Summary

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Published: June 16, 2019
doi:

Summary

Burada, 2D kültürden çok daha iyi in vivo tümörlerin fiziko-kimyasal degradelerini taklit eden 3D kanser hücresi kürelerinin içinde canlanıyor ve ölümü değerlendirmek için birkaç basit yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, küroid modeli, kanser ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için gelişmiş çeviri ile in vivo koşullara izin verir.

Abstract

Kanser hücrelerinin üç boyutlu kürüler hem kanser ilaç ekranları için önemli araçlar ve kanser hücresi biyoloji içine mekanik fikir kazanmak için. Bu preparatın gücü, hızlı, ucuz ve nispeten yüksek verim taramasına izin verecek kadar çok yönlü olmakla beraber, tümörün in vivo koşullarının birçok yönünü taklit etme yeteneğiyle yatıyor. Küroid kültürü koşulları, bir tümördeki fiziko-kimyasal degradeleri, artan ekstrellüler asitliği, artan lakdamak, ve glikoz ve oksijen kullanılabilirliğini azaltarak, küre çevresinden çekirdeğine kadar tekrar edebilir. Ayrıca, in vivo tümörlerin mekanik özellikleri ve hücre hücre etkileşimleri kısmen bu model tarafından taklit edilmiştir. Özel özellikleri ve sonuç olarak en iyi büyüme koşulları, 3D kürler, farklı kanser hücrelerinin türleri arasında farklıdır. Ayrıca, 3D Kürklerde hücre cancılığı ve ölümün değerlendirilmesi, 2D kültürler için istihdam edenler kısmen farklılık yöntemleri gerektirir. Burada kanser hücrelerinin 3D kürleri hazırlamak için çeşitli protokoller açıklamak ve antikanser ilaçların etkinliğini değerlendirmek bağlamında hücre canlılığı ve ölüm değerlendirmek için bu tür kültürler kullanmak için.

Introduction

Kanser biyolojisinde çok hücreli küre modellerinin kullanımı birkaç yıl eski1,2, ama son yıllarda önemli momentum kazanmıştır. Büyük ölçüde, bu kanser hücrelerinin phenoype onların mikroçevre ve spesifik büyüme koşullarına bağlı olduğu ne kadar güçlü farkındalığını arttırmaktadır. Solid tümörlerde mikroçevre, karşılık gelen normal dokularda temelde farklıdır. Bu pH gibi fiziko-kimyasal koşulları içerir, oksijen gerilimi, yanı sıra interstisyel basınç, besin gibi çözünür faktörlerin konsantrasyon degradeler, atık ürünler, ve salgılanmış sinyalizasyon bileşikleri (büyüme faktörleri, sitokinler). Ayrıca, hücre içi matris (ECM), hücreli hücre etkileşimleri ve hücresel sinyalizasyon organizasyonu ve tümör3,4, belirli üç boyutlu (3D) mimarisi diğer yönlerini içerir 5,6. Kanser hücrelerinin mevcut olduğu spesifik mikroçevresel koşullar, gen ifade profilini ve fonksiyonel özelliklerini derinden etkiler ve 2D ‘de yetiştirilen hücrelerle karşılaştırıldığında, 3D kürelerinin fenotipini çok daha yakından taklit ettiği açıktır. In vivo tümörleri7,8,9,10,11. 2D modelleri, hipotoksi, Asidik pH ve yüksek laktat konsantrasyonları tümör mikroortamın bilinen yönlerini taklit etmek bile, hala tümör içinde doğan fizico-Kimyasal parametrelerin degradeleri yakalamak için başarısız, yanı sıra onların 3D tümör Mimari. Öte yandan, hayvan modelleri, pahalı, yavaş ve etik problemli, ve genellikle, aynı zamanda insan tümörü koşullarını tekrar etme yeteneğinde eksiklikleri vardır. Sonuç olarak, 3D Kürtler en katı kanserlerin çoğu özellikleri geniş bir yelpazede çalışmalarda bir ara karmaşıklık modeli olarak uygulanmıştır9,11,12,13, 14,15,16,17.

3B kürlerin yaygın olarak istihdam edilmesi, antikanser terapisi etkinliğini9,18,19,20‘ ye göre taramasında yer almaktadır. Tedavi tepkiler özellikle tümör mikroortama duyarlıdır, hem tortuların etkisini yansıtan, kısıtlı difüzyon, yüksek interstisyel basınç, ve ilaç teslim asidik çevresel pH, ve hipoksi ve diğer etkisi hücre ölüm tepkisi üzerinde mikroçevre yönleri9,17. 3D küre içerisindeki çevre, tüm bu özellikleri7,8,9,10,11olarak geliştirdiğinden, 3D hücre kültürlerini istihdam edebilir sonuçların in vivo koşullarına çevirisini önemli ölçüde iyileştirebilir, ancak net büyümenin verimli ve uygun maliyetli yüksek verim taramasına izin verir. Ancak, kanser hücrelerinin ilaç tepkisi üzerinde çalışmaların büyük çoğunluğu hala 2D koşullar altında gerçekleştirilir. Bu büyük olasılıkla, bazı deneyleri nispeten kolayca 3D hücre kültürler için uygulanabilir iken, birçok, gibi canlılığı gibi, Batı blotting, ve immünofluorescence analizi, çok daha uygun 2D 3D daha yapılır.

