Summary
Aquí, presentamos varios métodos simples para evaluar la viabilidad y la muerte en esferoides de células cancerosas 3D, que imitan los gradientes fisicoquímicos de los tumores in vivo mucho mejor que el cultivo 2D. El modelo esferoide, por lo tanto, permite evaluar la eficacia del fármaco oncológico con una mejor traducción a condiciones in vivo.
Abstract
Los esferoides tridimensionales de las células cancerosas son herramientas importantes tanto para las pruebas de análisis de drogas contra el cáncer como para obtener información mecanicista sobre la biología de las células cancerosas. El poder de esta preparación radica en su capacidad para imitar muchos aspectos de las condiciones in vivo de los tumores, al mismo tiempo que es lo suficientemente rápido, barato y versátil como para permitir un cribado relativamente alto. Las condiciones del cultivo esferoide pueden recapitular los gradientes fisicoquímicos en un tumor, incluyendo la creciente acidez extracelular, aumento de lactato, y disminución de la disponibilidad de glucosa y oxígeno, desde la periferia esferoide hasta su núcleo. Además, las propiedades mecánicas y las interacciones célula-células de los tumores in vivo son en parte imitadas por este modelo. Las propiedades específicas y, en consecuencia, las condiciones óptimas de crecimiento, de los esferoides 3D, difieren ampliamente entre diferentes tipos de células cancerosas. Además, la evaluación de la viabilidad celular y la muerte en esferoides 3D requiere métodos que difieran en parte de los empleados para cultivos 2D. Aquí describimos varios protocolos para la preparación de esferoides 3D de células cancerosas, y para el uso de estos cultivos para evaluar la viabilidad celular y la muerte en el contexto de la evaluación de la eficacia de los fármacos contra el cáncer.
Introduction
El uso de modelos de esferoides multicelulares en la biología del cáncer tiene varias décadas de edad1,2, pero ha ganado un impulso sustancial en los últimos años. En gran parte, esto refleja una mayor conciencia de cuán fuerte depende el fenotipo de las células cancerosas de su microambiente y de las condiciones específicas de crecimiento. El microambiente en tumores sólidos es fundamentalmente diferente del de los tejidos normales correspondientes. Esto incluye condiciones fisicoquímicas como pH, tensión de oxígeno, así como presión intersticial, gradientes de concentración de factores solubles como nutrientes, productos de desecho y compuestos de señalización secretados (factores de crecimiento, citoquinas). Además, incluye la organización de la matriz extracelular (ECM), las interacciones célula-célula y la señalización intercelular,y otros aspectos de la arquitectura tridimensional particular (3D) del tumor 3,4, 5,6. Las condiciones microambientales específicas en las que existen las células cancerosas afectan profundamente su perfil de expresión génica y sus propiedades funcionales, y está claro que, en comparación con el de las células cultivadas en 2D, el fenotipo de los esferoides 3D imita mucho más de cerca el de los tumores in vivo7,8,9,10,11. Los modelos 2D, incluso si emplean hipoxia, pH ácido y altas concentraciones de lactato para imitar aspectos conocidos del microambiente tumoral, todavía no capturan los gradientes de los parámetros fisicoquímicos que surgen dentro de los tumores, así como su tumor 3D Arquitectura. Por otro lado, los modelos animales son costosos, lentos y éticamente problemáticos, y en general, también tienen deficiencias en su capacidad para recapitular las condiciones tumorales humanas. En consecuencia, los esferoides 3D se han aplicado como modelo de complejidad intermedia enestudios de una amplia gama de propiedades de la mayoría de los cánceres sólidos 9,11,12,13, 14,15,16,17.
Un uso ampliamente empleado de esferoides 3D es en ensayos de detección de eficacia de la terapia contra el cáncer9,18,19,20. Las respuestas al tratamiento son particularmente sensibles al microambiente tumoral, lo que refleja tanto el impacto de la tortuosidad, la difusión restringida, la alta presión intersticial y el pH ambiental ácido en la administración de fármacos, como el impacto de la hipoxia y otros aspectos del microambiente en la respuesta a la muerte celular9,17. Debido a que el entorno dentro de los esferoides 3D desarrolla intrínsecamente todas estas propiedades7,8,9,10,11, el empleo de cultivos celulares 3D puede mejorar sustancialmente la traducción de los resultados a condiciones in vivo, sin embargo, permitir un cribado eficiente y asequible de alto rendimiento del crecimiento neto. Sin embargo, la gran mayoría de los estudios sobre la respuesta farmacológica de las células cancerosas todavía se llevan a cabo en condiciones 2D. Esto probablemente refleja que, mientras que algunos ensayos se pueden implementar relativamente fácilmente para cultivos celulares 3D, muchos, como ensayos de viabilidad, hincha occidental y análisis de inmunofluorescencia, se realizan mucho más convenientemente en 2D que en 3D.
El objetivo del presente trabajo es proporcionar ensayos fácilmente susceptibles y protocolos precisos para analizar el efecto del tratamiento con fármacos contra el cáncer en la viabilidad y supervivencia de las células cancerosas en un entorno de imitación de tumores 3D. Específicamente, proporcionamos y comparamos tres métodos diferentes para la formación de esferoides, seguidos de métodos para análisis cualitativos y cuantitativos de crecimiento, viabilidad y respuesta a fármacos.
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Protocol
1. Generación de esferoides
- Preparación de suspensiones celulares para la formación de esferoides
NOTA: Diferentes líneas celulares tienen propiedades de adhesión muy diferentes y se debe establecer el protocolo de formación de esferoides más adecuado en cada caso. Hemos encontrado que las células MCF-7 y BxPC-3 son adecuadas para la formación espontánea de esferoides, mientras que MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 y MiaPaCa requieren la adición de membrana de sótano reconstituida para formar con éxito esferoides. Solamente las células MDA-MB-231 y BxPC-3 se han empleado para el protocolo de caída colgante, sin embargo otras líneas celulares son ciertamente aplicables.- Cultivar células como monocapa hasta 70-80% de confluencia.
