مورفولوجيا أكبر قليلا باستخدام طريقة إسقاط شنقا، ولكن ميزة من هذا الأسلوب هو أن rBM ليست هناك حاجة. لقد ركزنا هنا على الكرويات المنتجة من نوع خلية سرطانية واحدة. نموذج كروية، ومع ذلك، قابلة أيضا للثقافة المشتركة، على سبيل المثال من الخلايا السرطانية مع الخلايا الليفية، أحاديات / الضامة، والخلايا البطانية، و / أو الخلايا الدهنية35،36،37. وتشمل التطبيقات المتقدمة الأخرى لهذا النموذج تركيبة مع 3D الأجهزة السائلة المطبوعة مما يسمح بمد يد من خلال غشاء شبه نفاذية، تليها الحصاد للتنميط البروتيني الكمي38.
في حين، كما لوحظ أعلاه، النمط الظاهري للخلايا التي تزرع في كروية 3D يحاكي عموما أن من الأورام في الجسم الحي أفضل بكثير من الخلايا التي نمت في 2D، ومدى هذه الكرويات هي في الواقع النماذج ذات الصلة من الأورام الحي المقابلة تعتمد على العديد من العوامل ويجب أن يتم تقييمها بعناية. وتشمل المعلمات التي سوف تؤثر على مدى هذه الكرويات تحاكي حالة في الجسم الحي التكوين الخلوي للورم وتكوينها ECM النسبية. على سبيل المثال، فإن rBM التي قمنا باستخدامها كـ ECM في البروتوكولات المقدمة هنا هو خيار جيد لمحاكاة المراحل المبكرة من السرطانات الظهارية، في وقت قريب من خرق غشاء الطابق السفلي، وسوف تكون التراكيب ECM الأخرى أكثر ملاءمة لبعض الأورام ةيلاب ةيلاف ةيلاف ةيلاب ة وعلاوة على ذلك، تختلف القدرة على التصاق الخلية الخلية على نطاق واسع بين خطوط الخلايا السرطانية، اعتمادا على تعبيرها عن الخلية الخلية والخلايا المصفوفة البروتينات التصاق مثل الكادهيرين وintegrins22.
كما هو موضح هنا، يمكن بسهولة وعدم التوغل رصد النمو الكروي ة كل 2-3 أيام باستخدام المجهر الضوئي مع البصريات التكبير منخفضة ومجال كبير من الرؤية. ومع ذلك، لأن الإجهاد السامة للخلايا، مثل العلاج الكيميائي، يؤثر على المورفولوجيا كروية بشكل مختلف جدا، وبطريقة ما، اعتمادا على نوع الخلية ومخطط العلاج، فإنه لا يكفي الاعتماد على المورفولوجيا ومحيط وحدها لتقييم تأثير العلاج. على سبيل المثال، قد تصبح الكرويات أكثر مرونة مع العلاج ووفاة الخلايا الناشئة، أو قد تحدث جميع الوفيات في النواة النخرية، في حين أن السطح لا يتأثر بشكل ملحوظ. في كلتا الحالتين ، قد تكون النتيجة انطباع خاطئ بأن عدد الخلايا الحية في الكروية لا يتم تقليله بالعلاج. ولذلك فإن التقنيات الكمية والكاملة هي ضرورية لتقييم تأثير العلاج. لتقييم كمية من موت الخلية, اختبار حمض الفوسفاتيز, الذي كما يوحي الاسم يقيس نشاط الفوسفاتيز حمض السيتوسيليك وقد استخدمت21. ومع ذلك، في أيدينا، في حين أن هذا التقييم يعكس بشكل جيد عموما عدد الخلايا المزروعة، فإنه لا يلتقط بشكل كاف سرعة الموت الناجم عن الخلايا الناجمة عن العلاج (البيانات غير مبينة)، على الأرجح لأن الفوسفاتيز الحمضية لا تزال نشطة لبعض الوقت بعد موت الخلية. وعلاوة على ذلك، يتطلب هذا التقييم إزالة كاملة من الوسط، مما يزيد من الخطأ وخاصة مع هشة، العلاج الكيميائي المعالجة كرويرويدس. تم اختيار تقييم صلاحية الخلية الموصوف هنا، والذي يستند إلى محتوى ATP الخلوي، بناءً على بروتوكوله البسيط والفعال للوقت وإمكانية تكراره العالية. وعلاوة على ذلك، هذا الإسهاب لا يتطلب إزالة كاملة من وسط الثقافة الذي هو ميزة عند العمل مع كرويرويدس. كما هو مبين في النتائج التمثيلية, هذا الخضوع يلتقط جيدا على حد سواء عدد الخلايا والآثار المتوقعة العلاج الكيميائي. ومع ذلك، فإن المزالق من هذه التقنية هو، من الواضح، أن التغيرات الأيضية الحد من محتوى ATP داخل الخلايا قد يتم تسجيلخطأ كرقم خلية أقل. ومن ثم، فإن التقييم المتوازي لحجم ومورفولوجيا كروية، أو تلطيخ بي، من المستحسن التحقق من صحة النتائج.
