Summary
Här presenterar vi flera enkla metoder för att utvärdera lönsamhet och död i 3D-cancer cell sfäroider, som efterliknar fysikalisk-kemiska gradienter av in vivo tumörer mycket bättre än 2D-kulturen. Den sfäroiden modell, därför, tillåter utvärdering av cancer drogen effekt med förbättrad översättning till in vivo villkor.
Abstract
Tredimensionella sfäroider av cancer celler är viktiga verktyg för både cancer drog skärmar och för att få mekanistisk insikt i cancer cell bio Logi. Kraften i denna beredning ligger i dess förmåga att efterlikna många aspekter av in vivo förhållanden av tumörer samtidigt som snabb, billig och mångsidig nog att tillåta relativt hög genom strömning screening. Den sfäroiden kultur förhållanden kan upprepa de fysikalisk-kemiska gradienter i en tumör, inklusive den ökande extracellulär syra, ökad laktat, och minskar glukos och syre tillgänglighet, från sfäroid periferi till sin kärna. Också, de mekaniska egenskaperna och cell-cell interaktioner av in vivo tumörer är delvis härmade av denna modell. De specifika egenskaper och därmed den optimala odlings förhållanden, av 3D sfäroider, skiljer sig mycket mellan olika typer av cancer celler. Dessutom kräver bedömningen av cellernas livs kraft och död i 3D-sfäroider metoder som skiljer sig delvis från dem som används för 2D-kulturer. Här beskriver vi flera protokoll för att förbereda 3D sfäroider av cancer celler, och för att använda sådana kulturer för att bedöma cellernas livs kraft och död i samband med utvärdering av effekten av läkemedel mot cancer.
Introduction
Användningen av multicellulära sfäroiderna modeller i cancer bio Logi är flera decennier gammal1,2, men har fått betydande driv kraft under de senaste åren. Till stor del återspeglar detta ökad medvetenhet om hur starkt fenotyp av cancer celler är beroende av deras mikromiljö och specifika tillväxt förhållanden. Mikromiljön i solida tumörer skiljer sig fundamentalt från den i motsvarande normala vävnader. Detta inkluderar fysikalisk-kemiska förhållanden såsom pH, syre spänning, samt interstitiell tryck, koncentrations gradienter av lösliga faktorer såsom näringsämnen, avfalls produkter, och utsöndras signalering föreningar (tillväxtfaktorer, cytokiner). Dessutom omfattar det organisationen av extracellulär matrix (ECM), cell-cell interaktioner och intercellulära signalering, och andra aspekter av den särskilda tredimensionella (3D) arkitektur av tumören3,4, 5,6. De specifika mikromiljömässiga förhållanden i vilka cancer celler existerar, djupt påverka deras gen uttrycks profil och funktionella egenskaper, och det är tydligt att, jämfört med den hos celler som odlas i 2D, den fenotyp av 3D sfäroider mycket mer imiterar det av in vivo-tumörer7,8,9,10,11. 2D-modeller, även om de använder hypoxi, sura pH, och höga laktat koncentrationer att efterlikna kända aspekter av tumörens mikromiljö, fortfarande inte fånga gradienter av fysikalisk-kemiska parametrar som uppstår inom tumörer, liksom deras 3D-tumör Arkitekturen. Å andra sidan, djur modeller är dyra, långsamma och etiskt problematiska, och i allmänhet, har också brister i deras förmåga att upprepa mänskliga tumör förhållanden. Följaktligen har 3D-sfäroider tillämpats som en intermediär komplexitets modell i studier av ett brett spektrum av egenskaper hos de flesta solida cancer former9,11,12,13, 14,15,16,17.
En allmänt anställd användning av 3D sfäroider är i screening analyser av cancer terapi effekt9,18,19,20. Behandlings svar är särskilt känsliga för tumörmikromiljö, vilket återspeglar både effekten av tortuositet, begränsad diffusion, hög interstitiell tryck, och sura miljömässiga pH på läkemedelstillförsel, och effekterna av hypoxi och andra aspekter av mikromiljö på celldöd svar9,17. Eftersom miljön inom 3D sfäroider naturligt utvecklar alla dessa egenskaper7,8,9,10,11, anställa 3D cell kulturer kan avsevärt förbättra översättningen av resultaten till in vivo-förhållanden, men samtidigt möjliggöra en effektiv och prisvärd screening av netto tillväxten. Emellertid, den stora majoriteten av studier på drogen svar av cancer celler är fortfarande utförs under 2D villkor. Detta återspeglar sannolikt att, medan vissa analyser relativt enkelt kan genomföras för 3D cell kulturer, många, såsom genomförbarhet analyser, Western blotting, och immunofluorescens analys, är mycket mer bekvämt gjort i 2D än i 3D.
Syftet med det nuvarande arbetet är att ge lätt mottaglig analyser och precisa protokoll för analyser av effekten av behandling med anti-cancer läkemedel på cancer cellernas livs kraft och överlevnad i en 3D-tumör härma inställning. Specifikt, vi tillhandahåller och jämför tre olika metoder för sfäroiden bildas, följt av metoder för kvalitativa och kvantitativa analyser av tillväxt, lönsamhet och drog svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generering av Sfäroider
- Förbereda cell SUS pensioner för sfäroid formation
Obs: olika cellinjer har mycket olika vidhäftnings egenskaper och det lämpligaste sfäroid bildnings protokollet måste fastställas i varje enskilt fall. Vi har funnit att MCF-7 och BxPC-3 celler är lämpliga för spontan sfäroid formation, medan MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 och MiaPaCa kräver tillsats av rekonstituerad källare membran för att framgångs rikt bilda sfäroider. Endast MDA-MB-231 och BxPC-3 celler har använts för hängande droppe protokollet, men andra cellinjer är säkert tillämpliga.- Odla celler som enskiktslager tills 70-80% confluency.
- Tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS, 5 mL för en 25 cm2 eller 10 ml för en 75 cm2 -kolv), tillsätt celldissociationsenzymen (0,5 ml för en 25 cm2 eller 1 ml för en 75 cm2 -kolv) och inkubera cellerna i 2-5 min vid 37 ° c i 5% CO2 och 95% luft fuktighet.
- Kontrol lera cell avlossning under ett Mikroskop och neutralisera cell dissociation enzym genom att tillsätta odlings substrat (6-10% serum beroende på cellinjen) till en total volym av 5 mL i en 25 cm2 eller 10 ml för en 75 cm2 kolv.
- Använd en Bürker kammare för att räkna celler och räkna 8 rutor i kammaren per cell preparat för att få en hög reproducerbarhet av storleken på sfäroiderna.
Anmärkning: Tre protokoll som beskriver en annan metod för sfäroiden bildas presenteras nedan. Protokoll 1,2 och 1,3 kan användas för alla efterföljande analytiska protokoll som presenteras, medan protokoll 1,4 lämpar sig bäst för inbäddning och lysat preparat. Beroende på cellinjen, sfäroid formation tar 2-4 dagar, oavsett vilken metod som används.
- Spontan sfäroid formation
- Utför steg 1.1.1-1.1.4.
- Späd cell SUS pensionen i ett 15 mL-rör för att erhålla 0,5-2 x 104 celler/ml (optimal cell täthet måste bestämmas för varje cellinjen) (figur 1a (II)).
- Fyll den yttre ringen av brunnar med 1x PBS eller odlings substrat för att minska avdunstning från de återstående brunnarna. Överför cell SUS pensionen till en steril behållare och Dispensera 200 μL/brunn i ultralåg infästning 96-väl runda botten plåtar (figur 1a (III)) med hjälp av en flerkanalspipett.
- Inkubera plattan i en inkubator vid 37 ° c med 5% CO2, 95% luft fuktighet.
- Varje 2-3 dagar förvärva lätta mikroskopiska bilder av sfäroiderna.
Anmärkning: Bilderna i detta papper är tagna med 11,5 x förstoring, vilket är lämpligt för de flesta sfäroider beredda att använda dessa protokoll. - Varje 2-3 dagar (efter att ha förvärvat bilder) ersätta 100 μL av mediet (avlägsna 100 μL av det förbrukade mediet och Ersätt med 100 μL färskt medium.
Anmärkning: För att undvika att ta bort sfäroider vid byte av medium, är det lämpligt att luta plattan lite medan du sakta tar bort mediet och inspektera det aspirade mediet i tipsen för synliga sfäroider innan du kastar det.
- Ombildad basal membran-medierad sfäroiden bildas.
Anmärkning: laktos dehydrogenas upplyftande virus (LDEV)-fri reducerad tillväxtfaktor rekonstituerad källare membran (rBM) användes. rBM är temperatur känslig och ska alltid hållas på isen, eftersom den kommer att koagulera om den når 15 ° c. Tina rBM på is antingen över natten vid 4 ° c eller 2-4 h vid rums temperatur (RT) före plätering.- Thaw rBM på is (se material tabell).
- Förvara plåtar och reservoarer (om de är förpackade individuellt) på isen före användning.
- Utför steg 1.1.1-1.1.4.
- Fyll den yttre ringen av brunnar med 1x PBS eller odlings substrat för att minska avdunstning från de återstående brunnarna. Späd cell SUS pensionen i ett 15 mL-rör för att erhålla 0,5-2 x 104 celler/ml (optimal cell täthet måste bestämmas för varje cellinjen) (figur 1a (II)).
- Placera det 15 mL-rör som innehåller den utspädda cell SUS pensionen på is (t. ex. i glas bägare) (figur 1a (IIA)).
- Överför Kylplattorna och behållarna till huven. Skölj plastbehållare, Fyll dem med is och överför dem till huven för att låta plattorna och reservoarerna placeras på isen under hela proceduren.
- Resuspendera rBM försiktigt för att säkerställa en homogen gel.
- Tillsätt 1-2% rBM (optimal koncentration måste bestämmas för varje cell linje) till de kylda cell SUS pensionerna (figur 1a (IIB)).
- Vänd på 15 mL-röret för att säkerställa korrekt blandning av rBM och cell SUS pension innan SUS pensionen dispensering i plattan.
- Överför den rBM-innehållande cell SUS pensionen till en steril behållare och Dispensera 200 μL/brunn i kylda Ultra-låga bilagor 96-well-plattor med hjälp av en flerkanalspipett (figur 1a (III)).
Anmärkning: Om du arbetar med flera cell SUS pensioner (t. ex. mer än en cellinjen), är det viktigt att Dispensera varje cell SUS pension omedelbart efter rBM tillägg för att förhindra för tidig Gelling. - Centrifugera plattan i 15 min vid 750 x g med hjälp av "mjukt anständigt"/ingen bromsning (om möjligt Centrifugera vid 4 ° c för att hålla RBM-vätskan längre men inte ett krav på lyckad sfäroid formation), för att säkerställa att cellerna klustras tillsammans när RBM under lätta bildandet av en enda sfäroid.
- Inkubera plattan i en inkubator (37 ° c, 5% CO2, 95% luft fuktighet).
- Varje 2-3 dagar förvärva lätta mikroskopiska bilder för utvärdering av sfäroid tillväxt.
- Varje 2-3 dagar ersätter 100 μL medium (avlägsna 100 μL och Ersätt med 100 μL färskt medium).
- Hängande droppe sfäroider.
- Utför steg 1.1.1-1.1.4.
- Späd ut cellerna för att få en lämplig spädning. En praktisk utspädning är 50 000 celler/mL.