- Lavar las células con solución salina tamponada de fosfato (1x PBS, 5 ml para un matraz de 25 cm2 o 10 ml para un matraz de 75 cm2), añadir la enzima disociación celular (0,5 ml para un 25 cm2 o 1 ml para un matraz de 75 cm2) e incubar las células durante 2-5 min a 37 oC en 5% CO2 y 95% de humedad.
- Compruebe el desprendimiento celular bajo un microscopio y neutralice la enzima disociación celular añadiendo medio de crecimiento (6-10% de suero dependiendo de la línea celular) a un volumen total de 5 ml en un 25 cm2 o 10 ml para un matraz de 75 cm2.
- Utilice una cámara de B-rker para contar las células y contar 8 cuadrados en la cámara por preparación celular para obtener una alta reproducibilidad del tamaño de los esferoides.
NOTA: A continuación se presentan tres protocolos que describen un método diferente para la formación de esferoides. El protocolo 1.2 y 1.3 se puede utilizar para todos los protocolos analíticos posteriores presentados, mientras que el protocolo 1.4 es el más adecuado para la incrustación y los preparados de lisado. Dependiendo de la línea celular, la formación de esferoides toma 2-4 días, independientemente del método utilizado.
- Formación espontánea de esferoides
- Realice los pasos 1.1.1-1.1.4.
- Diluir la suspensión celular en un tubo de 15 ml para obtener 0,5-2 x 104 celdas/ml (es necesario determinar la densidad celular óptima para cada línea celular) (Figura1A (ii)).
- Llenar el anillo exterior de los pozos con 1x PBS o medio de crecimiento para reducir la evaporación de los pozos restantes. Transfiera la suspensión celular a un depósito estéril y, utilizando una pipeta multicanal, dispensar 200 l/bien en placas inferiores redondas de 96 pocillos (Figura1A (iii)).
- Incubar la placa en una incubadora a 37oC con 5% de CO2,95% de humedad.
- Cada 2-3 días adquieren imágenes microscópicas ligeras de los esferoides.
NOTA: Las imágenes de este artículo se toman a 11,5x aumento, que es apropiado para la mayoría de los esferoides preparados utilizando estos protocolos. - Cada 2-3 días (después de adquirir imágenes) reemplazar 100 s de medio (eliminar 100 sl del medio gastado y reemplazar con 100 s de medio fresco.
NOTA: Para evitar la eliminación de esferoides al reemplazar el medio, es aconsejable inclinar la placa un poco mientras se retira lentamente el medio e inspeccionar el medio aspirado en las puntas en busca de esferoides visibles antes de desecharlo.
- Formación de esferoides mediadas por membrana del sótano reconstituido.
NOTA: Se utilizó la membrana de sótano reconstituida del factor de crecimiento reconstituido (rBM) libre de factor de crecimiento libre de lactosa deshidrogenasa (LDEV). rBM es sensible a la temperatura y siempre debe mantenerse en hielo, ya que coagulará si alcanza los 15 oC. Descongelar el rBM sobre hielo, ya sea durante la noche a 4 oC o 2-4 h a temperatura ambiente (RT) antes de enchapar.- Descongelar rBM sobre hielo (ver Tabla de Materiales).
- Conservar las placas y los depósitos (si se envuelven individualmente) en hielo antes de su uso.
- Realice los pasos 1.1.1-1.1.4.
- Llenar el anillo exterior de los pozos con 1x PBS o medio de crecimiento para reducir la evaporación de los pozos restantes. Diluir la suspensión celular en un tubo de 15 ml para obtener 0,5-2 x 104 celdas/ml (es necesario determinar la densidad celular óptima para cada línea celular) (Figura1A (ii)).
- Coloque el tubo de 15 ml que contiene la suspensión de células diluidas sobre hielo (por ejemplo, en vaso de vidrio) (Figura1A (iia)).
- Transfiera las placas refrigeradas y los depósitos a la campana. Enjuague los recipientes de plástico, llénelos con hielo y transfieralos a la campana para permitir que las placas y depósitos se coloquen sobre hielo durante todo el procedimiento.
- Resuspenda el rBM suavemente para asegurar un gel homogéneo.
- Añadir 1-2% rBM (se debe determinar la concentración óptima para cada línea celular) a las suspensiones de células refrigeradas (Figura1A (iib)).
- Invierta el tubo de 15 ml para asegurar la mezcla adecuada de rBM y suspensión de celda antes de dispensar la suspensión en la placa.
- Transfiera la suspensión de la célula que contiene rBM a un depósito estéril y dispensar 200 l/bien en placas de fijación ultrabaja refrigeradas de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal (Figura1A (iii)).
NOTA: Si se trabaja con varias suspensiones celulares (por ejemplo, más de una línea celular), es esencial dispensar cada suspensión celular inmediatamente después de la adición de rBM para prevenir el gelificación prematura. - Centrifugar la placa durante 15 minutos a 750 x g utilizando "suave decente" /sin frenado (si es posible, centrifugar a 4 oC para mantener el líquido rBM más tiempo, pero no es un requisito para la formación exitosa de esferoides), para asegurar que las células se agrupan cuando el rBM se endurece, facilitando la formación de un solo esferoide.
- Incubar la placa en una incubadora (37oC, 5% CO2,95% de humedad).
- Cada 2-3 días adquiere imágenes microscópicas ligeras para evaluar el crecimiento esferoide.
- Cada 2-3 días reemplace 100 ml de medio (retire 100 ml y reemplácelo por 100 ml de medio fresco).
- Esferoides colgantes.
- Realice el paso 1.1.1-1.1.4.
- Diluir las células para obtener una dilución adecuada. Una dilución práctica es de 50.000 células/ml.
- Retire la tapa de un plato de cultivo celular de 10 cmy colóquelo para que esté mirando hacia arriba. Agregue 6 mL de 1x PBS al plato (Figura1B (i)).
