Summary
ここでは、クリケットの卵を注入するプロトコルを提示します, を含むが、これらに限定されないクリケットの多くの実験で基礎的な方法として機能する技術, RNA干渉とゲノム操作.
Abstract
発達中の生物の遺伝子機能を変えることは、さまざまな種類の実験の中心である。従来のモデルシステムでは非常に強力な遺伝子ツールが開発されていますが、他のほとんどの生物では遺伝子やメッセンジャーRNA(mRNA)を操作することは困難です。同時に、進化的および比較的アプローチは、多くの異なる種における遺伝子機能の探索に依存しており、現在遺伝的に扱いやすい外で発現を操作する技術の開発と適応を必要とする。種。このプロトコルは、胚または幼虫の発達に対する所定の操作の影響をアッセイするために、クリケットの卵に試薬を注入する方法について説明する。卵を採取し、ベベラ針で注入する方法について説明する。この比較的簡単な技術は、他の昆虫に柔軟で適応可能です。1回の実験で数十個の卵を集めて注入することができ、バッファーのみの注射の生存率は練習で改善し、80%も高くなる可能性があります。この技術は、薬理学的薬剤の注射、目的の遺伝子を発現するインビトロキャップmRNA、RNA干渉を達成するための二本鎖RNA(dsRNA)、クラスター化を定期的に使用するなど、いくつかのタイプの実験的アプローチをサポートします。CRISPR関連タンパク質9(Cas9)と組み合わせて間隔をあけた短いパリンドロミックリピート(CRISPR)とゲノム修飾のための試薬、および転移可能な要素を使用して、過渡性または安定なトランスジェニックラインを生成します。
Introduction
生物におけるゲノムを改変したり、遺伝子発現に影響を与える能力は、機能的因果関係をテストする多くのタイプの実験の設計の基礎である。また、ゲノムおよび非ゲノム修飾技術が、従来の遺伝的実験動物モデルシステム(例えば、ムスマス、ダニオ)以外の生物で利用できる、比較および進化的に関連する研究にとっても重要である。 レリオ、ショウジョウバエメラノガスター、カエノラブディス症エレガンス)。組織の多様性1を理解する願望であろうと、クローの原理に対する自分の遵守であろうと、すべての生物学的疑問に対して、その解決策2、3、ゲノムを改変する能力に最も適した生物があること、または遺伝子発現に影響を与えるのは、現代の実験計画に不可欠である。
クリケットのグリルス・ビマキュラトゥスは、新しいモデルシステムです。神経学実験4で最後の世紀に使用され、過去20年間は、特にこの生物の進化と発達に焦点を当てたクリケットへの実験的関心の増加を目撃しています5.クリケットは、D.メラノガスターやトリボリウムカスタネウム6などのよく研究されたホロ代謝昆虫に基流域に分岐するヘミメタボラス昆虫です。進化の木に有用な位置のために、科学者は、G.ビマクラトゥスでの使用のための分子ツールを適応させることに関心が高まっているこの昆虫で近代的で洗練された実験的な質問に興味を持っています。
クリケットの卵への分子試薬の注入は、胚における遺伝子発現の非ゲノム操作と同様にゲノム修飾実験に使用することができる。例えば、eGFP挿入物を運ぶトランスジェニックG.ビマクラタスは、トランスポザーゼピギーバク7、8を用いて作成されている。研究者は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)および転写活性化剤(TAL)エフェクターヌクレアーゼ(TALENs)を用いてノックアウトG.バイマキュラトゥスを作成し、特定のゲノム領域9に二本鎖破断を導入することに成功した。ZFNとTALENは、大きな4つのモデルシステムを超えて動物のサイト固有のターゲティングを可能にしますが、これらの試薬は、使いやすく、より効率的で、柔軟性の高い10のCRISPR/Cas9システムによって急速に上回っています。CRISPRはG.バイマクラトゥスでノックアウト11とノックインライン12、13ゲノム修飾に加えて、dsRNAを卵に注入してmRNA発現をノックダウンするために使用されています。胚は、研究者が開発14、15を通じて特定の転写物の役割を理解することを可能にする。クリケットの卵を注入する方法に関するいくつかの限られた詳細は、以前に12が公開されています.