- Ta bort locket från en 10 cm2 cell kultur rätt och placera den så att den är vänd uppåt. Tillsätt 6 mL 1x PBS till skålen (figur 1B (i)).
- Häll cell SUS pensionen i en steril behållare och placera försiktigt upp till 30 droppar 40 μL cell SUS pension på locket till cell odlings skålen med hjälp av en flerkanalspipett (figur 1B (II)), vilket resulterar i en koncentration av 2 000 celler/droppe. Undvik att placera dropparna för nära kanten på locket eftersom dessa droppar är mer benägna att förlora ytspänningen när du inverterar locket i följande steg.
- Vänd på locket i en snabb men kontrollerad rörelse och placera den ovanpå den 1x PBS-innehållande cell odlings skålen (figur 1B (III)).
- Placera skålen i en inkubator vid 37 ° c med 5% CO2 och 95% luft fuktighet utan att störa dropparna och låt dem växa i 4-6 dagar.
- Om att användas för protein cellysater eller inbäddning, pool sfäroider genom att ta bort locket och luta den, för att tvätta ner dropparna med 1 ml uppvärmt medium. Överför det resulterande mediet som innehåller sfäroider till ett 1,5 mL-rör och låt dem bosätta sig i botten av röret. Fortsätt enligt beskrivningen i 4,4 och 6.2.2 för proteinlysater respektive inbäddning.
2. läkemedels behandling av Sfäroider
Anmärkning: Långvarig läkemedels behandling kan appliceras på sfäroider för att skärmen för effekter av en drog av intresse. Innan du påbörjar läkemedels behandling, är det lämpligt att utföra en dos svar experiment av drogen (s), för att hitta en lämplig dos för experimentell behandling. Doserna bör baseras på den bestämda IC50/Ki av drogen och spänner från omkring 0.2 x-10x av detta värderar.
- Ställ in 6-12 sfäroider per önskat tillstånd enligt beskrivningen i 1,2 eller 1,3 och placera i inkubator (37 ° c, 5% CO2, 95% luft fuktighet) i 2 dagar.
- På dag 2, ta lätta mikroskopiska bilder av sfäroiderna.
- Förbered de första behandlings doserna (efter att du har förvärvat bilder).
Anmärkning: Den första behandlings koncentrationen måste vara dubbelt så stor som den önskade koncentrationen, eftersom lösningen kommer att spädas 1:2 vid tillägg till brunnen som innehåller 100 μL medium. Föreslagna intervall för läkemedels behandling (beror på halverings tiden för läkemedel): dag 2, 4 och 7. - Använd en flerkanalspipett och avlägsna försiktigt 100 μL medium och ersätt det med 100 μL läkemedel som innehåller medium.
- Placera 96-brunn plattan i inkubator vid 37 ° c med 5% CO2 och 95% luft fuktighet och upprepa 2,3 och 2,4 på de valda behandlings dagarna men nu utan att fördubbla dosen för att få korrekt DOS.
- Den sista dagen i protokollet/behandlings schema kan en eller flera av följande analyser utföras.
3. cell livs kraft analys för Sfäroider
- Ställ in 4-6 sfäroider per önskat tillstånd enligt beskrivningen i 1,2 eller 1,3 och placera i inkubator vid 37 ° c med 5% CO2 och 95% luft fuktighet.
Anmärkning: I detta fall, cell livs kraft analysen utfördes på dag 7 eller 9, efter att ha övervakat sfäroiden tillväxt varje 2-3 dagar av ljus mikroskopi som beskrivits ovan (punkt 1.2.5 och 1.3.13). - Tina den livsduglighet analyreagens (se material tabell) och låt det jämvikt till RT före användning.
- Blanda försiktigt genom att Invertera för att få en homogen lösning.
- Innan du utför analysen, ta bort 50% av odlings mediet från sfäroiderna (100 μL).
- Tillsätt cell viabilitet reagens till varje brunn i ett 1:3 förhållande till mängden medium som finns i brunnen (figur 2a (i)) för en 96-brunn platta, tillsätt 50 μL reagens till 100 μl medium.
- Blanda innehållet kraftigt i 5 minuter för att inducera celllys (figur 2a (II)).
- Inkubera i 25 min vid RT för att stabilisera självlysande signalen (figur 2a (III)).
- Spela in självlysande signalen (figur 2a (IV)).
4. förberedelser protein Lysates för Western blotting från 3D sfäroid kulturer
Anmärkning: När du samlar in sfäroider, är det lämpligt att använda en P200 pipett och skär änden av spetsen för att möjliggöra en större öppning och därmed en lättare fångst av sfäroider utan att störa deras struktur.
- För varje villkor, pool minst 12, helst 18-24 sfäroider (beroende på sfäroiden storlek) i en 1,5 mL tub (Undvik 2 mL rör, som nästa steg kommer att bli svårare på grund av deras mindre spetsiga botten).
Anmärkning: Om mängden medium överstiger 1,5 mL innan du har samlat alla sfäroider, låt de insamlade sfäroiderna att bosätta sig längst ner (händer mycket snabbt, centrifugering inte nödvändigt) och kassera halva volymen av röret innan du fortsätter att samla in kvarvarande sfäroider. - Placera rören på isen och låt sfäroiderna att bosätta sig på botten av 1,5 mL röret.
- Gå från det sterila cell laboratoriet till det vanliga laboratoriet.
- Tvätta sfäroider två gånger i 1 mL iskaffe 1x PBS. Låt sfäroider bosätta sig innan du tar bort 1x PBS mellan varje tvätt steg.
- Aspirera så mycket 1x PBS som möjligt utan att störa eller ta bort sfäroiderna.
- Tillsätt 5 μL uppvärmd lyseringsbuffert (LB) med fosfatas-och proteashämmare, per sfäroid (t. ex. 10 sfäroider = 50 μL LB).