- Vierta la suspensión celular en un depósito estéril y coloque cuidadosamente hasta 30 gotas de 40 s de suspensión celular en la tapa de la placa de cultivo celular utilizando una pipeta multicanal (Figura1B (ii)), lo que resulta en una concentración de 2.000 células/gota. Evite colocar las gotas demasiado cerca del borde de la tapa, ya que es más probable que estas gotas pierdan tensión superficial al invertir la tapa en el siguiente paso.
- Invierta la tapa en un movimiento rápido pero controlado y colóquela encima de la 1x plato de cultivo celular que contiene PBS (Figura1B (iii)).
- Colocar el plato en una incubadora a 37oC con 5% de CO2 y 95% de humedad sin perturbar las gotas y dejarlas crecer durante 4-6 días.
- Si se utiliza para los lysates proteicos o incrustaciones, esferoides de la piscina quitando la tapa e inclinándola, con el fin de lavar las gotas con 1 ml de medio calentado. Transfiera el medio resultante que contiene esferoides a un tubo de 1,5 ml y permita que se asienten en la parte inferior del tubo. Proceda como se describe en 4.4 y 6.2.2 para los lisatos proteicos y la incrustación, respectivamente.
2. Tratamiento farmacológico de esferoides
NOTA: El tratamiento farmacológico a largo plazo se puede aplicar a los esferoides con el fin de detectar los efectos de un medicamento de interés. Antes de iniciar el tratamiento farmacológico, es aconsejable realizar un experimento de respuesta a la dosis de los fármacos, con el fin de encontrar una dosis adecuada para el tratamiento experimental. Las dosis deben basarseen el IC 50 /Ki determinado de la droga y van desde alrededor de 0.2x-10x de este valor.
- Configurar 6-12 esferoides según la condición deseada como se describe en 1.2 o 1.3 y colocar en la incubadora (37 oC, 5% CO2, 95% de humedad) durante 2 días.
- El día 2, tome imágenes microscópicas ligeras de los esferoides.
- Preparar las primeras dosis de tratamiento (después de adquirir imágenes).
NOTA: La primera concentración de tratamiento debe ser el doble de la concentración final deseada, ya que la solución se diluirá 1:2 ala adicional al pozo que contenga un medio de 100 ml. Intervalos de tratamiento de drogas sugeridos (dependerán de la vida media del medicamento): Día 2, 4 y 7. - Con una pipeta multicanal, retire suavemente 100 ml de medio y reemplácelo por un medio que contenga 100 ml de fármaco.
- Vuelva a colocar la placa de 96 pocillos en la incubadora a 37oC con 5% de CO2 y 95% de humedad y repita 2,3 y 2,4 en los días de tratamiento elegidos, pero ahora sin duplicar la dosis para obtener la dosis final correcta.
- En el último día del programa de protocolo/tratamiento, se pueden realizar uno o varios de los siguientes ensayos.
3. Ensayo de viabilidad celular para esferoides
- Colocar 4-6 esferoides según la condición deseada como se describe en 1.2 o 1.3 y colocar en la incubadora a 37 oC con 5% co2 y 95% de humedad.
NOTA: En este caso, el ensayo de viabilidad celular se realizó el día 7 o 9, después de haber monitoreado el crecimiento esferoide cada 2-3 días mediante microscopía ligera como se describió anteriormente (punto 1.2.5 y 1.3.13). - Descongelar el reactivo de ensayo de viabilidad (ver Tabla de Materiales)y dejar que se equilibre a RT antes de su uso.
- Mezclar suavemente invirtiendo para obtener una solución homogénea.
- Antes de realizar el ensayo, retire el 50% del medio de cultivo de los esferoides (100 l).
- Añadir reactivo de viabilidad celular a cada pocal en una proporción de 1:3 a la cantidad de medio presente en el pozo (Figura2A (i)) Para una placa de 96 pocillos, añadir 50 sl de reactivo a 100 s l de medio.
- Mezclar el contenido vigorosamente durante 5 min para inducir la lisis celular (Figura2A (ii)).
- Incubar durante 25 minutos a RT para estabilizar la señal luminiscente (Figura2A (iii)).
- Registre la señal luminiscente (Figura2A (iv)).
4. Preparación de los lisiados proteicos para la blota occidental de cultivos esferoides 3D
NOTA: Al recoger los esferoides, es aconsejable utilizar una pipeta P200 y cortar el extremo de la punta para permitir una apertura más grande y por lo tanto una captura más fácil de los esferoides sin perturbar su estructura.
- Para cada condición, piscina un mínimo de 12, idealmente 18-24 esferoides (dependiendo del tamaño de los esferoides) en un tubo de 1,5 ml (evitar 2 tubos ml, ya que los siguientes pasos se volverán más difíciles debido a su fondo menos puntiagudo).
NOTA: Si la cantidad de medio supera los 1,5 ml antes de haber recogido todos los esferoides, permita que los esferoides recogidos se asienten en la parte inferior (ocurre muy rápidamente, centrifugación no es necesaria) y deseche la mitad del volumen del tubo antes de continuar recogiendo el esferoides restantes. - Coloque los tubos sobre hielo y deje que los esferoides se asienten en la parte inferior del tubo de 1,5 ml.
- Muévase del laboratorio de células estériles al laboratorio regular.
- Lave los esferoides dos veces en 1 ml de hielo frío 1x PBS. Deje que los esferoides se asienten antes de eliminar 1x PBS entre cada paso de lavado.
- Aspirar tanto 1x PBS como sea posible sin molestar o eliminar los esferoides.
- Añadir 5 l de tampón de lisis calentado (LB) con inhibidores de fosfatasa y proteasa, por esferoide (p. ej., 10 esferoides a 50 l de LB).
