成人ゼブラフィッシュハートの研究のための胸腔内圧注射

Summary

この方法は、0.5 −3μ l の溶液を成体ゼブラフィッシュの胸郭に注入することに依存する。この手技は、タンパク質や化学化合物を、器官を傷つけることなく、ゼブラフィッシュの心臓の近くに効率的に供給します。アプローチは、心臓の様々な組織に外因性因子の効果をテストするのに適しています.

Abstract

大人のゼブラフィッシュハートは、心臓再生研究において強力なモデルを提供する。このシステムの強度はトランスジェニックアプローチに基づいているが、外因性因子の迅速な送達は、機能的研究において相補的な技術を提供する。ここでは、心筋障害を起こさずに心膜腔に数マイクロリットルの溶液を投与することに依存する方法を提示する。胸腔内圧 (IT) 注射は、タンパク質や化学化合物を心臓表面に効率的に直接送達することができます。注入された物質は、心外膜を通って下層の心臓組織に拡散します。腹腔内 (IP) 注射と比較して、胸腔内圧注射の主な利点は、標的器官上の試験された因子の焦点投与である。心膜への分子の直接の送達は、成人ゼブラフィッシュにおける心臓プレコンディショニングおよび再生の研究に適した戦略である。

Introduction

脊椎動物の中では、ゼブラフィッシュは心を再生するための顕著な能力を持っています^1,2。この能力は、いくつかの傷害モデル、すなわち心室頂部切除術、cryoinjury (CI) および遺伝子心筋切除^{3、4、5、6、7}で報告されている。侵襲的傷害の後、心室の損傷した壁は、線維性組織によって一過性に治癒し、これは新たな心筋細胞^{8、9、10、11}に徐々に置換される。早期創傷治癒応答には、免疫細胞^{12、13、14、15}の心外膜活性化および動員が含まれる。それに付随して、損傷した心筋の近くの心筋細胞が活性化され、dedifferentiate が増殖し、徐々に傷ついた領域を交換し、30−90日目の^16,17,18以内に、¹⁹. 心臓再生の分子・細胞機構の解読における実質的な進歩は、細胞系譜トレース解析、誘導性遺伝子過剰発現などの遺伝子ツールの有用性のおかげで達成された。蛍光組織レポーターライン、および CRISPR/Cas9 遺伝子の突然変異誘発^20、21。

我々は最近、大人のゼブラフィッシュに開胸^22,23によって心臓プレコンディショニングのモデルを確立した。プレコンディショニングは心臓保護遺伝子の発現を増加させ、細胞周期への再進入を、無傷で再生している心で高めます。これらのプロセスは、免疫細胞の動員およびマトリクスリモデリング^22、24に関連している。プレコンディショニングのメカニズムはあまり理解されておらないので、この分野の研究を促進するためには新しい技術の確立が必要である。特に、分泌型シグナル伝達タンパク質または他の化学化合物の最適化された投与は、このトピックをさらに調査するために不可欠である。

ゼブラフィッシュは水生動物であるため、その鰓や皮膚を通して水に溶けた様々な物質を自然に吸収することができる。これは、薬理学的阻害剤、ステロイドホルモン、タモキシフェン、BrdU および抗生物質などの多様な化学物質との溶液中での魚の浸漬を介した非侵襲的薬物送達の可能性を提供する。実際に 、私たちの^25、26、27を含む様々な研究所からの多数の研究は、この方法を利用しており、これは再生生物学⁶の分野で特に価値があり、²⁸. しかしながら、このアプローチは、ペプチド、DNA、RNA、morpholinos または限られた組織透過性を有する分子の送達には適切ではない。これらの場合において、より効率的な送達は、身体内へのマイクロインジェクションによって達成され、例えば、該毛細血管をレトロ軌道静脈洞に挿入することによって、腹腔内または intrapericardial 腔^29、30に、 ³¹です。ここでは、成人ゼブラフィッシュにおける心臓再生とプレコンディショニングを研究するのに適した方法として、少量の溶液の胸腔内圧注射の手順について述べる。