- Upprepa intervall av virvel följt av snurra tills sfäroider löses upp. Utför en cykel av vortexa för 30 s följt av centrifugering (en snabb spinn med hjälp av en bordscentrifug är tillräcklig) för 10 s för ca. 5-10 min beroende på storlek och kompakthet av sfäroider.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. Håll cellysater vid-20 ° c tills du fortsätter med ultraljudsbehandling, homogenisering och protein bestämning som i en standard 2D protein lysate protokoll, följt av västra blotting med hjälp av standard protokoll.
5. propidium Iodide (PI) färgning av Sfäroider
- Ställ in 3-6 sfäroider per önskat tillstånd enligt beskrivningen i 1,2 eller 1,3 och placera i inkubator vid 37 ° c med 5% CO2 och 95% luft fuktighet.
- I en steril cell odlings labb, Värm 1x PBS till 37 ° c.
- Gör en PI-lösning på 4 μM genom spädning av stam lösning i 1x PBS: Späd en 1 mg/mL vattenhaltiga lager av PI 1:350 i 1x PBS.
Anmärkning: Denna koncentration kommer att ytterligare halveras vid tillsats av lösningen till de brunnar som ger en koncentration på 2 μM. 100 μL av denna lösning behövs för varje brunn som innehåller en sfäroid.
Var försiktig: Propidium jodid (PI) måste hanteras i en draghuv och bära handskar. PI är ljus känsligt. Skyddas från ljus vid hantering. - Avlägsna 100 μL av mediet från varje brunn i 96-brunnen plattan utan att ta bort sfäroiderna.
- Tvätta bort det återstående mediet genom att tillsätta 100 μL uppvärmt 1x PBS till alla brunnar följt av att ta bort 100 μL av vätskan i brunnarna. Upprepa detta tvätt steg 3 gånger.
- Tillsätt 100 μL av PI-lösningen till varje brunn, täck plattan i aluminiumfolie och placera den i en inkubator vid 37 ° c med 5% CO2 och 95% luft fuktighet för 10-15 min.
- Upprepa de 3 tvätt steg som beskrivs i 4,5 för att tvätta ur PI-lösningen, för att minska bakgrunds signalen vid avbildning.
- Använd ett epifluorescensmikroskop för att avbilda sfäroiderna. För att utvärdera genomförbarheten av celler i sfäroiden kärna ta z-stackar för att få bilder med varierande djup av sfäroid.
Anmärkning: En steg storlek runt 18-35 μm mellan varje skiva beroende på sfäroiden storlek är tillrådligt, vilket ger cirka 11-18 stackar per sfäroid. Z-stackar kan bearbetas i ImageJ med z-projektion funktion, som kan kombinera alla z-stackar i en slutlig bild, vilket ger en överblick av färgning hela sfäroiden (för ytterligare rikt linjer för användning av ImageJ för detta ändamål, se (https://imagej.net/Z-functions).
6. inbäddning av 3D Sfäroider
-
Förbered AGA ros gel i vilken sfäroiderna är inbäddade (endast nödvändigt första gången utför protokollet).
- Blanda 1 g bactoagar i 50 mL ddH2O.
- Värm långsamt i mikrovågsugnen tills bactoagar har lösts upp och en homogen gel har bildats. Låt inte gelen koka.
- Håll bactoagar varmt i ett vatten bad vid 60 ° c.
- Förvara vid 4 ° c mellan experimenten.
-
Inbäddning av sfäroider.
- På dag 1, för varje villkor, pool minst 12 sfäroider i en 1,5 mL tub.
- Tvätta en gång med 1 mL iskall 1x PBS.
- För att fixa sfäroiderna, tillsätt 1 mL 4% paraformaldehyd.
Anmärkning: Hantering av paraformaldehyd ska utföras i en draghuv. - Låt dem Inkubera i 24 timmar vid RT.
- På dag 2, Värm AGA ros gel noggrant genom att placera den i en vattenfylld bägare i en mikrovågsugn. Se till att gelen inte koka! Håll värmen i en bänk värme platta, vid 60 ° c fram till användning.
- Tvätta sfäroider två gånger med 1 mL iskall 1x PBS.
- Aspirera de flesta av 1x PBS (lämnar cirka 100 μL på denna punkt är praktiskt för hantering av sfäroider).
- Bered en 20 μL pipett genom att skära pipettspetsen i en lutning för att få en spetsig spets med ett större hål (se illustration).
Anmärkning: Nästa del måste göras snabbt för att säkerställa optimal sfäroid överföring och för att undvika stelning av gel droppe. Om inget värme block finns, är det rekommenderat att först fånga sfäroider och sedan göra AGA ros droppe (dvs byta ordning punkter 6.2.9 och 6.2.10). - Gör en AGA ros gel droppe på ett Mikroskop Slide. Placera bilden på en varm värme block för att förhindra AGA ros från stelnade.
- Med hjälp av den modifierade pipettspetsen (se 6.2.8), fånga så många sfäroider som möjligt i en volym av 15-20 μL.
- Injicera försiktigt den 15-20 μl sfäroiden innehåller 1x PBS i mitten av AGA ros gel droppe utan att vidröra Mikroskop bilden.
Anmärkning: Detta är en något svår punkt. Sfäroiderna kommer att förloras om pipettspetsen vidrör Mikroskop glaset när du injicerar sfäroiderna i gelen droppe. Det är tillrådligt att öva hela processen att göra AGA ros droppe och injicera sfäroider genom att injicera en färgad vätska i DROPPEN. Detta kommer att möjliggöra visualisering av en potentiell penetration genom droppe, som den färgade vätskan kommer att läcka ut på bilden. - Låt AGA ros gel sjunka hårdnar genom inkubering för 5-10 min vid RT eller vid 4 ° c. När gelen droppe har stelnat något (men är fortfarande ganska mjuk), försiktigt trycka gel droppe från Mikroskop glida in i en plast vävnad kassett med en skalpell.
