Summary
Здесь мы представляем несколько простых методов оценки жизнеспособности и смерти в 3D раковых клеточных сфероидах, которые имитируют физико-химические градиенты опухолей in vivo гораздо лучше, чем 2D-культура. Таким образом, сфероидная модель позволяет оценить эффективность препарата от рака с улучшенным переводом в условия in vivo.
Abstract
Трехмерные сфероиды раковых клеток являются важными инструментами как для рака наркотиков экраны и для получения механистического понимания биологии раковых клеток. Сила этого препарата заключается в его способности имитировать многие аспекты in vivo условия опухолей, будучи быстрым, дешевым и универсальным достаточно, чтобы позволить относительно высокой пропускной способности скрининга. Условия сфероидной культуры могут резюмировать физико-химические градиенты в опухоли, включая повышение внеклеточной кислотности, увеличение лактата и снижение доступности глюкозы и кислорода, от сфероидной периферии до ее ядра. Кроме того, механические свойства и клеточные взаимодействия опухолей in vivo частично передразнятся этой моделью. Специфические свойства и, следовательно, оптимальные условия роста 3D-сфероидов сильно различаются между различными типами раковых клеток. Кроме того, оценка жизнеспособности клеток и смерти в 3D сфероидах требует методов, которые частично отличаются от тех, которые используются для 2D культур. Здесь мы описываем несколько протоколов для подготовки 3D сфероидов раковых клеток, а также для использования таких культур для оценки жизнеспособности клеток и смерти в контексте оценки эффективности противораковых препаратов.
Introduction
Использование многоклеточных моделей сфероидов в биологии рака несколько десятилетий старых1,2, но получил значительный импульс в последние годы. В значительной степени это отражает повышение осведомленности о том, насколько сильно фенотип раковых клеток зависит от их микросреды и специфических условий роста. Микросреда при твердых опухолях принципиально отличается от той, что в соответствующих нормальных тканях. Это включает в себя физико-химические условия, такие как рН, кислородное напряжение, а также интерстициальное давление, градиенты концентрации растворимых факторов, таких как питательные вещества, отходы и секретированные сигнальные соединения (факторы роста, цитокины). Кроме того, она включает в себя организацию внеклеточной матрицы (ECM), клеточных взаимодействий и межклеточной сигнализации, а также другие аспекты конкретной трехмерной (3D) архитектуры опухоли3,4, 5,6. Специфические микроэкологические условия, в которых существуют раковые клетки, глубоко влияют на их профиль экспрессии генов и функциональные свойства, и ясно, что, по сравнению с клетками, выращенными в 2D, фенотип 3D сфероидов гораздо более точно имитирует что из in vivo опухолей7,8,9,10,11. 2D модели, даже если они используют гипоксию, кислый рН и высокие концентрации лактата, чтобы имитировать известные аспекты микроокружения опухоли, по-прежнему не в состоянии захватить градиенты физико-химических параметров, возникающих в опухолях, а также их 3D опухоли Архитектура. С другой стороны, модели животных являются дорогостоящими, медленными и этически проблематичными, и, как правило, также имеют недостатки в их способности переизгладить условия опухоли человека. Следовательно, 3D сфероиды были применены в качестве промежуточной модели сложности висследованиях широкого спектра свойств большинства твердых раковых заболеваний 9,11,12,13, 14,15,16,17.
Широко используется 3D сфероиды в скрининговых анализов противораковой терапии эффективность9,18,19,20. Реакции на лечение особенно чувствительны к микроокружению опухоли, отражая как влияние мучительности, ограниченное диффузии, высокое интерстициальное давление, и кислый рН окружающей среды на доставку лекарств, так и влияние гипоксии и других аспекты микроокружения на реакции смерти клетки9,17. Потому что окружающая среда в 3D сфероиды по своей сути развивает все эти свойства7,8,9,10,11, используя 3D-клеточные культуры могут существенно улучшить перевод результатов в условия in vivo, но позволит ьсядую эффективную и доступную высокую пропускную работу скрининга чистого роста. Тем не менее, подавляющее большинство исследований по лекарственной реакции раковых клеток по-прежнему проводятся в 2D условиях. Это, вероятно, отражает, что, в то время как некоторые анализы могут относительно легко быть реализованы для 3D-клеточных культур, многие, такие как анализы жизнеспособности, западные промотирование, и иммунофлуоресценции анализа, гораздо удобнее сделать в 2D, чем в 3D.
Цель юрисовской работы заключается в предоставлении легко поддающихся капсулам анализов и точных протоколов анализа влияния лечения противораковыми препаратами на жизнеспособность раковых клеток и выживание в 3D-опухоли, имитирующей обстановку. В частности, мы предоставляем и сравниваем три различных метода формирования сфероидов, за которыми следуют методы качественного и количественного анализа роста, жизнеспособности и реакции на лекарства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Поколение сфероидов
- Подготовка клеточных суспензий для образования сфероидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные клеточные линии имеют очень разные свойства адгезии и наиболее подходящий протокол формирования сфероидов должен быть установлен в каждом конкретном случае. Мы обнаружили, что клетки MCF-7 и BxPC-3 пригодны для спонтанного образования сфероидов, в то время как MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 и MiaPaCa требуют добавления восстановленной мембраны для успешного формирования сфероидов. Только MDA-MB-231 и BxPC-3 клетки были использованы для висячего протокола падения, однако другие линии клетки, безусловно, применимы.- Выращивайте клетки в качестве монослойной до 70-80% спущенности.