ここでは、早期G.ビマクラトゥス卵を注入するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、様々な実験室の設定、注射材料、およびおそらく他の昆虫に効果的かつ容易に適応可能です。ゲノム修飾およびノックダウン実験の設計と実装に関する追加の詳細は、他の場所で12、13に公開されていますが、これらのアプローチは最終的にここで説明する注入プロトコルに依存します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ハードウェアのセットアップと材料の準備
注:ソリューション、試薬、および機器の詳細の準備については、表1および材料表を参照してください。
- 卵を見て注射針を導くために解剖顕微鏡を設置します。(図1Aは、蛍光を備えた解剖顕微鏡を示す。蛍光能力は有利であるが、必要ではない。
- 3軸マイクロマニピュレータを配置して、注射針を所定の位置に操縦します(図1A)。
- チューブ付きのマイクロインジェクターと針ホルダーを設置し、少量の材料を注入する(図1A)。必要に応じて、図に示されていないフットペダルを使用します。
- 3Dプリンターまたはレーザー彫刻機で目的のパターンの逆を印刷して、卵の井戸を作成するスタンプを作成します(図1C)。
注:示されている3Dプリントサンプルスタンプは、個々の井戸を作成するための4.5 cm x 5 cmと128、3 cm x 1 cm x 1 mmの突起です。様々なカスタマイズ可能な金型を作る方法の詳細は、他の場所で公開されています16. - 10xインジェクションバッファー、HEPES緩衝生理食生(HBS)、およびテトラメチルロダミンデキストラン色素のストック溶液を調作し、4°Cで保存する。
- dsRNA、CRISPR/Cas912、転移可能元素、インビトロキャップmRNA 7、8、薬理学薬剤17、ZFN、またはTALENS9などの注入される実験溶液を調調す。
- ガラススライドの上に1mmほどのプラットフォームを作成するために、標準的なラボテープのいくつかの層にダブルスティックテープを置き、評価のために針を保持するために使用されます。
- 空気循環のためのメッシュで覆われた開口部を持つ蓋とサイズ約40 cm x 60 cmのクリケット容器を準備します。
- 食料、水、避難所の材料を追加します。
- 数ダースの健康な男性と女性の大人のコオロギを追加します。翼の存在によって大人のクリケットを識別します。
注:ポスト想像上の年齢の範囲は、卵の収量を増加させる可能性があります。実験のために十分な卵を集めることができるように、コオロギの密度は比較的高くあるべきであるが、カニバリズムが起こるほど混雑していない。例えば、約2ダースの健康なコオロギは、男性と女性の比率がほぼ等しい場合、上記の大きさの容器で、1〜2時間の期間に約200個の卵を集めるのに十分である。コオロギは室温で保つことができますが、コオロギが暖かい(23.5~26°C)、湿度(40~60%相対湿度)のインキュベーターで維持される場合、開発と行動が最適です。
2. 注射用針の製造
- フィラメントでボロシリケートガラスキャピラリーを使用してください(サイズの詳細については、材料の表を参照してください)。注射が完了する前に、同じ日に、または数日までプル針を準備します。
- 毛細血管ガラスを引き出しに入れ、フィラメントの上にガラスを中央に置き、ノブを締めて所定の位置にガラスを固定します。
- ガラスランプ温度(-5 °C~+10°C)の近くに引き出し機温度を設定します。
- 単一ステップの高熱プロトコルを使用して、小さな開口部で長いテーパを引っ張りますが、両端を閉じないようにします。
注:例えば、ボックスフィラメントを装備した材料の表に詳述されているマイクロピペットプーラーを使用する場合は、ランプ温度が478:ヒート478のガラスに次のパラメータを使用します。プル 45;ベル 75;デル120。図2Bに示す形状を持つ針を製造するための最適な条件は、各ユーザによって経験的に決定されるべきである。 - 注射の準備のための斜めの針の先端。
- ベバラー(図2A)の紡糸粉砕機面を滴下水で濡らします。逆浸透(RO)またはジエチルピロ炭酸塩(DEPC)処理蒸留水のいずれかを使用してください。
- 引っ張られた針をベブラーに入れ、20°の角度に変える。
- それはちょうど粉砕面に触れるまで針を下げ、2~3分間ベベル。