- Täck plast vävnads kassetterna i 70% etanol.
Anmärkning: Vid denna punkt sfäroider kan användas direkt eller lagras i månader. - Bädda in agarose-inbäddade sfäroiden i paraffin, avsnitt i 2-3 μm tjockt lager dia bilder och fläck med hematoxylin och eosin eller föremål för immuno-histologisk färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sfäroid tillväxt analyser baserade på sfäroid formation protokoll schematiskt illustreras i figur 1A och figur 1B, användes som utgångs punkt för analys av effekterna av anti-cancer läkemedel behandlingar i en 3D-tumör inställning av härma. Den lätthet med vilken sfäroider bildas är cellinjen specifika, och vissa cellinjer kräver tillskott med rBM för att bilda sammanhängande sfäroiderna22. Koncentrationen av de rBM som tillsätts kan i grunden påverka sfäroidernas morfologi. Som visas i figur 1C och figur 1D, varierar koncentrationen av RBM mellan 0 och 4% förändrar kompakthet och morfologi av sfäroider i en cell typ beroende sätt. Figur 1 C visar hur tillägg av upp till 2,5% RBM tillåter sfäroid bildning i skbr-3 bröst cancer celler, utan ytterligare effekt vid koncentrationer över 2,5% RBM. I kontrast, BxPC3 bukspottkörtelns duktal adenocarcinom (PDAC) celler, som uppvisar en epitelial morfologi, spontant bildar små, kompakta sfäroider (figur 1D, övre, vänster panel). I denna cell typ, ökar rBM koncentration till 1,5% eller högre framkallar en distinkt morfologisk förändring från sfäroiden till mer invecklad strukturer med utskjutande och invaginations, som påminner om duktal tubulära struktur formation. Omvänt, tillsats av RBM till två andra PDAC cellinjer, miapaca och Panc-1, som har en mer mesenkymala fenotyp, gör att lösa cellulära aggregat att bli hårdare och bilda mer kompakta sfäroider (figur 1D, mellersta och nedre och paneler). Dessa resultat visar att den exakta mängden rBM som resulterar i optimal sfäroid formation måste titreras för varje cell linje och tillstånd.
En kvantitativ bedömning av cellernas lönsamhet inom sfäroiderna vid läkemedels behandling var nödvändig för att utvärdera effekten av behandlingar mot cancer läkemedel. Analysen som beskrivs här är en luciferin-luciferase-baserad analys, som mäter ATP frigörs från levande celler inom sfäroider. Principen för analysen illustreras i figur 2A. Den självlysande signal som genereras i denna analys är lätt registreras av en Plattläsare (figur 2a) och korrelerar väl med lönsamhet mätt med andra metoder23. Det linjära sambandet mellan ATP-koncentrationen och luminiscens i det relevanta koncentrations området visas i figur 2B, medan figur 2C visar analysens förmåga att bedöma celldöd i 3D-sfäroider som behandlats med behandling mot cancer. För att ytterligare utvärdera den linearitet av analysen i det relevanta intervallet, experiment för att fastställa standard kurvor av självlysande signalen som en funktion av antalet celler utfördes (figur 2D och figur 2E ). Dessa resultat tyder på att analysen är lämplig för att uppskatta cellernas livs kraft i 3D sfäroiden kulturer och att det är tillämpligt för att utreda läkemedelsinducerad förlust av cellernas livs kraft.
En kombination av lätta mikroskopiska bilder som förvärv ATS varannan till var tredje dag, under behandlings perioden och en slutlig kvantitativ bedömning av cellernas livs kraft möjliggör noggrann övervakning av sfäroid tillväxt och morfologi samt bedömning av optimal behandling Dos. Det sistnämnda exemplifieras i figur 3A och figur 3B, där ett DOS-responsexperiment utfördes för att fastställa den dos som krävdes för 50% reducerad cell livs kraft i MDA-MB-231 bröst Cancer sfäroider. Behandlings effekter på sfäroid morfologi visualiseras i figur 3C och figur 3D för MDA-MB-231 och MCF-7 sfäroider, respektive. Under behandling med den valda kemoterapeutiska cocktail, den kompakthet av MDA-MB-231 sfäroider ökar, medan under behandling med tamoxifen, MCF-7 sfäroider blir alltmer nött och ojämn. I båda fallen är en tydlig droppe i cellernas livs kraft synlig efter 7 (MDA-MB-231) eller 9 (MCF-7) dagars behandling (figur 3E och figur 3F). Detta visar på behovet av både en visuell och en kvantitativ bedömning av behandlingsmedierade effekter på sfäroiden cell livs kraft och morfologi samt att dessa parametrar är mycket cell-och behandling-typ specifika.
Som ett komplement till cell livs kraft assay, färgning av döda celler med pi, som inte kan passera membranet och därför bara fläckar nekrotiska eller sena apoptotiska celler med äventyras membran integritet, möjliggör en snabb rumslig utvärdering av döda celler i behandlings svar, utan tidsödande protokoll för inbäddning, snittning och IHC. Som illustreras i figur 4A det rumsliga arrangemanget av döda celler vid en ökande koncentration av en inhibitor, i detta fall, na+/h+ värmeväxlare 1 (NHE1)-hämmare 5-(n-etyl-n-ISOPROPYL)-amilorid (EIPA), kan Visualiseras. Som sett, kontroll sfäroider visar en begränsad nekrotisk/sen apoptotiska kärna, medan de döda cellerna fördelas hela sfäroiden som koncentrationen av EIPA ökas.