- Вымойте клетки с фосфатным буферным сольнием (1x PBS, 5 мл для 25 см2 или 10 мл для колбы 75 см2), добавьте фермент диссоциации клеток (0,5 мл для 25 см2 или 1 мл для колбы 75 см2) и инкубировать клетки на 2-5 мин при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 и 95% влажности.
- Проверьте отслоение клеток под микроскопом и нейтрализуйте фермент диссоциации клеток, добавив среду роста (6-10% сыворотки в зависимости от клеточной линии) в общий объем 5 мл в 25 см2 или 10 мл для колбы 75 см2.
- Используйте камеру Бюркера для подсчета ячеек и подсчета 8 квадратов в камере на подготовку клеток для получения высокой воспроизводимости размера сфероидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже представлены три протокола, каждый из которых описывает другой метод формирования сфероидов. Протокол 1.2 и 1.3 может быть использован для всех последующих представленных аналитических протоколов, в то время как протокол 1.4 лучше всего подходит для встраивания и подготовки к лизатированию. В зависимости от клеточной линии, образование сфероидов занимает 2-4 дня, независимо от используемого метода.
- Спонтанное образование сфероидов
- Выполните шаги 1.1.1.1.1.4.
- Разбавить клеточной подвеской в трубке 15 мл, чтобы получить 0,5-2 х 104 ячейки/мл (оптимальная плотность клеток должна быть определена для каждой клеточной линии) (Рисунок 1А (ii)).
- Заполните внешнее кольцо скважин 1x PBS или средой роста, чтобы уменьшить испарение из оставшихся скважин. Перенос яточной подвески в стерильный резервуар и, используя многоканальный пипетки, распределять 200 л/хорошо в ультра-низкие крепления 96-хорошо круглые нижние пластины(Рисунок 1A (iii)).
- Инкубировать тарелку в инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% CO2,95% влажности.
- Каждые 2-3 дня приобретают легкие микроскопические изображения сфероидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения в этой работе принимаются при увеличении в 11,5 x, что подходит для большинства сфероидов, подготовленных с помощью этих протоколов. - Каждые 2-3 дня (после получения изображений) заменяйте 100 кЛ средней (удалите 100 л отработанного среднего и замените 100 зл и свежей среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать удаления сфероидов при замене среды, желательно, чтобы наклонить пластину немного в то время как медленно удаления среды и проверить аспирированные среды в советы для видимых сфероидов, прежде чем отбросить его.
- Восстановлено подвальной мембранно-опосредованного образования сфероидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лактоза дегидрогеназы подъемного вируса (LDEV) свободного фактора роста восстановлены подвале мембраны (rBM) был использован. rBM является чувствительным к температуре и всегда должен быть на льду, так как он будет сгусток, если он достигает 15 градусов по Цельсию. Оттепель rBM на льду либо на ночь при температуре 4 градусов или 2-4 ч при комнатной температуре (RT) перед покрытием.- Оттепель rBM на льду (см. Таблицаматериалов).
- Держите пластины и резервуары (если индивидуально обернуты) на льду перед использованием.
- Выполните шаги 1.1.1.1.1.4.
- Заполните внешнее кольцо скважин 1x PBS или средой роста, чтобы уменьшить испарение из оставшихся скважин. Разбавить клеточной подвеской в трубке 15 мл, чтобы получить 0,5-2 х 104 ячейки/мл (оптимальная плотность клеток должна быть определена для каждой клеточной линии) (Рисунок 1А (ii)).
- Поместите трубку 15 мл, содержащую разбавленную клеточную подвеску, на льду (например, в стеклянный стакан)(рисунок 1А (iia)).
- Перенесите охлажденные пластины и резервуары на капот. Промыть пластиковые контейнеры, заполнить их льдом и передать их в капот, чтобы пластины и резервуары, которые будут размещены на льду в течение всей процедуры.
- Отрежь rBM осторожно, чтобы обеспечить однородный гель.
- Добавьте 1-2% rBM (оптимальная концентрация должна быть определена для каждой линии клеток) к охлажденным клеточным суспензиям(рисунок 1А (iib).
- Перевернуть трубку 15 мл, чтобы обеспечить правильное смешивание rBM и клеточной подвески перед дозированием подвески в пластину.
- Перенесите суспензию rBM-содержащей клетки в стерильный резервуар и разделите 200 л/хорошо в охлажденные ультра-низкие пластины 96-колодства с помощью многоканальной пипетки(рисунок 1А (iii)).
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с несколькими суспензиями клеток (например, более одной клеточной линии), необходимо раздавать каждую суспензию клеток сразу после добавления rBM, чтобы предотвратить преждевременное gelling. - Центрифуга пластины в течение 15 минут при 750 х г с использованием "мягкой достойной" / не торможение (если это возможно, центрифуга при 4 КК, чтобы сохранить жидкость rBM дольше, но не требование для успешного образования сфероидов), чтобы убедиться, что клетки сгруппированы вместе, когда rBM затвердевает, облегчая образование одного сфероида.
- Инкубировать тарелку в инкубаторе (37 градусовпо Цельсию, 5% CO 2, 95% влажности).
- Каждые 2-3 дня приобретают легкие микроскопические изображения для оценки роста сфероидов.
- Каждые 2-3 дня заменяйте 100 л среднего (удалите 100 л и замените 100 л свежей среды).
- Висячие капли сфероидов.
- Выполните шаг 1.1.1.1.1.4.
- Разбавить клетки для получения подходящего разбавления. Практическое разбавление составляет 50 000 клеток/мл.
- Снимите крышку 10 см2 ячейки культуры блюдо и поместите его так, что лица вверх. Добавьте 6 мл 1x PBS к блюду(рисунок 1B (i)).