- Repetir intervalos de vórtice seguidos de girar hacia abajo hasta que se disuelvan los esferoides. Realizar un ciclo de vórtice durante 30 s seguido de centrifugación (un giro rápido usando una centrífuga de mesa es suficiente) durante 10 s durante aprox. 5-10 min dependiendo del tamaño y la compacidad de los esferoides.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Mantener los lisados a -20 oC hasta proceder con sonicación, homogeneización y determinación de proteínas como en un protocolo estándar de lisado de proteína 2D, seguido de la hincha occidental utilizando protocolos estándar.
5. Propidium Yodida (PI) Mancha de esferoides
- Colocar 3-6 esferoides por condición deseada como se describe en 1.2 o 1.3 y colocar en la incubadora a 37 oC con 5% co2 y 95% de humedad.
- En un laboratorio de cultivo celular estéril, calienta 1x PBS a 37oC.
- Hacer una solución de PI de 4 M diluyendo la solución de stock en 1x PBS: Diluir un stock acuoso de 1 mg/ml de PI 1:350 en 1x PBS.
NOTA: Esta concentración se reducirá aún más a la mitad tras la adición de la solución a los pozos, dando una concentración final de 2 M. 100 l de esta solución para cada pocil que contenga un esferoide.
PRECAUCION: El yoduro de propidium (PI) debe manipularse en una campana de humos y usar guantes. PI es sensible a la luz. Protéjase de la luz durante la manipulación. - Retire 100 s del medio de cada pocal en la placa de 96 pocillos sin quitar las esferoides.
- Lavar el medio restante añadiendo 100 s de PBS 1x calentado a todos los pozos seguido de la eliminación de 100 ml del líquido en los pozos. Repita este paso de lavado 3 veces.
- Añadir 100 oC de la solución PI a cada pocal, cubrir la placa en papel de aluminio y colocarla en una incubadora a 37 oC con 5% de CO2 y 95% de humedad durante 10-15 min.
- Repita los 3 pasos de lavado descritos en 4.5 para lavar la solución de PI, con el fin de disminuir la señal de fondo al tomar imágenes.
- Utilice un microscopio de epifluorescencia para crear una imagen de los esferoides. Para evaluar la viabilidad de las células en el núcleo esferoide, tome pilas z para obtener imágenes con diferentes profundidades del esferoide.
NOTA: Se recomienda un tamaño de paso de alrededor de 18-35 m entre cada rebanada dependiendo del tamaño de la esferoide, dando aproximadamente 11-18 pilas por esferoide. Las pilas Z se pueden procesar en ImageJ utilizando la función de proyección z, que puede combinar todas las pilas z en una imagen final, dando una visión general de la tinción en todo el esferoide (para más pautas sobre el uso de ImageJ para este propósito, ver (https://imagej.net/Z-functions).
6. Incorporación de esferoides 3D
-
Preparar el gel de agarosa en el que están incrustados los esferoides (sólo es necesario realizar el protocolo por primera vez).
- Mezclar 1 g de bactoagar en 50 mL de ddH2O.
- Calentar lentamente en el horno microondas hasta que el bactoagar se haya disuelto y se haya formado un gel homogéneo. No deje que el gel hierva.
- Mantener el bactoagar caliente en un baño de agua a 60 oC.
- Manténgase a 4 oC entre los experimentos.
-
Incrustación de esferoides.
- En el día 1, para cada condición, agrupa un mínimo de 12 esferoides en un tubo de 1,5 ml.
- Lavar una vez con 1 ml de hielo-frío 1x PBS.
- Para fijar los esferoides, agregue 1 ml de 4% de paraformaldehído.
NOTA: El manejo del paraformaldehyde debe realizarse en una campana de humo. - Déjalos incubar durante 24 h a RT.
- El día 2, calienta el gel de agarosa cuidadosamente colocándolo en un vaso de precipitados relleno de agua en un horno microondas. ¡Asegúrese de que el gel no hierva! Mantener caliente en una placa de calentamiento de sobremesa, a 60 oC hasta su uso.
- Lave los esferoides dos veces con 1 ml de hielo frío 1x PBS.
- Aspirar la mayor parte de los 1x PBS (dejando aproximadamente 100 l en este punto es práctico para el manejo de los esferoides).
- Prepare una pipeta de 20 ml cortando la punta de la pipeta en una pendiente para obtener una punta más puntiaguda con un agujero más grande (ver ilustración).
NOTA: La siguiente parte debe hacerse rápidamente para asegurar una transferencia óptima de esferoides y para evitar la solidificación de la gota de gel. Si no hay ningún bloque de calentamiento disponible, se recomienda primero coger los esferoides y luego hacer que la agarosa caiga (es decir, cambiar el orden de los puntos 6.2.9 y 6.2.10). - Haga una gota de gel de agarosa en una diapositiva del microscopio. Coloque la corredera en un bloque de calentamiento caliente para evitar que la agarosa se solidifique.
- Usando la punta de la pipeta modificada (ver 6.2.8), capture tantos esferoides como sea posible en un volumen de 15-20 l.
- Inyecte cuidadosamente el 15-20 l de esferoide que contiene 1pbS en el centro de la gota de gel de agarosa sin tocar la diapositiva del microscopio.
NOTA: Este es un punto un poco difícil. Los esferoides se perderán si la punta de la pipeta toca la diapositiva del microscopio al inyectar los esferoides en la gota de gel. Es aconsejable practicar todo el proceso de hacer la gota de agarosa e inyectar los esferoides inyectando un líquido de color en la gota. Esto permitirá la visualización de una penetración potencial a través de la gota, ya que el líquido de color se filtrará sobre la diapositiva. - Deje que el gel de agarosa se endurezca incubando durante 5-10 min a RT o a 4oC. Una vez que la gota de gel se haya solidificado un poco (pero todavía es bastante suave), empuje cuidadosamente la gota de gel del microscopio deslizarse en un casete de tejido plástico con un bisturí.
- Cubra los cassettes de tejido plástico en 70% de etanol.