För att kvantifiera den relativa induktionen av apoptotisk stress efter olika behandlingar lyserades sfäroider och utsattes för SDS-Page gel elektrofores och Western blotting för ful längds och klyvt poly (ADP-ribose) polymeras (PARP). Representativa resultat visas i figur 4B och figur 4C. I detta experiment, sfäroider utarbetades från MDA-MB-231 celler där laktat-Proton cotransportör MCT4 eller na+, HCO3- sglt NBCn1 slogs ner med siRNA. Knockdown utvärderades av Western blotting för MCT4 och NBCn1 (opublicerade data). Som sett, den knockdown av MCT4, men inte av NBCn1, kraftfullt ökar PARP klyvning, i enlighet med vår tidigare demonstration att stabila knockdown av MCT4 i MDA-MB-231 celler minskar tumör tillväxt in vivo24.
För att ytterligare analysera effekterna av behandlingen och få information om den specifika signalering-, tillväxt gripandet, och död vägar aktive ras, kan sfäroider förutom västra blot analys bäddas in och utsätts för immunohistokemi (IHC) analys. IHC analys av sfäroid avsnitt tillåter användning av specifika anti kroppar eller markörer för cellproliferation, cell cykel och programmerad celldöd, och underlättar en visualisering av den rumsliga arrangemang av proliferativa och apoptotiska celler i sfäroiden.
En Schematisk bild av inbäddnings protokollet för IHC-analys av sfäroider presenteras i figur 5A. En representativ ljus Mikroskopisk bild av en ca. 3 μm tjock mikrotomen avsnitt av en inbäddad sfäroid visas i figur 5B, och en immunofluorescens bild av en sfäroid färgade för tumörsuppressor proteinet p53 (kärnor färgade med DAPI) visas som figur 5C. Exempel på DMSO och kemoterapibehandlade sfäroider färgade för cellproliferation markör KI-67 eller för p53 visas i figur 5D respektive figur 5E. I överensstämmelse med kemoterapibehandlingens antiproliferativa effekt är antalet positiva celler av KI-67 större i DMSO-kontrollen än i den kemoterapibehandlade sfäroiden (figur 5D). Däremot ökar p53-uttrycket under förhållanden med cell stress, apoptos och tillväxt stillestånd, och därför är antalet p53-färgade celler betydligt högre i de kemoterapibehandlade sfäroiderna jämfört med DMSO-kontroller (figur 5 E).
Dessa resultat illustrerar exempel på hur rumsligt löst (PI-färgning, IHC) eller kvantitativ (Western blotting) information om läkemedels behandling effekter i 3D sfäroider kan erhållas.
Figur 1 : Spontan och rBM-medierad sfäroid formation. (A) Schematisk representation av sfäroid formation med ultra-låg infästning 96-väl runda botten plattor, med valfri användning av RBM. Enskilda steg markerade med (i-III). (B) Schematisk representation av sfäroid formation med hjälp av hängande Drop metoden. Enskilda steg är markerade med (i-III) (C) representativa bilder av RBM-medierad sfäroid bildandet av skbr-3-celler. Celler var seedade i ultra-low kvarstad 96-väl runda botten plattor med ökande koncentrationer av rBM och odlas för 9 dagar. Skalbar 100 μm. (n = 3). (D) representativa bilder av bxpc-3, MiaPaCa och Panc-1 celler seedade för sfäroid formation i ultra-low kvarstad 96-väl runda botten plattor med koncentrationer av RBM från 0.5-2.5%. Sfäroider odlades i 4 dagar. Skalstapeln = 250 μm. (n = 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Princip och utvärdering av cell livs kraft analysen. (A) Schematisk representation av analysen av 3D-cellviabilitet. Enskilda steg betecknas med (i-IV). (B) Luminescent signal som en funktion av ATP-koncentrationen. Utspädningar av ATP var klädd i en 96-well plattan och cell livs kraft reagens läggas till varje brunn. Luminescence spelades in efter 30 min vid 405 nm. 1 subst.clivsduglighet, mätt som Luminescens, kontroll och kemoterapibehandlade MCF-7 sfäroider. MCF-7 celler var seedade i ultra-låg infästning runt botten plattor och odlades i 7 dagar. Kemoterapibehandling (5 μM cisplatin, 5 μM doxorubicin och 30 nM 5-FU) applicerades på dag 2 och 4. Staplar representerar medelvärden med SD. 1 n. (D) Luminescent signal som funktion av antalet MCF-7-celler seedade. MCF-7 celler var seedade i 96-well plattor på indikerade cell nummer och får växa för 48 h, varefter cellernas livsduglighet mättes. Felstaplar representerar SD. 1 n. (E) enligt beskrivningen i D för MDA-MB-231-celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Effekter av behandlingsregimer på sfäroiden morfologi och cellernas livs kraft. Arepresentativa bilder av MDA-MB-231 sfäroider dag 2, 4 och 7. MDA-MB-231 celler var seedade i ultra-låg infästning runda botten 96-well tallrikar. Behandling med ökande doser av kemoterapi startades på dag 2, då alla sfäroider var av liknande storlek. Rader visar sfäroider vid ökande doser av kemoterapi, och kolumner visar sfäroider representativa för storlek på dag 2, 4, och 7 vid den angivna dosen. Den lägsta dosen var 18,75 nM cisplatin, 18,75 nM doxorubicin, 0,0625 nM 5-fluorouracil (5-FU) och denna dos fördubblades för varje visad bild, vilket resulterade i en maximal dos på 0,3 μM cisplatin, 0,3 μM doxorubicin och 2 nM 5-FU. Skalbar = 100 μm. (2 n). B) livs kraft för MDA-MB-231 sfäroider, mätt som Luminescens, efter 7 dagars kemoterapeutisk behandling. Staplarna representerar medelvärden med SEM. 2 