- Налейте суспензию клетки в стерильный резервуар и аккуратно поместите до 30 капель 40 qL клеточной подвески на крышку тарелки клеточной культуры с помощью многоканального пипетки(рисунок 1B (ii)), в результате чего концентрация 2000 клеток / падение. Избегайте размещения капель слишком близко к краю крышки, как эти капли, скорее всего, потеряет поверхностное натяжение при инвертации крышки в следующем шаге.
- Перевернуть крышку в быстром, но контролируемом движении и поместите его на вершине 1x PBS-содержащих клеточной культуры блюдо(Рисунок 1B (iii)).
- Поместите блюдо в инкубатор при температуре 37 градусов с 5% CO2 и 95% влажности, не нарушая капли и оставить их расти в течение 4-6 дней.
- Если использовать для белковых лисатов или встраивания, бассейн сфероидов, снимая крышку и наклонить его, для того, чтобы запивать капли с 1 мл нагретой среде. Перенесите полученную среду, содержащую сфероиды, в трубку 1,5 мл и дайте им осесть на дно трубки. Продолжить, как описано в 4,4 и 6,2,2 для белка lysates и встраивания, соответственно.
2. Лекарственное лечение сфероидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Долгосрочное лечение наркотиков может быть применено к сфероидам для того, чтобы проверить на воздействие препарата, представляющих интерес. Перед началом медикаментозного лечения рекомендуется провести доза ответного эксперимента препарата (ы), чтобы найти подходящую дозу для экспериментального лечения. Дозы должны быть основаны на определенных IC50/Ki препарата и варьируются от около 0,2x-10x этого значения.
- Установите 6-12 сфероидов в желаемом состоянии, как описано в 1,2 или 1,3,и поместите в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO 2, 95% влажности) в течение 2 дней.
- На второй день, принять легкие микроскопические изображения сфероидов.
- Подготовьте первые дозы лечения (после получения изображений).
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация первой обработки должна быть в два раза выше желаемой конечной концентрации, так как раствор будет разбавлен 1:2 при добавлении к хорошо содержащей 100 мл среды. Предлагаемые интервалы медикаментозного лечения (будет зависеть от полураспада препарата): День 2, 4 и 7. - Используя многоканальный пипетки, аккуратно удалите 100 л среднего и замените его 100 злителем препарата, содержащего средний.
- Поместите 96-хорошо пластины обратно в инкубатор на 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 и 95% влажности и повторить 2,3 и 2,4 в выбранные дни лечения, но теперь без удвоения дозы для получения правильной окончательной дозы.
- В заключительный день протокола/графика лечения можно провести один или несколько следующих анализов.
3. Переживание жизнеспособности клеток для сфероидов
- Установите 4-6 сфероидов в желаемом состоянии, как описано в 1,2 или 1,3, и поместите в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 и 95% влажности.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае анализ жизнеспособности клеток проводился на 7 или 9-й день, после мониторинга роста сфероидов каждые 2-3 дня с помощью световой микроскопии, как описано выше (точка 1.2.5 и 1.3.13). - Оттепель жизнеспособности ассси реагент (см. Таблица материалов) и пусть он уравновесить rt до использования.
- Смешайте осторожно, инвертируя для получения однородного решения.
- Перед выполнением асссе, удалить 50% культуры среды из сфероидов (100 л).
- Добавить реагент жизнеспособности клеток к каждой скважине в соотношении 1:3 к количеству среды, присутствуютй в колодце(Рисунок 2А (i)) Для 96-колодца пластины, добавьте 50 л реагента до 100 л среднего.
- Смешайте содержимое энергично в течение 5 мин, чтобы вызвать лиза клетки(Рисунок 2A (ii)).
- Инкубировать в течение 25 минут на RT, чтобы стабилизировать люминесцентный сигнал(Рисунок 2А (iii)).
- Запись люминесцентного сигнала(рисунок 2А (iv)).
4. Подготовка белковых лисатов для западного блоттинга из 3D сфероидных культур
ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе сфероидов, желательно использовать пипетку P200 и сократить конец кончика, чтобы больше открытия и, следовательно, легче захвата сфероидов, не нарушая их структуры.
- Для каждого состояния, бассейн минимум 12, в идеале 18-24 сфероидов (в зависимости от размера сфероидов) в 1,5 мл трубки (избежать 2 мл труб, так как следующие шаги станут более трудными из-за их менее заостренный дно).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество среды превышает 1,5 мл, прежде чем собрать все сфероиды, позвольте собранным сфероидам осесть на дне (происходит очень быстро, центрифугация не нужна) и отбросить половину объема трубки, прежде чем продолжить сбор оставшиеся сфероиды. - Поместите трубки на лед и дайте сфероидам осесть на дне трубки 1,5 мл.
- Перейдите из лаборатории стерильных клеток в обычную лабораторию.
- Вымойте сфероиды дважды в 1 мл ледяной 1x PBS. Пусть сфероиды оседают перед удалением 1x PBS между каждым шагом стирки.
- Аспирируй как можно больше 1x PBS, как это возможно, не нарушая или удаления сфероидов.
- Добавьте 5 qL нагретого буфера лиза (LB) с ингибиторами фосфатазы и протеазы, на сфероид (например, 10 сфероидов и 50 ЛЛ ЛБ).