NOTA: En este punto, los esferoides se pueden utilizar directamente o almacenar durante meses. - Incruste el esferoide incrustado en agarosa en parafina, en sección en diapositivas de capa de 2-3 m de espesor y mancha con hematoxilina y eosina o sujeto a tinción inmunohistológica.
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Representative Results
Ensayos de crecimiento esferoide basados en el protocolo de formación de esferoides esquemáticamente ilustrado en la Figura 1A y la Figura 1B, se utilizaron como punto de partida para el análisis de los efectos de los tratamientos farmacológicos contra el cáncer en un tumor 3D imitando el ajuste. La facilidad con la que se forman los esferoides es específica de la línea celular, y algunas líneas celulares requieren la suplementación con rBM con el fin de formar esferoides coherentes22. La concentración de rBM añadido puede afectar profundamente la morfología de los esferoides. Como se muestra en la Figura 1C y la Figura 1D, variar la concentración de rBM entre 0 y 4% altera la compacidad y morfología de los esferoides de una manera dependiente del tipo de célula. Figura 1 C demuestra cómo la adición de hasta 2,5% de rBM permite la formación de esferoides en células de cáncer de mama SKBr-3, sin ningún efecto adicional en concentraciones superiores al 2,5% de rBM. Por el contrario, las células del adenocarcinoma ductal pancreático BxPC3 (PDAC), que presentan una morfología epitelial, forman espontáneamente esferoides pequeños y compactos (Figura1D,superior, panel izquierdo). En este tipo de célula, el aumento de la concentración de rBM a 1,5% o por encima provoca un cambio morfológico distinto de esferoide a estructuras más enrevesadas con protuberancias e invaginaciones, que recuerdan a la formación de estructura tubular ductal. Por el contrario, la adición de rBM a otras dos líneas celulares PDAC, MiaPaCa y Panc-1, que tienen un fenotipo más mesenquimal, permite que los agregados celulares sueltos se vuelvan más apretados y formen esferoides más compactos (Figura1D, medio e inferior (paneles). Estos resultados muestran que la cantidad precisa de rBM que resulta en la formación óptima de esferoides debe ser valorada para cada línea celular y condición.
Una evaluación cuantitativa de la viabilidad celular dentro de los esferoides en el tratamiento farmacológico fue necesaria para evaluar el efecto de los tratamientos farmacológicos contra el cáncer. El ensayo descrito aquí es un ensayo basado en luciferina-luciferasa, que mide ATP liberado de células vivas dentro de esferoides. El principio del ensayo se ilustra en la Figura 2A. La señal luminiscente generada en este ensayo es fácilmente grabada por un lector de placas (Figura2A)y se correlaciona bien con la viabilidad medida por otros métodos23. La relación lineal entre la concentración de ATP y la luminiscencia en el rango de concentración relevante se muestra en la Figura 2B, mientras que la Figura 2C muestra la capacidad del ensayo para evaluar la muerte celular en esferoides 3D tratados con terapia contra el cáncer. Con el fin de evaluar aún más la linealidad del ensayo en el rango pertinente, se llevaron a cabo experimentos para establecer curvas estándar de la señal luminiscente en función del número de células (Figura2D y Figura 2E ). Estos resultados indican que el ensayo es adecuado para estimar la viabilidad celular en cultivos esferoides 3D y que es aplicable para investigar la pérdida inducida por fármacos de viabilidad celular.
Una combinación de imágenes microscópicas ligeras adquiridas cada dos o tres días, durante el período de tratamiento y una evaluación cuantitativa final de la viabilidad celular permite una estrecha supervisión del crecimiento y morfología esferoide, así como la evaluación del tratamiento óptimo Dosis. Este último se ejemplifica en la Figura 3A y la Figura 3B,donde se realizó un experimento dosis-respuesta para determinar la dosis necesaria para una viabilidad celular reducida al 50% en esferoides de cáncer de mama MDA-MB-231. Los efectos del tratamiento sobre la morfología esferoide se visualizan en la Figura 3C y la Figura 3D para los esferoides MDA-MB-231 y MCF-7, respectivamente. Durante el tratamiento con el cóctel quimioterapéutico elegido, la compactación de los esferoides MDA-MB-231 aumenta, mientras que durante el tratamiento con tamoxifeno, los esferoides MCF-7 se deshilachan cada vez más y son desiguales. En ambos casos, una caída clara en la viabilidad celular es visible después de 7 (MDA-MB-231) o 9 (MCF-7) días de tratamiento (Figura3E y Figura 3F). Esto demuestra la necesidad de una evaluación visual y cuantitativa de los efectos mediados por el tratamiento sobre la viabilidad y morfología de las células esferoides, así como que estos parámetros son altamente específicos de tipo celular y de tratamiento.
Como suplemento al ensayo de viabilidad celular, la tinción de células muertas con PI, que no puede cruzar la membrana y por lo tanto sólo mancha las células apoptoticas necróticas o tardías con integridad de membrana comprometida, permite una evaluación espacial rápida de las células muertas en respuesta al tratamiento, sin el protocolo que consume mucho tiempo de incrustación, seccionamiento e IHC. Como se ilustra en la Figura 4A la disposición espacial de las células muertas tras una concentración creciente de un inhibidor, en este caso, el na+/H+ intercambiador 1 (NHE1) inhibidor 5-(N-etil-N-isopropílico)-amiloride (EIPA), puede ser Visualizado. Como se ha visto, los esferoides de control muestran un núcleo apopótico necrótico/tardío limitado, mientras que las células muertas se distribuyen por todo el esferoide a medida que aumenta la concentración de EIPA.