Protocol

動物のケアと以下のプロトコルに記載されているすべての動物の手順は、フリブール、スイスの州獣医事務所によって承認しました。

1. 注射のためのツールとソリューション

1. 図 1aに従って針の引き手を使用してマイクロインジェクションに適合したホウケイ酸ガラスの毛細血管を引っ張る。粘土または粘着テープのモデリングのレールを使用して、9 cm ペトリ皿に毛細血管を引っ張って保管してください。
2. 一般的なはさみを使用して、スポンジ (7 cm x 3 cm x 1cm) の部分をカットし、その真ん中に魚のようなシルエットを彫る。
3. 試験したタンパク質または他の化合物を用いて注射液の小さなアリコートを調製する。1x ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) の物質を 10% フェノールレッドで補完することにより、アッセイにおけるそれらの濃度依存的を調整します。
   注:ここで、試験したタンパク質の濃度は 100 ng/mL であった。
4. 緩衝 tricaine 麻酔薬の原液を調製するには、蒸留水の 980 mL で 4 g の tricaine を溶解します。1 M トリス HCl pH 9 を使用して pH を7.0 −7.4 に調整し、1000 mL まで水で満たしてください。4° c で暗所で溶液を保管してください。
5. 麻酔薬の作業濃度を得るために、tricaine 原液の1−2ml をビーカーに 50 mL の魚水に加える。
   注:Tricaine 麻酔薬の作業濃度は、使用前に新鮮に調製する必要があります。

2. インジェクションステーションの準備

1. 上からの光で実体顕微鏡をオンにし、倍率を16x に調整します。
2. スポンジを魚の水で浸し、9センチペトリ皿の上に置いて、顕微鏡の段階でピントを合わせます。
3. 実体顕微鏡の下で、図 1aに示すように、iridectomy はさみを用いて microcapillary の端を〜 7 mm で切断した。理想的な先端の直径は〜20μ m であろう。
   注:毛管の先端を斜めの方法で切ることはティッシュへの挿入のために最適である。
4. Microinjector 装置の針ホルダーに microcapillary を挿入します。
5. Microloader チップを使用して、制御溶液 (例えば 1x HBSS) を負荷して注入の圧力を設定し、0.3 μ l/s と0.5 μ l/s の間の適切な流れを得るために、針を空にします。
6. 選択された注射液の体積 (例えば、1x HBSS で希釈した毛様神経栄養因子 [CNTF]) を毛細管の先端にロードする (図 1b)。毛細血管に気泡がないこと。
   注:射出液の最大量は、魚の大きさに依存します。2.5 − 3cm (鼻から尾花梗までの距離) の標準的な長さについては、胸部腫脹および出血の exessive を防止する最大注入容積は5μ l であると判定された (図 1f)。より大きい容積はより大きい魚に注入することができる。

3. 胸腔内圧注射用魚の準備

1. 大人のゼブラフィッシュ (ダニオ rerio) をネットでキャッチし、麻酔液に移します。
2. 1−2分後、魚が泳ぎをやめて蓋の動きが減ると、プラスチックのスプーンで魚を触って、どんな接触にも反応しないことを確認します。
3. 直ちにスプーンで魚を湿ったスポンジの溝に、腹側を上げて、慎重に移します。魚の頭は、オペレータの支配的な手から離れて向ける必要があります。