- Повторите интервалы вихря с последующим спином вниз, пока сфероиды не растворяются. Выполните цикл вихря в течение 30 с с последующим центрифугированием (достаточно быстрого вращения с помощью центрифуги столешницы) по 10 с для приблизительно 5-10 мин в зависимости от размера и компактности сфероидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Держите лизаты при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока не продолжите с соникированием, гомогенизацию и определение белка, как в стандартном протоколе 2D белка лизата, а затем западные blotting с использованием стандартных протоколов.
5. Пропидий Иодид (PI) Окрашивание сфероидов
- Установите 3-6 сфероидов при желаемом состоянии, как описано в 1,2 или 1,3, и поместите в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 и 95% влажности.
- В лаборатории стерильной культуры клеток, тепло 1x PBS до 37 градусов по Цельсию.
- Сделать PI решение 4 мкм путем разбавления бульона раствора в 1x PBS: Разбавить 1 мг / мл aqueous запас PI 1:350 в 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта концентрация будет еще вдвое снижена после добавления раствора к скважинам, дающим окончательную концентрацию в размере 2 мкм. 100 л этого раствора необходимо для каждого скважины, содержащей сфероид.
ПРЕДЕКТО: Propidium iodide (PI) должны быть обработаны в дым капюшон и носить перчатки. PI светочувствительный. Защитите от света при обращении. - Удалите 100 л среды из каждой скважины в 96-хорошо пластины, не удаляя сфероидов.
- Вымойте оставшуюся среду, добавив 100 л от нагреваемых 1x PBS ко всем скважинам с последующим удалением 100 л жидкости в скважинах. Повторите этот шаг стирки 3 раза.
- Добавьте 100 qL раствора PI к каждому хорошему, накройте плиту в алюминиевой фольге и поместите ее в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 и 95% влажности в течение 10-15 мин.
- Повторите 3 стирки, описанные в 4.5, чтобы вымыть решение PI, чтобы уменьшить фоновый сигнал при визуализации.
- Используйте микроскоп эпифлюоресценции для изображения сфероидов. Для оценки жизнеспособности клеток в сфероидном ядре возьмите z-стеки, чтобы получить изображения с различной глубиной сфероида.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер шага вокруг 18-35 мкм между каждым ломтиком в зависимости от размера сфероида является целесообразным, давая примерно 11-18 стеков на сфероида. Стеки могут быть обработаны в ImageJ с помощью функции z-проекции, которая может объединить все z-стеки в одну окончательную картину, давая обзор окрашивания всей сфероид (для дальнейших руководящих принципов по использованию ImageJ для этой цели, см. (https://imagej.net/Z-functions).
6. Встраивание 3D сфероидов
-
Подготовьте гель агарозы, в который встроены сфероиды (только необходимо впервые выполнить протокол).
- Смешайте 1 г бактоагара в 50 мл ddH2O.
- Медленно нагревайте в микроволновой печи до тех пор, пока бактоагар не растворится и не образуется однородный гель. Не допускайте кипения геля.
- Держите бактоагар теплым на водяной бане при 60 градусах Цельсия.
- Держите на 4 градусах между экспериментами.
-
Встраивание сфероидов.
- На 1-й день, для каждого условия, бассейн как минимум 12 сфероидов в 1,5 мл трубки.
- Вымойте один раз с 1 мл ледяной 1x PBS.
- Чтобы исправить сфероиды, добавьте 1 мл 4% параформальдегида.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка параформальдегида должна осуществляться в дымовом капюшоне. - Пусть они инкубируют в течение 24 ч на RT.
- На второй день, тепло геля агарозы тщательно, поместив его в заполненный водой стакан в микроволновой печи. Убедитесь, что гель не кипит! Держите в тепле на скамейке нагревательной пластины, при 60 градусах По Цельсия до использования.
- Вымойте сфероиды дважды с 1 мл ледяной 1x PBS.
- Аспирируй большинство из 1x PBS (оставляя около 100 Л л на данный момент является практичным для обработки сфероидов).
- Подготовьте пипетку размером 20 л, разрезав наконечник пипетки на наклоне, чтобы получить указательный кончик с большим отверстием (см. иллюстрацию).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая часть должна быть сделана быстро, чтобы обеспечить оптимальную передачу сфероидов и избежать затвердевания капли геля. Если нет нагревательного блока, рекомендуется сначала поймать сфероиды, а затем сделать агарозу падение (т.е. переключение порядка точек 6.2.9 и 6.2.10). - Сделайте агарозный гель капли на микроскоп слайд. Поместите горку на теплый нагревательный блок, чтобы предотвратить затвердевание агарозы.
- Используя модифицированный наконечник пипетки (см. 6.2.8), поймать как можно больше сфероидов, как это возможно в объеме 15-20 Л.
- Тщательно введите 15-20 л сфероидов, содержащих 1x PBS в центр капли геля агарозы, не касаясь слайда микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это немного трудный момент. Сфероиды будут потеряны, если кончик пипетки касается слайда микроскопа при впрыскивание сфероидов в падение геля. Целесообразно практиковать весь процесс делать падение агарозы и впрыскивать сфероиды путем впрыскивать покрашенную жидкость в падение. Это позволит визуализировать потенциальное проникновение через падение, так как цветная жидкость будет вытекать на слайд. - Пусть агарозный гель капля затвердеть путем инкубации в течение 5-10 мин на RT или при 4 градусах Цельсия. После того, как гель капли затвердевает несколько (но все еще довольно мягкий), тщательно нажмите гель капли из микроскопа слайд в пластиковой ткани кассеты с кальпелью.