Mevcut çalışmanın amacı, Anti-kanser ilaçları ile tedavinin etkisinin analiz edilmesi için, 3 boyutlu bir tümördeki ayarı taklit eden kanser hücresi kalabilirlik ve hayatta kalma konusunda kolayca sağlamlık ve hassas protokoller sağlamaktır. Özellikle, biz sağlamak ve küresel oluşumu için üç farklı yöntemler karşılaştırmak, büyüme, canlılığı ve ilaç tepkisi nitel ve niceliksel analizler için yöntemler izledi.

Protocol

1. kürler üretimi Hücre süspansiyonları için küroid oluşumu hazırlanmasıNot: farklı hücre hatları çok farklı yapışma özelliklerine sahiptir ve her durumda en uygun küroid oluşumu Protokolü kurulmalıdır. Biz MCF-7 ve BxPC-3 hücrelerin spontan küre oluşumu için uygun olduğunu bulduk, MDA-MB-231, SKBr-3, panc-1 ve MiaPaCa başarıyla küroidler oluşturmak için reconstituted Bodrum membran ilavesi gerektirir. Asılı bırakma protokolü için yalnızca MDA-MB-231 v…

Representative Results

Şekil 1A ve Şekil 1B’de şematik olarak gösterilen küroid oluşumu protokolüne dayalı olarak küre büyüme, Anti-kanser ilaç tedavilerinin 3D tümördeki etkilerini analiz etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır. ayar taklit. Hangi kürler oluşturulur kolaylığı hücre hattına özeldir ve bazı hücre hatları tutarlı kürler22oluşturmak Için RBM ile takviyesi gerekt…

Discussion

3D kanser hücresi kürüler kullanımı sadece antikanser ilaç taraması için değerli ve çok yönlü bir araç kanıtlanmıştır, aynı zamanda tümör bu taklit koşullar altında kanser hücresi ölüm ve canlılığı düzenlenmesi içine mekanik fikir kazanmak için Mikro. Bu özellikle erişilebilirlik, hücresel alımı ve kemoterapötik ilaçların hücre içi etkileri gibi tümör, pH, oksijen gerilimi, tortuluk ve fiziksel ve fiziko-kimyasal koşullar tarafından derinden etkilenir çok önemlidir kimyasal…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Katrine Franklin Mark ve Annette Bartels için mükemmel teknik yardım ve Asbjørn Nøhr-Nielsen şekil 1D deneyler gerçekleştirmek için minnettarız. Bu çalışma Einar Willumsen Vakfı, Novo Nordisk Vakfı ve Fondation Juchum (tüm SFP için) tarafından finanse edildi.

Materials

2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) Invitrogen # C10595  For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU) Sigma-Aldrich #F6627 Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) Life Technologies #E3111 Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARP Cell signaling #9542 Used in western blotting
Antibody against Ki-67 Cell signaling #9449 Used for IHC
Antibody against p53 Cell Signaling  #2524  Used for IHC
Antibody against β-actin Sigma  A5441 Used in western blotting
Bactoagar BD Bioscience #214010 Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladder Invitrogen #10747-012 Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kit Bio-Rad Laboratories #500-0113, #500-0114, #500-0115   Used for protein determination from lysates
Bürker chamber Marienfeld 610311 For cell counting 
BX63 epifluoresence microscope Olympus Used for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega #G9681 Used for the cell viability assay
Cisplatin Sigma-Aldrich #P4394  Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, Sterile Corning #4520 Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile Corning #7007 Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast Gels Bio-Rad 5671025 Used for SDS-PAGE
Doxorubicin Abcam #120629 Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate reader BMG Labtech Used for recording luminescence 
Formaldehyde  VWR Chemicals  #9713.1000  Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Gibco #A1413202 Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBS Sigma #F9665 Serum for growth media
ImageJ NIH Scientific Image analysis
Medim Uni-safe casette Medim Histotechnologie 10-0114 Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics GmBH  # 11836153001 Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscope Leica Used for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer  Invitrogen #NP0007 Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrate Thermo scientific #32106 Used for western blotting
Ponceau S Sigma-Aldrich #P7170-1L Used for protein band staining
Prism 6.0 Graphpad Scientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water) Invitrogen  P3566 Light sensitive 
Sterile reservoirs, multichannel SPL lifesciences 21002 Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide  Menzel-Gläser #J3800AMNZ Microscope glass slide used for embedding
Tamoxifen Sigma-Aldrich #T5648 Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes Bio-Rad #170-4159 Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer  Bio-Rad  #161 0732 Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solution Sigma #T4174  Cell dissociation enzyme

References

  1. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  2. Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
  3. Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
  4. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
  5. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  6. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  9. Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
  10. Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
  11. Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
  12. Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
  13. Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
  14. Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
  15. Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
  16. Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
  17. Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
  18. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  19. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  20. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
  21. Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
  22. Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
  23. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  24. Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
  25. Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
  26. Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
  27. Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
  28. Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
  29. Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
  30. Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
  31. Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J., Teicher, B. A. . Cancer Drug Resistance. , 21-42 (2006).
  32. Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
  33. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  34. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  35. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
  36. Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
  37. Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour – endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
  38. LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
  39. Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
  40. Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
  41. Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
  42. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).

Play Video

Cite This Article
Rolver, M. G., Elingaard-Larsen, L. O., Pedersen, S. F. Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (148), e59714, doi:10.3791/59714 (2019).

View Video