يمكن أن يوفر Lysis Spheroid متبوعاً بالنشاف الغربي نظرة شبه كمية في حالة عمليات الإشارات، ومسارات موت الخلايا، والنمو، والقدرة على البقاء. استخدام النشاف الغربية معقدة عندما يتم استخدام rBM لإعداد كروية، لأن هذا سوف تشكل جزءا كبيرا من محتوى البروتين ليسات، والأهم من ذلك، فإن مساهمته اكسور زيادة مع انخفاض المحتوى الخلوي خلال موت الخلايا العلاجالكيميائي. فمن الممكن من حيث المبدأ لإزالة rBM عن طريق الطرد المركزي؛ ومع ذلك، هذه خطوة حاسمة، حيث أنه من الصعب إزالة كل rBM تماما، وهذا سوف يحول دون المقارنة الكمية بين الظروف. وبالنسبة لهذه الكرويات، وبصفة عامة، فإن التقييم المحلول مكانياً لمسارات الموت وبارامترات الإشارة ذات الصلة، وتضمينها وIHC أدوات قوية. ويمكن النظر في نهج أخرى: التصوير البؤري الحي للكرويات (الصغيرة نسبيا) السليمة39. خاصية أخرى مثيرة للاهتمام من كرويرويدهو أنه نظرا ً لشكل "الكرة" العادية بدلاً من ذلك، فإنها تصلح بشكل جيد لتكرار بين النمذجة الرياضية وتجارب المختبر الرطب، لزيادة فهم أهمية المذكورة أعلاه تدرجات الأكسجين ودرجة الألف والمواد الغذائية داخل الكروية، وعن طريق الاستقراء، والأورام40،41. وهكذا، على الرغم من أن نماذج الورم 3D الهامة من تعقيد أكبر بكثير آخذة في الظهور، بما في ذلك مجموعة واسعة من الثقافات organotypic والعضوية على أساس السقالات البيولوجية المعقدة وكذلك خاملة، وليس آخرا، xenografts المشتقة من المريض42، تظل الكرويات أداة هامة بسبب أهميتها البيولوجية الفائقة مقارنة بالثقافة ذات الأبعاد 2، بالإضافة إلى سهولة التعامل النسبية.
باختصار، نحن نقدم هنا سلسلة من الطرق البسيطة لتحليل التغيرات الناجمة عن العلاج المضاد للسرطان في قدرة الخلايا السرطانية على البقاء والموت في ثقافة ثلاثية الأبعاد. ويمكن تعديل تكوين الكروية اعتمادا على خصائص وبيولوجيا الخلايا المستخدمة، والتحليلات الكمية والنوعية المقدمة مفيدة في كل من تقييم العلاقة بين الجرعة والاستجابة واكتساب نظرة ثاقبة في إشارات ومسارات الموت المعنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولم يعلن أصحاب البلاغ عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لكاترين فرانكلين مارك وأنيت بارتلز للمساعدة التقنية الممتازة وأسبيورن نور-نيلسن لإجراء التجارب في الشكل 1D. تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة إينار ويلمسن، ومؤسسة نوفو نورديسك، ومؤسسة جوشوم (جميعها إلى SFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