- Обложка пластиковых тканей кассеты в 70% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент сфероиды могут быть использованы непосредственно или храниться в течение нескольких месяцев. - Встраивайте агарозе в парфиин, разделите на 2-3 мкм толщиной слоя слайдов и пятно с гематоксилин и эозин или при условии иммуногистологического окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сфероид роста анализы на основе сфероидного протокола формирования схематично иллюстрируется на рисунке 1А и Рисунок 1В, были использованы в качестве отправной точки для анализа последствий лечения противораковых препаратов в 3D опухоли имитируя настройки. Легкость, с которой образуются сфероиды, является клеточной линией, а некоторые клеточные линии требуют добавок с rBM для того, чтобы сформировать когероиды22. Концентрация rBM добавил может глубоко повлиять на морфологию сфероидов. Как показано на рисунке 1C и рисунке 1D,изменяя концентрацию rBM между 0 и 4% изменяет компактность и морфологию сфероидов в зависимом типе клетки. Рисунок 1 C демонстрирует, как добавление до 2,5% rBM позволяет образование сфероидов в SKBr-3 раковых клеток молочной железы, без дальнейшего эффекта при концентрациях выше 2,5% rBM. В отличие от этого, клетки bxPC3 поджелудочной железы протоковой аденокарциномы (PDAC), которые демонстрируют эпителиальную морфологию, спонтанно образуют небольшие компактные сфероиды(рисунок 1D,верхняя, левая панель). В этом типе клеток увеличение концентрации рММ до 1,5% и выше вызывает явное морфологическое изменение от сфероидных к более запутанным структурам с выступами и инвагенациями, напоминающими образование проточной трубной структуры. И наоборот, добавление rBM к двум другим линиям клеток PDAC, MiaPaCa и Panc-1, которые имеют более мезенхимальный фенотип, позволяет свободным клеточным агрегатам стать более жесткими и образуют более компактные сфероиды (Рисунок 1D, средний и нижний панелей). Эти результаты показывают, что точное количество rBM в результате оптимального образования сфероидов должны быть титровдляутся для каждой линии клеток и состояния.
Количественная оценка жизнеспособности клеток в сфероидах при медикаментозном лечении была необходима для оценки влияния противораковых лекарственных препаратов. Описанный здесь ассеий представляет собой асса на основе люциферина-люциферазы, который измеряет АТФ, высвобождаемый из живых клеток в сфероидах. Принцип ассеа иллюстрируется на рисунке 2А. Люминесцентный сигнал, генерируемый в этом анализе, легко записывается считывателем пластин(рисунок 2А)и хорошо коррелирует с жизнеспособностью, измеряемой другими методами23. Линейная связь между концентрацией АТФа и люминесценцией в соответствующем диапазоне концентрации показана на рисунке 2B, в то время как рисунок 2C показывает способность асссеа оценить гибель клеток в 3D сфероидах, обработанных противораковой терапии. Для дальнейшей оценки линейности асссеа в соответствующем диапазоне были проведены эксперименты по установлению стандартных кривых люминесцентного сигнала в зависимости от количества клеток(Рисунок 2D и Рисунок 2E ). Эти результаты показывают, что ассеи подходит для оценки жизнеспособности клеток в 3D сфероидных культурах и что он применим для исследования медикаментозной потери жизнеспособности клеток.
Сочетание световых микроскопических изображений, полученных каждые два-три дня, в период лечения и окончательная количественная оценка жизнеспособности клеток позволяет тщательно следить за ростом и морфологией сфероидов, а также оценку оптимального лечения Доза. Последний является примером на рисунке 3А и рисунок 3В, где доза-ответ эксперимент был проведен, чтобы определить дозу, необходимую для 50% снижение жизнеспособности клеток в MDA-MB-231 рака молочной железы сферои. Лечение эффекты на сфероидной морфологии визуализированы на рисунке 3C и рисунок 3D для MDA-MB-231 и MCF-7 сфероидов, соответственно. Во время лечения выбранным химиотерапевтическим коктейлем компактность сферои MDA-MB-231 возрастает, в то время как во время лечения тамоксифеном сфероиды MCF-7 становятся все более изношенными и неравномерными. В обоих случаях, явное падение жизнеспособности клеток видно после 7 (MDA-MB-231) или 9 (MCF-7) дней лечения(рисунок 3E и рисунок 3F). Это свидетельствует о необходимости как визуальной, так и количественной оценки опосредованного воздействия на жизнеспособность и морфологию сфероидов, а также о том, что эти параметры являются весьма специфическими для клеток и методов лечения.
В качестве дополнения к проверке жизнеспособности клеток, окрашивание мертвых клеток с PI, которые не могут пересечь мембрану и, следовательно, только пятна некротические или поздние апоптотические клетки с скомпрометированной целостности мембраны, позволяет быстро пространственную оценку мертвых клеток в ответ на лечение, без трудоемкого протокола встраивания, секционирования и IHC. Как показано на рисунке 4А пространственное расположение мертвых клеток при возрастающей концентрации ингибитора, в этом случае, ингибитор На/Нз 1 (NHE1) может быть Визуализировать. Как видно, контроль ные сфероиды показывают ограниченное некротик/ позднее апоптотическое ядро, в то время как мертвые клетки распределены по всей сфероид, как концентрация EIPA увеличивается.