4. 心膜への微量注入

1. 実体顕微鏡の下で、魚の皮の下で鼓動する心臓の動きを注意深く観察してください。心臓の鼓動の上と腹部の軟骨プレートによって定義された三角形の中の射出点を視覚的に決定します (図 1d)。体軸に対して30−45°の角度で毛細管の先端を挿入します (図 1e)。Microcapillary の先端を心膜に優しく肌に浸透させる (図 1c)。最適なエントリポイントは、頭よりも腹部に近いです。
   注:身体や心臓に毛細血管をあまり深く挿入しないようにしてください。心臓穿刺の場合、針は一般的に血液で満たされます。この場合、毛細管を取り除き、実験から魚を除外します。
2. 針が心膜の中にあれば、microinjector 装置のペダルを押すことによって完全な注入。
   注:胸腔に空気を注入しないように注意してください。
3. 注射後、慎重に胸郭から毛細管を引き出し、すぐに回復のためのシステム水でタンクに魚を移します。
4. 麻酔からの総回復まで魚を監視します。
5. 所望の時点で心を収集し、さらなる分析のためにそれを準備します。
   注:魚が30秒以内に蓋の動きを再開しない場合には、プラスチックピペットで鰓に水を絞ることによって魚を復元。

Representative Results

胸腔内圧 (それ) 注射後、外因性溶液の効果を分析することができる。この目的のために、以前に公開されたプロトコル^32、33によると、魚を安楽死させるべきであり、心は、収集し、固定し、組織的に処理しました。

その方法を検証するために、まず色と蛍光染料を注入して2回の試験実験を行った。最初に、我々は、胸部の中に、魚を注入した3μ l のインクを安楽死させる。5分後に心臓を採取し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄し、2% ホルマリンで固定し、PBS で洗浄し、顕微鏡下で撮影した。第2に、インビボで1μ g/mL 4 ′、6-diamidino-2-フェニル (DAPI) の3μ l を注入し、2時間後に心臓を固定した。両方のアッセイにおいて、全マウント分析では、心室、心房および bulbus 管を含む心臓全体の標識を明らかにした (図 2a、B)。これらの結果は、注入された溶液を心臓表面に効率的に拡散することを明らかにする。

成体魚への外因性物質の送達のための一般的なプロトコルは、腹腔内 (IP) 注射である。それと心臓研究のための IP 注射の適合性を比較するために、, 我々は両方の方法を使用して DAPI の同様の量を注入し、5分と120分後に心を固定しました (図 3a).心臓を切片にし、ファロイジンのアレクサ Fluor (AF) 568 で染色し、心筋の F-アクチンにラベルを付ける。両方の時点で IP 注入後に DAPI 陽性細胞は心臓に認められなかった (図 3b)。これに対して、注入は、心筋に DAPI 標識核の存在をもたらした (図 3b)。これらの結果は、IP 注入と比較して、それが心臓への化合物の送達を改善したことを示す。

心臓再生研究のためにこの方法の適合性を試験するために、我々は、心室⁸を cryoinjured し、それにより、3および7日後に cryoinjury (dpci) で1μ g/ml DAPI と1μ g/ML ファロイジン AF649 の注射を行った (図 4a)。1時間後注射で、心臓を採取し、固定し、切片にし、ファロイジン AF568 で染色して、無傷の心筋を視覚化した。我々は、心筋および損傷組織の両方が多数の DAPI 陽性細胞を含んでいることを見出し、この染料を無傷の心臓および線維化組織への効率的な浸透を示す (図 4b)。さらに、注入されたファロイジン AF649 もまた、損傷領域の心筋細胞と、傷ついた区域のいくつかの募集した線維芽細胞によって組み入れられる。この実験は、薬物が心外膜を通過して、根底にある心筋に浸透できることを明らかにしている。

染料を用いた注射の効率を試験した後、心臓に注入されたタンパク質の効果を分析した。我々は、開胸²⁴の後にアップレギュレーションされる CNTF と呼ばれるサイトカインを synthetized した。我々は、様々なプロセスにおける外因性 CNTF の効果を調べた, すなわち心筋細胞の増殖, セル外マトリックス沈着, 免疫細胞の動員と心臓保護遺伝子発現.我々は、コントロール免疫グロブリン (図 5)²⁴と比較して、これらすべての生物学的側面が CNTF の IT 注入によって活性化されたことを発見した。これらの結果は、胸腔内圧注射の方法がタンパク質の標的送達に対して適切な戦略を提供し、種々のアッセイにおける特徴的な心臓組織への影響を研究することを示す。