n. (c, D) representativa bilder av MDA-MB-231 (c) och MCF-7 sfäroider (D) dag 2, 4, 7 och för MCF-7 sfäroider 9. Celler seedade som i (a) och behandlades med antingen kemoterapi (chemo, 18,75 Nm Cisplatin, 18,75 Nm Doxorubicin, 0,0625 nM 5-Fu) på dag 2 och 4 (C) eller med 2 μM tamoxifen (TAM) dag 2, 4 och 7 (D). Skalbar = 100 μm. (4 n respektive 3 n). (E, F) Livs kraft, mätt som Luminescens, dag 7 och 9 för (C) respektive (D). För att testa statistiskt signifikant skillnad mellan förhållandena utfördes ett oparat Students t-test. betecknar p < 0,0001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Propidium jodid färgning och Western blot-analys av sfäroider. (A) representativa bilder av PI-färgade MCF-7 sfäroider efter 9 dagars behandling. MCF-7 celler var seedade i ultra-low kvarstad 96-well plattor odlas för 9 dagar och behandlas med ökande koncentrationer av EIPA på dag 2, 4 och 7. På dag 9, var sfäroiderna färgas med Pi och bilder förvärvades på ett epifluorescensmikroskopi Mikroskop. Skalbar = 200 μm. (1 n.) Brepresentativa Western blotting av MDA-MB-231-celler efter knockout/knockdown av syra bas transportörer. NHE1 slogs ut av crispr/Cas9 i MDA-MB-231 celler 12 och cellerna därefter transitivt transfekterade med siRNA mot MCT4 eller NBCn1, och odlas som sfäroider i 9 dagar innan de lyseras och utsätts för Western blotting med hjälp av en anti kropp erkänner totalt och klyvs (c) PARP. Ckvantifiering av kvoten mellan CPARP och PARP-proteinnivå, normaliserad till belastnings kontroll (β-aktin). (1 n). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Fixering, inbäddning och immunhistokemi analys av sfäroider. ASchematisk representation av protokollet för inbäddning av sfäroider. Enskilda steg markeras som (i-VII). (B) bild av Embedded MDA-MB-231 sfäroid. Skalbar: 50 μm. (C) representativ bild av kemoterapibehandlade MDA-MB-231 sfäroiden som utsätts för IHC-analys med anti kroppar mot p-53. Streckade linjer visar omkretsen av sfäroiden. Skalstapeln = 20 μm. (D, E) representativa bilder av DMSO-eller kemoterapibehandlade (övre och undre paneler, respektive) MDA-MB-231 sfäroider. MDA-MB-231 celler var seedade i ultra-låg bilaga 96-well plattor, odlas i 7 dagar och behandlas med kemoterapi på dag 2 och 4. På dag 7 var sfäroiderna inbäddade följt av analys av IHC med primära anti kroppar mot KI-67 (D) och p53 (E). Vita rutor representerar zoombilder. Skalstapeln = 20 μm i båda förstoringar, (n = 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av 3D cancer cell sfäroider har visat sig vara en värdefull och mångsidig verktyg inte bara för cancer läkemedel screening, men också för att få mekanistiska insikt i regleringen av cancer celldöd och livs kraft under förhållanden imitera dem i tumören mikromiljö. Detta är särskilt viktigt eftersom tillgängligheten, cellulära upptag, och intracellulära effekter av kemoterapeutiska läkemedel är djupt påverkad av de fysikalisk-kemiska förhållandena i tumören, inklusive pH, syre spänning, tortuositet, och fysiska och kemisk cell-cell interaktioner9,17. Till exempel, surhets graden av extracellulär pH, som kan nå värden så lågt som 6-6,5 i många solida tumörer25,26,27,28,29, orsakar svagt grundläggande kemoterapeutiska substanser, såsom doxorubicin, mitoxantron och zwitterion paklitaxel, som ska laddas. Detta minskar deras upptag i tumör cellerna och kan påverka aktiviteten hos multiresistenta proteiner såsom p-glykoprotein30,31,32. Även cellproliferation, som är avgörande för effekten av de flesta kemoterapeutiska föreningar, är i allmänhet reduceras i 3D jämfört med 2D-villkor och därmed sannolikt bättre härmade i tumör sfäroider än i 2D cell kultur8,33 ,34. Slutligen, den täta tumören mikromiljö är ursprunget till många fysiska och lösliga signalering Cues styra intracellulära signalering vägar som reglerar cell tillväxt, överlevnad och död. Således, när man analyserar läkemedels effekt, 3D-kultursystem är ett avgörande steg innan du påbörjar in vivo-modeller. En stor nackdel med 3D-kulturen är dock den ökade komplexiteten i analys jämfört med 2D-kulturen. Vi har beskrivit här enkla och relativt billiga tekniker för sfäroid formation med hjälp av en mängd olika cancer cell typer. Vi har visat exempel på hur sfäroid bildas måste optimeras för varje cell typ studeras och har beskrivit hur man kan få kvantitativa data om cellernas livs kraft, celldöd, och tillhör ande signal vägar, i sådana sfäroider. Det finns inga uppenbara tillväxt-eller morfologiska skillnader mellan de tre modellerna som beskrivs här. I våra händer kan variationen i morfologi vara något större med hjälp av hängande droppe metoden, men en fördel med denna metod är att rBM inte behövs. Vi har fokuserat här på sfäroider produceras från en enda cancer cell typ. Den sfäroiden modellen är dock också mottaglig för samkultur, till exempel av cancer celler med fibroblaster, monocyter/makro Fager, endotelceller, och/eller adipocyter35,36,37. Andra avancerade tillämpningar av denna modell inkluderar kombinationen med 3D-tryckta fluidiska enheter som möjliggör dosering genom ett semipermeable membran, följt av skörd för kvantitativ proteomiska profilering38.