Con el fin de cuantificar la inducción relativa del estrés apoptótico después de diferentes tratamientos, los esferoides fueron lysed y sometidos a electroforesis de gel SDS-PAGE y hincha occidental para polimerasa de longitud completa y cenada (ADP-ribosa) polimerasa (PARP). Los resultados representativos se muestran en la Figura 4B y en la Figura 4C. En este experimento, se prepararon esferoides a partir de células MDA-MB-231 en las que el cotransportador de lactato-protones MCT4 o el Na+, HCO3- cotransportador NBCn1 fueron derribados usando siRNA. El derribo fue evaluado por la hinchada occidental para MCT4 y NBCn1 (datos no publicados). Como se ha visto, el derribo de MCT4, pero no de NBCn1, aumenta robustamente el escote PARP, consistente con nuestra demostración anterior de que el derribo estable de MCT4 en células MDA-MB-231 disminuye el crecimiento tumoral in vivo24.
Para analizar más a fondo los efectos del tratamiento y obtener información sobre las vías específicas de señalización, detención del crecimiento y muerte activadas, los esferoides pueden, además del análisis de manchas occidentales, integrarse y someterse a análisis de inmunohistoquímica (IHC). El análisis IHC de las secciones esferoides permite el uso de anticuerpos o marcadores específicos de proliferación celular, ciclo celular y muerte celular programada, y facilita una visualización de la disposición espacial de las células proliferativas y apoptoticas en el esferoide.
En la Figura 5Ase presenta una figura esquemática del protocolo de incrustación para el análisis IHC de esferoides. En la Figura 5Bse muestra una imagen microscópica de luz representativa de una sección microtome de aprox. 3 m de espesor de un esferoide incrustado, y una imagen de inmunofluorescencia de un esferoide manchado para la proteína supresora de tumores p53 (nuclei manchado utilizando DAPI), se muestra como Figura 5C. En la Figura 5D y la Figura 5E, respectivamente, se muestran ejemplos de esferoides tratados con DMSO y esferoides tratados con quimioterapia para el marcador de proliferación celular Ki-67 o para p53. En consonancia con el efecto antiproliferativo del tratamiento de quimioterapia, el número de células positivas Ki-67 es mayor en el control de DMSO que en el esferoide tratado con quimioterapia (Figura5D). Por el contrario, la expresión p53 aumenta durante las condiciones de estrés celular, apoptosis y detención del crecimiento, y en consecuencia, el número de células manchadas de p53 es sustancialmente mayor en los esferoides tratados con quimioterapia en comparación con los controles DMSO (Figura5 E).
Estos resultados ilustran ejemplos de cómo se puede obtener información resuelta espacialmente (tinción PI, IHC) o cuantitativa (hincha occidental) sobre los efectos del tratamiento de fármacos en los esferoides 3D.
Figura 1 : Formación espontánea de esferoides mediadas por rBM. (A) Representación esquemática de la formación de esferoides utilizando placas inferiores redondas de fijación ultrabaja de 96 pocillos, con uso opcional de rBM. Pasos individuales marcados por (i-iii). (B) Representación esquemática de la formación de esferoides utilizando el método de gota colgante. Los pasos individuales están marcados por (i-iii) (C) Imágenes representativas de la formación de esferoides mediadas por rBM de células SKBr-3. Las células se sembraron en placas inferiores redondas de fijación ultrabaja de 96 pocillos con concentraciones crecientes de rBM y se cultivaron durante 9 días. Barra de escala 100 m. (n.o 3). (D) Imágenes representativas de las células BxPC-3, MiaPaCa y Panc-1 sembradas para la formación de esferoides en placas inferiores redondas de 96 pocillos de fijación ultrabaja con concentraciones de rBM de 0,5-2,5 %. Los esferoides se cultivaron durante 4 días. Barra de escala a 250 m. (n.o 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Principio y evaluación del ensayo de viabilidad celular. (A) Representación esquemática del ensayo de viabilidad de celdas 3D. Pasos individuales indicados por (i-iv). (B) Señal luminiscente en función de la concentración ATP. Las diluciones de ATP se clasifiquén en una placa de 96 pocillos y reactivo de viabilidad celular añadido a cada pozo. La luminiscencia se registró después de 30 min a 405 nm. 1 n. (C) Viabilidad, medida como luminiscencia, de los esferoides MCF-7 tratados con quimioterapia y control. Las células MCF-7 fueron sembradas en placas de fondo redondo de fijación ultrabaja y fueron cultivadas durante 7 días. El tratamiento de quimioterapia (5 M de Cisplatino, 5 M de Doxorubicina y 30 nM 5-FU) se aplicó los días 2 y 4. Las barras representan valores medios con SD. 1 n. (D) Señal luminiscente en función del número de células MCF-7 sembradas. Las células MCF-7 se sembraron en placas de 96 pocillos en el número de celda indicado y se les permitió crecer durante 48 horas, después de lo cual se midió la viabilidad celular. Las barras de error representan SD. 1 n. (E) Como se describe en D para las celdas MDA-MB-231. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Efectos de los regímenes de tratamiento en la morfología esferoide y la viabilidad celular. (A) Imágenes representativas de los esferoides MDA-MB-231 los días 2, 4 y 7. Las células MDA-MB-231 fueron sembradas en placas de 96 pocillos de extremo inferior de unión ultrabajo. El tratamiento con dosis crecientes de quimioterapia se inició el día 2, momento en el que todos los esferoides eran de tamaño similar. Las filas muestran esferoides a dosis crecientes de quimioterapia, y las columnas muestran esferoides representativos del tamaño en los días 2, 4 y 7 en la dosis indicada. La dosis más baja fue de 18,75 nM Cisplatino, 18,75 nM Doxorubicina, 0,0625 nM 5-Fluorouracilo (5-FU) y esta dosis se duplicó para cada imagen mostrada, lo que dio como resultado una dosis máxima de 0,3 M de Cisplatino, Doxorubicina de 0,3 M y 2 nM 5-FU. Barra de escala a 100 m. (2 n). (B) Viabilidad de los esferoides MDA-MB-231, medidos como luminiscencia, después de 7 días de tratamiento