図 1: 成人ゼブラフィッシュに Intrathorascic (IT) インジェクション。(A) フィラメント (6 "、1.0 mm 径) を有するプルされたマイクロインジェクション毛細管の写真と、使用する針の引き手プログラムの値。(B) フィラメント (6 ", 1.0 mm 径) を有する注入されたマイクロインジェクション毛細管の写真を 10% フェノールレッドを含む溶液の2.5 μ l を充填した。針の引っ張られた先端は最大限に7つの mm の長さである。(C) IT 注入手順の概略表現。(D) IT 注入手順の写真。この図は、備瀬 et al.²⁴から修正されている。パネル C および D の数字は、手順の同じステップに対応する: (1) 魚を加湿されたスポンジの上に腹部側に置かれる。穿刺部位 (三角形の赤い点) は、鰓付近の胸部の中央に位置する。(2) 心膜への針の浸透。赤い点は穿刺部位を示す。(3) 注射は、心膜腔内の赤色溶液の広がりを観察することによってモニターされる。(E) IT 注入のスキーム。注入毛細管と体軸の間の角度は、心臓穿刺を避けるために30°と45°の間でなければなりません。(F) 示された容積のそれの注入の後の1時間の魚の胸郭の写真。白い矢は redish 組織を指しており、これは内部出血を示すことがある。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: それは、心臓表面にほぼ均一に広がる溶液を注入した。(A) 2.5 μ l HBSS または2.5 μ l のインクで死後の IT 注入に供した魚の心臓全体の実体顕微鏡画像。前記心室 (V) の表面に染色されたインク、心房 (A) および bulbus 管 (Ba)。スケールバー = 300 μ m。 (B) 明るい視野と蛍光実体顕微鏡を施した魚類の全心の画像を HBSS で注入し、1μ g/mL DAPI の3μ l を用いた。DAPI は、注射後すぐに心臓部に蛍光を検出する。スケールバー = 300 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: 心臓に DAPI を送達するための2つの注入方法の比較。(A) 実験計画のスキーム。腹腔内 (IP) および Intrathorascic (それ) 注射は、同量の1μ g/mL DAPI (3 μ l) を用いて行った。心臓は注射後5および120分で収集された。(B) 筋線維を豊富に標識する蛍光ファロイジン (赤色) で染色された心臓切片の共焦点顕微鏡画像。DAPI を注入し、緑色で示された適切なチャネルで可視化した。IP 注入の後、DAPI は心臓において任意の時点で検出されない。それが注入された後、DAPI 陽性細胞が両時間点後に心室に存在する。スケールバー = 500 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: 心臓再生を研究するための注射。(A) 実験計画のスキーム。Cryoinjury の3と7日後に、DAPI とファロイジン AF649 の混合物を注入した (1 μ g/mL の3μ l)。心臓は、注射後1時間、固定、切片、ファロイジン AF568 (赤) で染色された。(B) 3 および 7 dpci における縦方向の心臓切片の共焦点顕微鏡画像。損傷した領域 (白色の破線で区切られた) とその無傷の心筋 (赤色染色) のラベルセルに DAPI (緑) およびファロイジン AF649 (青色) の標識細胞を注入した。白色矢印は、無傷のコンパクトおよび trabeculated myocardia および心外膜を介して DAPI (緑色) 分布を指している。スケールバー = 500 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5: 外因性のそれによって注入された CNTF は、心臓のいくつかの生物学的プロセスを刺激する。(A) 実験計画のスキーム。まず、250 CNTF のゼブラフィッシュまたはコントロール免疫グロブリン (hIgG) を含む溶液の2.5 μ l を、心筋細胞において核 DsRed2 を発現するトランスジェニック魚の心膜に注射した。心臓は、注射後7および1日目 (dpi) で収集され、免疫蛍光および in situ ハイブリダイゼーションによってそれぞれ分析した。(B 次元)コントロールの心室セクションの共焦点顕微鏡観察画像と CNTF を注入した心臓。(B) 細胞周期マーカーに対する免疫染色は、minichromosome 維持複合成分 5 (MCM5; 緑) において、外因性 CNTF に応答してより多くの増殖する心筋細胞を明らかにする。スケールバー = 500 μ m。 (C) コラーゲン xii に対する免疫染色は、CNTF 注射後の心筋におけるコラーゲン xii の沈着増加を示す。制御心臓では、コラーゲン XII は心外膜³⁴に限定される。スケールバー = 500 μ m。 (D) 免疫細胞マーカーに対する抗免疫染色は、L-PLASTIN、CNTF 注入魚における免疫細胞の増強された動員を検出する。スケールバー = 500 μ m。 (E) シスタチンに対するアンチセンス mRNA プローブを用いた in situ ハイブリダイゼーション後の心室断面の明視野顕微鏡像、心臓保護因子、心臓におけるこの遺伝子の転写アップレギュレーションを表示するCNTF の魚を注入した。スケールバー = 500 μ mこの図は、備瀬 et al.²⁴から修正されている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