Medan, som nämnts ovan, den fenotyp av celler som odlas i 3D sfäroider i allmänhet härmar det av in vivo tumörer mycket bättre än att göra celler som odlas i 2D, i vilken utsträckning sådana sfäroider är i själva verket relevanta modeller av motsvarande in vivo tumörer är beroende av många faktorer och måste utvärderas noggrant. Parametrar som kommer att påverka hur väl sådana sfäroider efterlikna in vivo tillstånd inkluderar cellulära sammansättningen av tumören och dess relativa ECM sammansättning. Till exempel, de rBM som vi har anställt som ECM i de protokoll som anges här är ett bra val för imitera tidiga stadier av epitelial cancer, runt tiden för brott mot källaren membran, andra ECM kompositioner kommer att vara mer relevant för vissa tumör typer och stadier. Dessutom skiljer sig kapaciteten för cell-cell adhesion kraftigt mellan cancer cellinjer, beroende på deras uttryck av cell-cell och cell-Matrix adhesionproteiner såsom cadherins och integriner22.
Som beskrivs här, sfäroid tillväxt och morfologi kan enkelt och icke-invasivt övervakas varje 2-3 dagar med hjälp av ett lätt Mikroskop med låg förstoring optik och ett stort synfält. Emellertid, eftersom den cytotoxiska stress, såsom kemoterapi behandling, påverkar sfäroid morfologi mycket annorlunda och, på ett sätt, beroende på cell typ och behandlings system, det är inte tillräckligt att förlita sig på morfologi och omkrets ensam för att utvärdera och behandlings effekt. Till exempel, sfäroider kan bli lösare med behandling och framväxande celldöd, eller all död kan inträffa i den nekrotiska kärnan, medan ytan inte detectably påverkas. I båda fallen kan resultatet bli ett felaktigt intryck av att antalet levande celler i sfäroiden inte reduceras av behandlingen. Kvantitativ-och hel-sfäroid tekniker är därför avgörande för att utvärdera behandlings effekt. För kvantitativ utvärdering av celldöd har syra fosfatas-analysen, som som namnet antyder mäter aktiviteten av cytosolisk fosfatas, varit anställd21. Men i våra händer, medan denna analys i allmänhet snyggt återspeglar antalet celler seedade, det inte tillräckligt fånga snabb behandling-inducerad celldöd (data visas inte), sannolikt eftersom syran fosfatas förblir aktiv under en tid efter celldöd. Dessutom kräver denna analys fullständig borttagning av mediet, vilket ökar felet särskilt med bräckliga, kemoterapi-behandlade sfäroider. Cell livs kraft analysen beskrivs här, som bygger på cellulär ATP-innehåll, valdes baserat på dess enkla och tids effektiva protokoll och hög reproducerbarhet. Vidare, denna analys kräver inte fullständig borttagning av odlings substrat som är en fördel när man arbetar med sfäroider. Som visas i representativa resultat, denna analys fångar väl både cell nummer och förväntad kemoterapi behandlings effekter. Dock är en fallgrop av denna teknik, uppenbarligen, att metaboliska förändringar minska intracellulär ATP innehåll felaktigt kan registreras som ett lägre cell nummer. Därför är parallell bedömning av sfäroiden volym och morfologi, eller PI färgning, tillrådligt att validera resultat.
Spheroid Lys följt av Western blotting kan ge semi-kvantitativ inblick i tillståndet för signalering processer, celldöd-, tillväxt-och genomförbarhet vägar. Användningen av Western blotting är komplicerat när rBM används för att förbereda sfäroider, eftersom detta kommer att omfatta en betydande del av lysat protein innehåll, och ännu viktigare, kommer dess fraktionerad bidrag öka med minskande cellulära innehåll under kemoterapeutisk celldöd. Det är i princip möjligt att avlägsna rBM genom centrifugering. Detta är dock ett kritiskt steg, eftersom det är svårt att helt ta bort alla rBM, och detta kommer att utesluta kvantitativ jämförelse mellan förhållandena. För sådana sfäroider, och i allmänhet för rumsligt löst bedömning av död vägar och relevanta signalering parametrar, inbäddning och IHC är starka verktyg. Andra angrepps sätt kan övervägas: levande konfokal avbildning av (relativt små) intakt sfäroider39. En annan intressant egenskap av sfäroider är att med tanke på deras ganska vanliga "Ball" form, de lämpar sig väl för iteration mellan matematisk modellering och våta labb experiment, för att öka förståelsen av vikten av de ovan nämnda gradienter av syre, pH, och näringsämnen inom sfäroider, och, genom extrapolering, tumörer40,41. Således, även om viktiga 3D tumör modeller av mycket större komplexitet växer fram, inklusive ett brett spektrum av organotypiska och organoid kulturer baserade på komplexa biologiska och inerta ställningar, och, inte minst, patient-derived xenograft42, sfäroider förblir ett viktigt verktyg på grund av sin överlägsna biologiska relevans jämfört med 2D-kulturen, kombinerat med relativ enkel hantering.
Sammanfattnings vis presenterar vi här en rad enkla metoder för analys av anti-cancer behandling-inducerad förändringar i cancer cellernas livs kraft och död i 3D-kultur. Sammansättningen av sfäroiderna kan ändras beroende på egenskaperna och biologin hos de celler som används, och de kvantitativa och kvalitativa analyser som presenteras är användbara både för att bedöma dos-respons-relationer och för att få insikt i signal-och döds vägar inblandade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar ingen intresse konflikt.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Katrine Franklin mark och Annette Bartels för utmärkt teknisk assistans och Asbjørn Nøhr-Nielsen för att ha utfört experimenten i figur 1D. Detta arbete finansierades av Einar Willumsen Foundation, Novo Nordisk Foundation, och Fondation Juchum (alla till SFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