Для того, чтобы количественно относительноиндукции апоптотический стресс после различных методов лечения, сфероиды были лисицированы и подвергаются SDS-PAGE гель электрофорез и западной blotting для полной длины и расщепляется полима (ADP-рибоза) полимераза (PARP). Результаты представительи показаны на рисунке 4B и рисунке 4C. В этом эксперименте, сфероиды были подготовлены из MDA-MB-231 клеток, в которых лактат-протон cotransporter MCT4 или Naq, HCO3- cotransporter NBCn1 были сбиты с помощью siRNA. Нокдаун был оценен западным и mlotting для MCT4 и NBCn1 (неопубликованные данные). Как видно, нокдаун MCT4, но не NBCn1, надежно увеличивает расщепление PARP, в соответствии с нашей предыдущей демонстрацией, что стабильный нокдаун MCT4 в MDA-MB-231 клетки снижает рост опухоли в vivo24.
Для дальнейшего анализа последствий лечения и получения информации о конкретных сигналов, рост ареста, и пути смерти активирован, сфероиды могут в дополнение к западной подевой анализ быть внедрены и подвергнуты иммуногистохимии (IHC) анализа. IHC анализ сфероидных секций позволяет использовать специфические антитела или маркеры пролиферации клеток, клеточного цикла и запрограммированной гибели клеток, а также облегчает визуализацию пространственного расположения пролиферативных и апоптотичных клеток в сфероиде.
Схематическая фигура протокола встраивания для iHC-анализа сфероидов представлена на рисунке 5A. Репрезентативное световое микроскопическое изображение приблизительно3 мкм толщиной микротома раздела встроенного сфероида показано на рисунке 5B, и иммунофлуоресценции изображение сфероида окрашенных для белка супрессора опухоли p53 (ядра окрашенных с использованием DAPI), показан как рисунок 5C. Примеры DMSO и химиотерапии лечение сфероидов окрашенных для маркера пролиферации клеток Ki-67 или для p53 показаны на рисунке 5D и Рисунок 5E, соответственно. В соответствии с антипролиферативным эффектом химиотерапии, количество Ки-67 положительных клеток больше в контроле DMSO, чем в химиотерапии лечение сфероида(Рисунок 5D). В отличие от этого, p53 выражение увеличивается в условиях клеточного стресса, апоптоза и роста ареста, и, следовательно, количество p53 окрашенных клеток значительно выше в химиотерапии обработанных сфероидов по сравнению с DMSO контроля (Рисунок 5 E).
Эти результаты иллюстрируют примеры того, как пространственно решена (PI окрашивание, IHC) или количественная (западная blotting) информация о воздействии на лечение лекарств в 3D сфероидах может быть получена.
Рисунок 1 : Спонтанное и опосредованое rBM сфероидное образование. (A) Схематическое представление образования сфероидов с использованием ультра-низкого крепления 96-хорошо круглые нижние пластины, с факультативным использованием rBM. Индивидуальные шаги, отмеченные (i-iii). (B) Схематическое представление образования сфероидов с помощью метода висячего падения. Индивидуальные шаги отмечены (i-iii) (C) Репрезентативные изображения rBM-опосредочного образования сфероидов skBr-3 клеток. Клетки были посеяны в ультра-низкой крепления 96-хорошо круглые нижние пластины с увеличением концентрации rBM и выращены в течение 9 дней. Шкала бар 100 мкм. (n'3). (D) Репрезентативные изображения bxPC-3, MiaPaCa и Panc-1 клеток, посеянных для образования сфероидов в ультра-низкой вложении 96-хорошо круглых нижних пластин с концентрациями rBM от 0,5-2,5 %. Сфероиды выращивались в течение 4 дней. Шкала бар 250 мкм. (n'3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Принцип и оценка проверки жизнеспособности клетки. (A) Схематическое представление 3D-комитета жизнеспособности клеток. Индивидуальные шаги, обозначаемые (i-iv). (B) Люминесцентный сигнал как функция концентрации АТФа. Разбавления АТФа были покрыты 96-хорошо пластины и жизнеспособности клеток реагента добавил к каждой скважине. Люминесценция была зарегистрирована после 30 мин на 405 нм. 1 n.(C ) Жизнеспособность, измеренная как люминесценция, управления и химиотерапии лечение MCF-7 сфероидов. Клетки MCF-7 были посеяны в ультра-низких пластинах крепления круглого дна и выращивались в течение 7 дней. Химиотерапия (5 км Цисплатин, 5 МКм Доксорубицин и 30 нМ 5-FU) была применена на второй день и 4. Бары представляют средние значения с SD. 1 n. (D) Люминесцентный сигнал как функция числа посеянных MCF-7 ячеек. Клетки MCF-7 были посеяны в 96-колодцах на указанном номере клетки и позволили расти в течение 48 ч, после чего была измерена жизнеспособность клеток. Ошибки баров представляют SD. 1 n. (E) Как описано в D для MDA-MB-231 клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Влияние схем лечения на сфероидную морфологию и жизнеспособность клеток. (A) Представитель изображения MDA-MB-231 сфероидов на 2, 4 и 7 день. Клетки MDA-MB-231 были посеяны в ультра-низких креплениях круглых нижних 96-колодцев. Лечение с увеличением дозы химиотерапии было начато на второй день, когда все сфероиды были одинакового размера. Строки показывают сфероиды при увеличении дозы химиотерапии, а колонки показывают сфероиды, репрезентативные размера на 2, 4 и 7 дня в указанной дозе. Самая низкая доза была 18,75 нм Цисплатин, 18,75 нм Доксорубицин, 0,0625 нМ 5-Фторурацил (5-FU) и эта доза была удвоена для каждого изображения показано, в результате чего максимальная доза 0,3 мкм Cisplatin, 0,3 мкм Doxorubicin и 2 НМ 5-FU. Шкала бар 100 мкм. (2 н). (B) Жизнеспособность mdA-MB-231 сфероидов, измеряется как люминесценция, после 7 дней химиотерапевтического лечения. Бары представляют средние