ここでは、成人ゼブラフィッシュにおける心臓への影響を調べるために、外因性化合物およびタンパク質を心膜腔に送達する方法について説明する。手順は、臓器の近傍に溶液の少量の送達をもたらす胸腔内圧注射に基づいています。この技術は、心臓プレコンディショニングと再生を研究するために開発され、説明しました。

この手順の重要なステップは、ガラス毛細管が胸腔に浸透することです。このステップは次の3つのパラメータに依存します: 毛管先端の剛性および鋭さ、浸透の角度、および穿刺の場所。皮膚を通して浸透を最適化するために、毛細血管の引っ張られた部分は、針があまりにも柔軟で、皮膚と接触するように曲がるので、長すぎるべきではありません。これを回避するために、剛性は iridectomy はさみでチップのサイズを小さくすることによって適合させることができます。浸透の角度は30°と45°の間で変えることができるが、先端の剛性率に合わせることができる。確かに、薄い先端はより狭い角度で皮膚に浸透します。

針の浸透を最大限に活用するためには、挿入の場所は心臓の鼓動のすぐ上にあるべきである。心臓穿刺のリスクは、通常、5% と 8% の間で範囲が低くなります。心臓への針の後部の挿入は、強化された出血によって見られるように、心臓穿刺のリスクを増加させる。このような場合、動物は実験から除去されるべきである。

IT 注入の間のトラブルの別の原因は毛管レベルで起こる。実際に毛管は側面力がそれに加えられるとき壊れることができる。これを回避するには、針がまっすぐな方法で射出軸に沿って移動する必要があります。時折、毛管は液体が流れることを防ぐティッシュの残余によって妨げられることができる。針は注入の間に先端を穏やかに引き出すことによってブロックを解除することができる。これによって流量が改善されない場合は、胸郭から針を完全に取り出し、針を交換することをお勧めします。

病変は、心膜にあまりにも深く挿入された針によって引き起こされることができます。心膜嚢の病変を避けるために、針は胸部にあまりにも多く (1 − 2 mm) 挿入してはならない。注入量が8μ l より大きかった場合、いくつかの漏れが観察された。

ゼブラフィッシュにおいて、心膜液の正確な組成は不明である。しかし、心膜腔の体積は〜10μ l³¹で推定される。成人ゼブラフィッシュ心室の容積がおよそ1− 2 mm³であることを考えると、心膜腔はそれに従って注射前に考慮されなければならない微小体積を有すると仮定する。我々の予備調査から、注入された体積の最適範囲は、魚の測定2.5 −2.8 センチメートル (鼻から尾花梗までの距離) に対して、0.5 と3μ l の間であると判断しました。このボリュームは、魚の大きさに応じて調整することができます。最大5μ l の注入は、このサイズの魚に病変を誘導しなかった。しかし、図 1fに示すように8μ l からの体積が膨出及び内出血を引き起こすのに十分であった。このデータに基づいて、3μ l より大きい溶液の量は、器官に物理的および生理的ストレスを引き起こす可能性があると推定している。この制限は、注入された溶液の量を増加させるのではなく、より高い濃度の分子を選択する必要性を推測する。