quimioterapéutico. Las barras representan valores medios con SEM. 2 n. (C,D)Imágenes representativas de MDA-MB-231 (C ) y esferoides MCF-7 (D) en los días 2, 4, 7 y para los esferoides MCF-7 9. Células sembradas como en (A) y tratadas con quimioterapia (Chemo, 18.75 nM Cisplatino, 18.75 nM Doxorubicina, 0.0625 nM 5-FU) en los días 2 y 4 (C) o con 2 m tamoxifeno (Tam) en los días 2, 4 y 7 (D). Barra de escala a 100 m. (4 n y 3 n), respectivamente. (E,F) Viabilidad, medida como luminiscencia, los días 7 y 9 para (C) y (D), respectivamente. Para comprobar la diferencia estadísticamente significativa entre las condiciones de la prueba t de un estudiante no emparejado se realizó. denota p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Tinción de yoduro de propidium y análisis de manchas occidentales de esferoides. (A) Imágenes representativas de los esferoides MCF-7 manchados de PI después de 9 días de tratamiento. Las células MCF-7 fueron sembradas en placas de 96 pocillos de fijación ultrabajo cultivadas durante 9 días y tratadas con concentraciones crecientes de EIPA en los días 2, 4 y 7. El día 9, los esferoides fueron manchados con PI y las imágenes fueron adquiridas en un microscopio de epifluorescencia. Barra de escala a 200 m. (1 n.) (B) Manchas occidentales representativas de células MDA-MB-231 después de la destitución/derribo de transportadores de base ácida. NHE1 fue noqueado por CRISPR/Cas9 en las células MDA-MB-231 12 y las células fueron posteriormente transcemitidas transitoriamente con siRNA contra MCT4 o NBCn1, y crecieron como esferoides durante 9 días antes de ser lysed y sometidas a la mancha occidental usando un anticuerpo reconociendo total y cleaved (c)PARP. (C) Cuantificación de la relación entre el nivel de proteína cPARP y PARP, normalizada al control de carga (-actina). (1 n). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Fijación, incrustación e inmunohistoquímica de esferoides. (A) Representación esquemática del protocolo de incrustación de esferoides. Los pasos individuales se marcan como (i-vii). (B) Imagen del esferoide MDA-MB-231 incrustado. Barra de escala: 50m. (C ) Imagen representativa del esferoide MDA-MB-231 tratado con quimioterapia sometido al análisis IHC con anticuerpos contra p-53. Las líneas discontinuas muestran la circunferencia del esferoide. Barra de escala a 20 m. (D,E) Imágenes representativas de los esferoides Tratados con DMSO o quimioterapia (paneles superiores e inferiores, respectivamente) esferoides MDA-MB-231. Las células MDA-MB-231 se sembraron en placas de 96 pocillos ultrabajos, se cultivaron durante 7 días y se trataron con quimioterapia los días 2 y 4. En el día 7, los esferoides fueron incrustados seguidos de análisis por IHC con anticuerpos primarios contra Ki-67 (D) y p53 (E). Las cajas blancas representan imágenes de zoom. Barra de escala de 20 m en ambas ampliaciones, (n.o 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El uso de esferoides de células cancerosas 3D ha demostrado ser una herramienta valiosa y versátil no sólo para la detección de fármacos contra el cáncer, sino también para obtener información mecanicista sobre la regulación de la muerte de las células cancerosas y la viabilidad en condiciones que imitan a los del tumor Microambiente. Esto es particularmente crucial ya que la accesibilidad, la aceptación celular y los efectos intracelulares de los medicamentos quimioterápicos se ven profundamente afectados por las condiciones fisicoquímicas en el tumor, incluyendo el pH, la tensión de oxígeno, la tortuosidad y la interacciones células químicas9,17. Por ejemplo, la acidez del pH extracelular, que puede alcanzar valores tan bajos como 6-6.5 en muchos tumores sólidos25,26,27,28,29, causa quimioterapéuticos débilmente básicos compuestos, como la doxorubicina, la mitoxantrona y el zwitterion paclitaxel, que se cobrarán. Esto reduce su ingesta en las células tumorales y puede influir en la actividad de proteínas de resistencia multifármaco como la glicoproteína p30,31,32. También la proliferación celular, que es fundamental para el efecto de la mayoría de los compuestos quimioterápicos, generalmente se reduce en 3D en comparación con las condiciones 2D y por lo tanto es probablemente mejor imitado en esferoides tumorales que en el cultivo celular 2D8,33 ,34. Por último, el microambiente tumoral denso es el origen de numerosas señales de señalización físicas y solubles que dirigen las vías de señalización intracelular que regulan el crecimiento celular, la supervivencia y la muerte. Por lo tanto, al analizar la eficacia de los medicamentos, los sistemas de cultivo 3D son un paso crucial antes de embarcarse en modelos in vivo. Sin embargo, un inconveniente importante de la cultura 3D es el aumento de la complejidad del análisis en comparación con el de la cultura 2D. Hemos descrito aquí técnicas simples y relativamente baratas para la formación de esferoides utilizando una variedad de tipos de células cancerosas. Hemos mostrado ejemplos de cómo la formación de esferoides debe optimizarse para cada tipo de célula estudiada y hemos descrito cómo obtener datos cuantitativos sobre la viabilidad celular, la muerte celular y las vías de señalización asociadas, en tales esferoides. No hay diferencias evidentes de crecimiento o morfología entre los tres modelos descritos aquí. En nuestras manos, la variación en la morfología puede ser ligeramente mayor usando el método de gota colgante, sin embargo, una ventaja de este método es que rBM no es necesario. Nos hemos centrado aquí en los esferoides producidos a partir de un solo tipo de célula cancerosa. El modelo esferoide, sin embargo, también es susceptible de cocultivo, por ejemplo de células cancerosas con fibroblastos, monocitos/macrofagos, células endoteliales y/o adipocitos35,36,37. Otras aplicaciones avanzadas de este modelo incluyen la combinación con dispositivos fluidos impresos en 3D que permiten la dosificación a través de una membrana semipermeable, seguido de la cosecha para el perfil anivel a térmico38.