значения с SEM. 2 n. (C,D) Представитель изображения MDA-MB-231 (C) и MCF-7 сфероидов (D) на день 2, 4, 7 и для MCF-7 сфероидов 9. Клетки, посеянные как в(A) и лечение либо химиотерапии (химия, 18,75 нм Цисплатин, 18,75 нм Doxorubicin, 0,0625 nM 5-FU) на второй день и 4 (C) или с 2 мкм Тамоксифен (Там) на день 2, 4 и 7 (D). Шкала бар 100 мкм. (4 н и 3 н), соответственно. (E,F) Жизнеспособность, измеряется как люминесценция, на 7 и 9 день для (C) и (D), соответственно. Для проверки на статистически значимую разницу между условиями был выполнен t-тест неспаренного студента. обозначает p qlt; 0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Propidium йодида окрашивания и западного анализа пятно сфероидов. (A) Представитель изображения PI-окрашенных MCF-7 сфероидов после 9 дней лечения. Клетки MCF-7 были посеяны в ультра-низких пластинах, выращенных в течение 9 дней и обработанных с возрастающей концентрацией EIPA на 2, 4 и 7 день. На 9-й день сфероиды были окрашены ИП и изображения были приобретены на эпифлюоресцентный микроскоп. Шкала бар 200 мкм. (1 н.) (B) Представитель западных помарки MDA-MB-231 клетки после нокаута / нокдаун кислотной базы транспортеров. NHE1 был выбит CRISPR/Cas9 в MDA-MB-231 клетки 12 и клетки были впоследствии преходяще трансфицируются siRNA против MCT4 или NBCn1, и вырос как сфероиды в течение 9 дней, прежде чем lysed и подвергаются западной blotting с помощью антитела признавая тотальную и расщепляющуюся (c)PARP. (C) Количественная оценка соотношения cPARP к уровню белка PARP, нормализованного для контроля нагрузки (з-актин). (1 n). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Фиксация, встраивание и иммуногистохимия анализа сфероидов. (A) Схематическое представление протокола для встраивания сфероидов. Отдельные шаги помечаются как (i-vii). (B) Изображение встроенного mdA-MB-231 сфероида. Шкала бар: 50 мкм. (C) Представитель изображение химиотерапии лечение MDA-MB-231 сфероид подвергается анализу IHC с антителами против p-53. Dashed линии показывают окружность сфероида. Шкала бар 20 мкм. (D,E) Представитель изображения DMSO- или химиотерапии лечение (верхние и нижние панели, соответственно) MDA-MB-231 сфероидов. Клетки MDA-MB-231 были посеяны в ультра-низких пластинах 96-ну колодец, выращены в течение 7 дней и пролечены химиотерапией на 2 и 4-й день. На 7-й день, сфероиды были встроены следуют анализ IHC с первичными антителами против Ki-67 (D) и p53 (E). Белые ящики представляют изображения зума. Шкала бар No 20 мкм в обоих увеличениях, (n'3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование 3D раковых клеток сфероидов оказался ценным и универсальным инструментом не только для скрининга противораковых препаратов, но и для получения механистического понимания регуляции смерти раковых клеток и жизнеспособности в условиях, имитирующих тех, кто в опухоли Микроокружения. Это особенно важно, поскольку доступность, клеточное поглощение и внутриклеточное воздействие химиотерапевтических препаратов глубоко влияют на физико-химические условия в опухоли, включая рН, кислородное напряжение, тортуозность, а также физические и химические клеточные клетки взаимодействия9,17. Например, кислотность внеклеточного рН, которая может достигать значений как низко как 6-6.5 во многих твердых опухолей25,26,27,28,29, вызывает слабо основные химиотерапевтические соединений, таких как доксорубицин, митоксантрон и цивистерион paclitaxel, которые будут взиматься. Это уменьшает их поглощение в опухолевые клетки и может повлиять на активность белков множественной лекарственной резистентности, таких как р-гликопротеин30,31,32. Кроме того, пролиферация клеток, которая имеет решающее значение для эффекта большинства химиотерапевтических соединений, как правило, уменьшается в 3D по сравнению с 2D условиях и, следовательно, вероятно, лучше передразнил в опухолевых сфероидов, чем в 2D-клеточной культуры8,33 ,34. Наконец, плотная микроокружение опухоли является источником многочисленных физических и растворимых сигналов, направляющих внутриклеточные сигналы, регулирующие рост клеток, выживание и смерть. Таким образом, при анализе эффективности лекарств, 3D системы культуры являются ключевым шагом, прежде чем приступить к in vivo моделей. Однако основным недостатком 3D-культуры является повышенная сложность анализа по сравнению с 2D-культурой. Мы описали здесь простые и относительно недорогие методы формирования сфероидов с использованием различных типов раковых клеток. Мы показали примеры того, как образование сфероидов должно быть оптимизировано для каждого изученного типа клеток, и описали, как получить количественные данные о жизнеспособности клеток, гибели клеток и связанных с ними сигнальных путях, в таких сфероидах. Существует никаких очевидных роста или морфологических различий между тремя моделями, описанными здесь. В наших руках, вариации в морфологии может быть немного больше, используя метод висячего падения, но преимущество этого метода является то, что rBM не требуется. Мы сосредоточились здесь на сфероиды, произведенные из одного типа раковых клеток. Сфероидная модель, однако, также поддается совместной культуре, например, раковых клеток с фибробластами, моноцитами/макрофагами, эндотелиальными клетками и/или адипоцитами35,36,37. Другие передовые приложения этой модели включают в себя сочетание с 3D печатных жидкостных устройств, позволяющих дозирования через полупроницаемую мембрану, а затем уборка для количественного протеомного профилирования38.