もう一つの重要な要因は、注入された溶液の浸透性特性であり、これは生理学的範囲にあるべきである。確かに、浸透圧ストレスのリスクを回避するために、我々は、注射媒体として HBSS をお勧めします。

ゼブラフィッシュでは、薬物を送達するために使用される一般的な方法は、水処理および腹腔内注射^30,35を介してある。これらの技術の両方は、多くのアプリケーションに適していますが、, それは、望ましくない全身性副作用のリスクを減少させ、コストのかかる分子の使用量を削減することによって、実験と経済的な利点を提供します, それぞれ.この方法は、タモキシフェンの送達に適しており、細胞系譜トレース分析に使用される Cre ERT2 トランスジェニックシステムを活性化し、再生研究のための機能研究のために改変 Rna を誘導することができます。

ゼブラフィッシュにおける IT 注入法については、既に^31,36に記載されている。これらの報告では、胸腔内圧注射をインスリン針で行い、前側から穿刺した。それに対して、私達の議定書は後部の方向から挿入される引っ張られたガラス毛管との代わりとなる作戦を提供する。具体的には、私たちのアプローチは、心臓穿刺のリスクを低減して注射を最適化するために、魚の心膜の解剖学を考慮しています。さらに、手順の間、魚は金属製の鉗子によって保持されていないが、湿った、柔らかいスポンジによって、魚の外的損傷を避けるためにより適した方法である。したがって、提示された方法は、成人のゼブラフィッシュにおける心臓の恒常性、プレコンディショニングおよび再生の研究により適している可能性がある。

それは、哺乳動物モデル生物において既に確立されている。実際、この方法は、ブタとの実験およびヒト^37、38における臨床試験にも適用されている。マウスでは、超音波によって導かれる transthoracic 心筋注射は、彼らの心臓³⁹に挑戦するために使用されてきた。本稿では、ゼブラフィッシュに対する IT インジェクションの使用を容易にする詳細なプロトコルを提案する。これは、心臓の恒常性、プレコンディショニングおよび再生研究における遺伝的アプローチを補完するために、フィールドに特に有用であろう。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco by Life technology	14065-056
Iridectomy scissor	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5602
Macroscope (binocular)	M400		with Apozoom
Micro-injector femtojet	Eppendorf	5247 0034 77
Microloaders femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette glass needles type C	WPI	TW100F-6	thin-wall capillary
Micropipette puller model P-87	Flaming/Brown	20081016	filament box 2.5 mm x 4.5 mm
Sponge	any	any	dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm
Tricaine (Anestethic)	Sigma	E10521
Dyes and Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-Chicken Cy5	Jackson ImmunoResearch Laboratories		Concentration: 1/500
anti-Guinea pig Cy5	Jackson ImmunoResearch Laboratories		Concentration: 1/500
anti-Rabbit Cy5	Jackson ImmunoResearch Laboratories		Concentration: 1/500
Chicken l-plastin	gift from P. Martin, Bristol		Concentration: 1/1,000
DAPI	Sigma	10236276001	Concentration: 1/2,000 (1µg/ml); 1/100 IT injected
Guinea pig anti-ColXII	gift from Florence Ruggerio, Lyon		Concentration: 1/500
Phalloidin-Atto-565 (F-actin)	Sigma	94072	Concentration: 1/500
Phalloidin-Atto-647 (F-actin)	Sigma	95906	Concentration: 1/50 IT injected
Rabbit anti-MCM5	gift from Soojin Ryu, Heidelberg		Concentration: 1/500
Stamping Ink 4K	Pelikan	1 4k 351 197	Concentration: 1/1
ISH probe primers
Cystatin			gene number: ENSDARG00000074425 fw primer: GATTCACTGTCGGGTTTGGG Rev primer: ATTGGGTCCATGGTGACCTC