- ガラス顕微鏡スライドに付着したダブルスティックテープに斜めの針を置くことによって斜めを評価する。
- カメラと画像取得ソフトウェアを搭載した複合顕微鏡のステージに針を持つスライドを置きます。
- 20倍の目的を使用して針先の画像を取得します。
- イメージングソフトウェアを使用して、針の内内側の内膜の直径をベベル開口部に近い値で測定します(図2C)。最適サイズは10 μm + 2 μmです。
- 8 μm以下、12μm以上の開口部を持つ針を廃棄します。
- ほこりを避けるために、蓋付きの容器に針を保管してください。先端を壊すことを防ぐために、ワックスまたは類似の材料のストリップを使用して、容器の底から針を上げます。
3. 卵の採取と準備
- 卵を収集しようとする前に、一晩または少なくとも8〜10時間の任意の湿った敷設材料(水バイアル、卵料理)のコオロギを奪うことによって産卵の数を最大化します。
注:女性は内部的に精子を保存する能力を持っているので、慎重にタイミングを合った受精が実験的に不可欠である場合、異なるタイミングの手順が必要な場合があります18. - 水に1%アガロースの40 mLを作り、10センチのペトリ皿に注ぎます。
- アガロースの表面に卵ウェルスタンプを置き、固化させます。
- スタンプを取り外し、アガロースが固まったら、井戸を明らかにする(図1C)。
- 1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むHBSでアガロースウェルプレートを埋めます。
- 皿の上に蓋を置き、パラフィルムで包み、4°Cに保存します。
注:料理は4°Cで数日間保存することができますが、結露を避けるために使用する前に室温まで温める必要があります。 - 35mmのペトリ皿に白い遊び場の砂を入れ、コオロギが卵を産む卵のコレクション皿を作ります(図1B)。
注:材料表に指定された砂は、適切な粒径です。砂粒が大きすぎると、砂が卵にダメージを与えます。 - 卵皿を約18cm×18cmのペーパータオルで覆い、皿の上に砂を置きます。このペーパータオルを通して、満たされた皿を水道水で覆います。
- ペトリ皿を傾け、余分な水を除去するために上を静かに絞ります。
- 皿の下にペーパータオルの正方形の角をタックし、反転した蓋に卵皿を置くと、ペーパータオルカバーを所定の位置に保つのに役立ちます。
- 卵皿をクリケットのビンに入れ、成虫の雌が卵を1~2時間卵子に入れるようにします。
注:ここで比較的短い時間は、すべての卵が注射時の発達の段階で類似していることを保証します。細胞化前の注射が重要な場合、注射は卵産卵19の14時間以内に起こるべきである。 - 一方、アガロース皿(ステップ3.6から)は、注射用の卵を保持する準備として室温に暖めます。
- 卵の採取皿を取り出し、作りたての卵をクリケットのビンから取り出し、ペーパータオルカバーを取り外します。少なくとも500 mL容量のビーカーの上に0.5-1 mmの細孔サイズのストレーナーを置きます(図1B)。
- 卵を産む皿(砂と卵)の内容物を、砂粒がストレーナーメッシュを通して下のビーカーの水に落ちるように、ストレーナーの下のストレーナーの下に落ちるように、ストレーナーの下のストレーナーの卵をストレーナーバスケットに残して、ストレーナーの下にストレーナーの中に入れます。
- 容器にRO水を入れ、トレイに入れます。容器の上にストレーナーを反転し、水に卵を取り除くために皿に対してそれをタップします。卵は容器の底に沈む。
- P1000ピペット先端をはさみで切り、直径約3mmの開口部を作ります。P1000ピペットにこの先端を置き、できるだけ少ない水を転送し、コンテナからアガローズ卵型皿に卵を転送するためにそれを使用します。
- プラスチックピンセットを使用して、HBSプラス1%ペニシリン/ストレプトマイシンで満たされたアガローズ井戸に卵を並べます。各卵は、個々の井戸の底に沈みます。注入する準備ができるまで、ペトリ皿の蓋で覆います。
4. マイクロインジェクターの準備
- マイクロインジェクタを圧縮空気またはガス源に取り付けます(このプロトコルは圧縮空気またはN2のいずれかを使用して最適化されました)。
注:ポータブルエアタンクを使用する場合は、少なくとも75 psiに充填してください。タンクは、注射中に空気圧を失い、補充する必要があります。注射は40psi以下に困難になります。 - マイクロインジェクターの電源を入れます。射出時間を 0.17 s に設定し、圧力を 10 ~ 15 psi に設定します。