Mientras que, como se señaló anteriormente, el fenotipo de las células cultivadas en esferoides 3D generalmente imita el de los tumores in vivo mucho mejor que las células cultivadas en 2D, la medida en que tales esferoides son de hecho modelos relevantes de los tumores in vivo correspondientes depende de numerosos y debe evaluarse cuidadosamente. Los parámetros que afectarán el grado de que estos esferoides imitan la condición in vivo incluyen la composición celular del tumor y su composición relativa de ECM. Por ejemplo, el rBM que hemos empleado como ECM en los protocolos proporcionados aquí es una buena opción para imitar las primeras etapas de los cánceres epiteliales, alrededor del momento de romper la membrana del sótano, otras composiciones de ECM serán más relevantes para ciertos tumores tipos y etapas. Además, la capacidad de adhesión celular difiere ampliamente entre las líneas celulares cancerosas, dependiendo de su expresión de proteínas de adhesión de células celulares y de matriz celular como las cadherinas y las integrinas22.
Como se describe aquí, el crecimiento y la morfología de los esferoides pueden ser monitoreados fácil y no invasivamente cada 2-3 días usando un microscopio ligero con óptica de bajo aumento y un gran campo de visión. Sin embargo, debido a que el estrés citotóxico, como el tratamiento de quimioterapia, afecta la morfología esferoide de manera muy diferente y, de una manera, dependiendo del tipo de célula y el esquema de tratamiento, no basta con depender de la morfología y la circunferencia por sí solo según la evaluación para evaluar efecto tratamiento. Por ejemplo, los esferoides pueden ser más flexibles con el tratamiento y la muerte celular emergente, o toda la muerte puede ocurrir en el núcleo necrótico, mientras que la superficie no se ve afectada de forma detectable. En ambos casos, el resultado puede ser una impresión errónea de que el número de células vivas en el esferoide no se reduce por el tratamiento. Por lo tanto, las técnicas cuantitativas y enteras de esferoide son esenciales para evaluar el efecto del tratamiento. Para la evaluación cuantitativa de la muerte celular, el ensayo ácido fosfatasa, que como su nombre implica mide la actividad de la fosfatasa de ácido citosólico se ha empleado21. Sin embargo, en nuestras manos, mientras que este ensayo generalmente refleja muy bien el número de células sembradas, no captura adecuadamente la muerte celular inducida por el tratamiento rápido (datos no mostrados), probablemente porque la fosfatasa ácida permanece activa durante algún tiempo después de la muerte celular. Además, este ensayo requiere la eliminación completa del medio, lo que aumenta el error, especialmente con esferoides frágiles y tratados con quimioterapia. El ensayo de viabilidad celular descrito aquí, que se basa en el contenido de ATP celular, fue elegido en base a su protocolo simple y eficiente en el tiempo y alta reproducibilidad. Además, este ensayo no requiere la eliminación completa del medio de cultivo, que es una ventaja cuando se trabaja con esferoides. Como se muestra en los resultados representativos, este ensayo captura bien tanto el número celular como los efectos esperados del tratamiento de quimioterapia. Sin embargo, un escollo de esta técnica es, obviamente, que los cambios metabólicos que reducen el contenido de ATP intracelular pueden registrarse erróneamente como un número de células más bajo. Por lo tanto, es aconsejable la evaluación paralela del volumen y la morfología de los esferoides, o tinción de PI, para validar los resultados.
La lisis esferoide seguida de la hincha occidental puede proporcionar una visión semicuantitativa sobre el estado de los procesos de señalización, la muerte celular, el crecimiento y la viabilidad. El uso de la hinchazón occidental es complicado cuando se utiliza rBM para preparar los esferoides, ya que esto comprenderá una fracción sustancial del contenido de proteína de lisado, y lo que es más importante, su contribución fraccionada aumentará con la disminución del contenido celular durante la muerte celular quimioterapéutica. En principio, es posible eliminar el rBM por centrifugación; sin embargo, este es un paso crítico, ya que es difícil eliminar por completo todo el rBM, y esto impedirá la comparación cuantitativa entre condiciones. Para tales esferoides, y en general para la evaluación resuelta espacialmente de las vías de muerte y los parámetros de señalización relevantes, la incrustación y el IHC son herramientas sólidas. Se pueden considerar otros enfoques: imágenes confocales vivas de esferoides (relativamente pequeños) intactos39. Otra propiedad interesante de los esferoides es que dada su forma de "bola" bastante regular, se prestan bien a la iteración entre el modelado matemático y los experimentos de laboratorio húmedo, para aumentar la comprensión de la importancia de lo antes mencionado gradientes de oxígeno, pH y nutrientes dentro de los esferoides, y, por extrapolación, tumores40,41. Así, aunque están surgiendo importantes modelos tumorales 3D de mucha mayor complejidad, incluyendo una amplia gama de cultivos organotípicos y organosídicos organotípicos basados en andamios biológicos complejos e inertes, y, no menos importante, xenoinjertos derivados del paciente42, los esferoides siguen siendo una herramienta importante debido a su relevancia biológica superior en comparación con el cultivo 2D, combinado con relativa facilidad de manejo.
En resumen, presentamos aquí una serie de métodos simples para el análisis de los cambios inducidos por el tratamiento contra el cáncer en la viabilidad de las células cancerosas y la muerte en el cultivo 3D. La composición de los esferoides se puede modificar dependiendo de las propiedades y la biología de las células empleadas, y los análisis cuantitativos y cualitativos presentados son útiles tanto para evaluar las relaciones dosis-respuesta como para obtener información sobre la señalistas y vías de muerte involucradas.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Katrine Franklin Mark y Annette Bartels por su excelente asistencia técnica y a Asbjorn N-hr-Nielsen por realizar los experimentos en la Figura 1D. Este trabajo fue financiado por la Fundación Einar Willumsen, la Fundación Novo Nordisk y la Fundación Juchum (todas a SFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
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