Хотя, как отмечалось выше, фенотип клеток, выращенных в 3D сфероидах, как правило, имитирует опухоли in vivo гораздо лучше, чем клетки, выращенные в 2D, степень, в которой такие сфероиды на самом деле соответствующие модели соответствующих опухолей in vivo зависит от многочисленных факторов и должна быть тщательно оценена. Параметры, которые будут влиять на то, насколько хорошо такие сфероиды имитируют состояние in vivo, включают клеточный состав опухоли и ее относительный состав ECM. Например, rBM, который мы использовали в качестве ECM в протоколах, представленных здесь, является хорошим выбором для имитации ранних стадий эпителиального рака, примерно во время нарушения мембраны подвала, другие составы ECM будут более актуальны для определенных опухолей типов и этапов. Кроме того, способность к сливке клеток сильно отличается между линиями раковых клеток, в зависимости от их экспрессии клеток и клеточных матричных стегезии белков, таких как кадхерин и целых цинины22.
Как описано здесь, сфероидный рост и морфология могут легко и неинвазивно контролироваться каждые 2-3 дня с помощью светового микроскопа с низкой увеличительной оптикой и большим полем зрения. Однако, поскольку цитотоксический стресс, такой как химиотерапия, влияет на сфероидную морфологию очень по-разному и, в зависимости от типа клеток и схемы лечения, недостаточно полагаться только на морфологию и окружность для оценки эффект лечения. Например, сфероиды могут стать слабее с лечением и возникающих смерти клеток, или все смерти могут произойти в некротической ядра, в то время как поверхность не заметно пострадавших. В обоих случаях результатом может быть ошибочное впечатление, что количество живых клеток в сфероиде не уменьшается при лечении. Поэтому для оценки эффекта лечения необходимы количественные и цельносные методы. Для количественной оценки гибели клеток, кислота фосфатазы ассее, который, как следует из названия, измеряет активность цитозоличной кислоты фосфатазы был использован21. Однако, в наших руках, в то время как этот анализ обычно красиво отражает количество клеток, посеянных, он не адекватно захватить быстрое лечение индуцированной клеточной смерти (данные не показали), вероятно, потому, что кислота фосфатазы остается активным в течение некоторого времени после смерти клетки. Кроме того, этот анализ требует полного удаления среды, что увеличивает ошибку, особенно с хрупкими, химиотерапией лечение сфероидов. Анализ жизнеспособности клеток, описанный здесь, основанный на содержании сотовой АТФ, был выбран на основе его простого и эффективного протокола времени и высокой воспроизводимости. Кроме того, этот вывод не требует полного удаления культуры среды, которая является преимуществом при работе со сфероидами. Как показано в репрезентативных результатах, этот обзор хорошо фиксирует как число клеток, так и ожидаемые эффекты химиотерапии. Однако, ловушка этого метода, очевидно, что метаболические изменения, уменьшающие внутриклеточное содержание АТФ, могут ошибочно быть записаны как более низкое число клеток. Таким образом, параллельная оценка объема сфероидов и морфологии, или PI окрашивания, рекомендуется для проверки результатов.
Сфероидный лисис с последующим западным промотированием может обеспечить полуколичественное понимание состояния сигнальных процессов, клеточной смерти, роста и жизнеспособности путей. Использование западного промотирования осложняется, когда rBM используется для подготовки сфероидов, так как это будет составлять значительную часть содержания белка лизата, и что более важно, его дробный вклад будет увеличиваться с уменьшением клеточного содержания во время химиотерапии клеточной смерти. В принципе можно удалить РММ центрифугированием; однако, это критический шаг, так как трудно полностью удалить все rBM, и это исключит количественное сравнение между условиями. Для таких сфероидов, да и вообще для пространственно разрешенной оценки путей смерти и соответствующих параметров сигнализации, встраивание и IHC являются сильными инструментами. Другие подходы могут быть рассмотрены: живые конфокальные изображения (относительно небольшие) нетронутые сфероиды39. Еще одно интересное свойство сфероидов является то, что, учитывая их довольно регулярной "шар" формы, они хорошо поддаются итерации между математическим моделированием и мокрой лабораторных экспериментов, чтобы увеличить понимание важности вышеупомянутого градиенты кислорода, рН и питательных веществ в сфероидах, и, путем экстраполяции, опухоли40,41. Таким образом, хотя важные 3D модели опухоли гораздо большей сложности появляются, в том числе широкий спектр органотипических и органоидных культур, основанных на сложных биологических, а также инертных эшафот, и, не в последнюю очередь, пациента полученных xenografts42, сфероиды остаются важным инструментом из-за их превосходной биологической значимости по сравнению с 2D культурой, в сочетании с относительной легкостью обработки.
Таким образом, мы представляем здесь ряд простых методов для анализа противораковых методов лечения индуцированных изменений в жизнеспособности раковых клеток и смерти в 3D-культуре. Состав сфероидов может быть изменен в зависимости от свойств и биологии используемых клеток, а представленные количественные и качественные анализы полезны как для оценки отношений между дозой и реакцией, так и для получения понимания сигнализирующих и смертельных путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны Катрин Франклин Марк и Аннет Бартельс за отличную техническую помощь и Асбьёрн Нёр-Нильсен за проведение экспериментов на рисунке 1D. Эта работа была профинансирована Фондом Эйнара Виллумсена, Фондом Ново Нордиска и Фондом Juchum (все в SFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