注:必要な正確な圧力は針の開口部に依存し、使用される注射および/または新しい針のあらゆるラウンドのために経験的に決定されなければならない。 - マイクロインジェクターのBALANCEノブが0(通常は反時計回り)に変わり、マイクロインジェクタが加圧され、射出モードになっていることを確認します。
5. 注射
- 1 mLシリンジと0.45 μmのシリンジフィルターを使用して、10x注入バッファーの約500 μLをフィルタリングします。
- 混合注射試薬(以下の詳細は、12に記載されているように調製されたdsRNAの注射用である)。
注:特にこのテクニックを最初に学習する場合は、いくつかのコントロールを設計して実行することをお勧めします。注入せずに卵を突き出す、バッファー+色素を単独で注入する、またはバッファー+色素+制御試薬(eGFP dsRNAなど)を注入することは、注入プロトコルの様々な要素がどれほど破壊的であるかの良好なテストである。さまざまなコントロールの生存率については、図 3を参照してください。 - 4 mL dsRNA アリコートから始めます。
- 濾過された10x注入バッファーの0.5 mLをdsRNAアリコートに追加します。
- 50 mg/mL テトラメチルローダミンデキストラントレンストック溶液の0.5 mLを追加します。蛍光なしで解剖スコープに取り組む場合は、代わりにフェノールレッドを使用してください。
- 射出期間中、すべての材料を氷の上に保管してください。
- 20 mLローディングチップとp10ピペを使用して注射針に注入液をロードします。
- 1.5 mLの注入液を引き出し、注入針の広い端にローディングチップを挿入します。
- 可能な限り針に溶液を排出し、穏やかにフリックすることにより、気泡を排除します。針を折らないのは気をつけなさい。
- 解剖顕微鏡の下に卵の皿を置き、約10倍の低倍率(1倍の目の目的を通して見た1倍の倍率)を選択します。
- 注射ハウジングに針を挿入し、締めます。
注:針が適切かつしっかりとハウジングに挿入されていることを注意してください。これを行うには、針の広い端を金属ハウジングから引き出し、シリコンチューブをハウジングに持ち込みます。針のガラス端がシリコンのすぐ向こうに突き出るようにシリコンチューブを調整します。これを行わない場合、シリコンチューブは、ガラスと金属ハウジングの間に挟まれ、針の端を塞ぐことがあります。 - マイクロマニピュレータに付属の針で注入ハウジングを慎重に挿入します。針の鋭い端に注意し、それが表面にぶつかって壊れていないことに注意してください。
- 顕微鏡で卵と針の両方を見ながら、皿グリッドの左上隅にある卵の近くに針を動かします。
- 先端がHBSプラス1%ペニシリン/ストレプトマイシン緩衝液に入るまで針を下げます。
- 視野に針を中央に入れ、卵皿を動かして、針が卵よりも皿の端に数mm近くあるようにします。
- 針で卵のグリッドのビューを妨害しないでください。
- ローダミンに適したフィルターに顕微鏡をセットし、針の蛍光を観察し、針の先端に焦点を合わせることができます。
- マイクロインジェクターで、注入液が針からサスペンション溶液に漏れ始めるまで、バランスノブを時計回りにゆっくりと回します。マイクロインジェクターの画面上の残高数は増加し始めますが、数値は重要ではありません。次に、染料が針から漏れ出すのを止めるまで、ノブを反時計回りに少し回します。
注:新しい針を使用するたびに、このバランスを設定することが重要です。バランスが適切に設定されていない場合、マイクロインジェクターは、注射がトリガされた後しばらくの間注入を続けます。不均衡な針が付いている注入ボタンの単一の押し押しは荷を積まれた針の内容全体の追放をもたらす可能性さえある。 - 視野を中心に針を動かして、最初に注入する卵を狙った卵皿を動かします。注射は、配置された卵のグリッドの一角(例えば左上隅)から開始することをお勧めします。
- 倍率を約50倍に調整します。この倍率では、単一の卵が視野のほとんどを埋めます。
- マイクロマニピュレータと卵皿の手の両方を使用して、注射用の位置に針を動かします。
- マイクロマニピュレータを使用して針を進め、注入する最初の卵に針の先端を挿入します。
- 卵の後部(鈍い)端(図1E)から卵の長さ20〜30%の卵の長さで針を挿入し、卵の長い軸に垂直にします。
- マイクロインジェクターの注入フィートペダルまたは注入ボタンで溶液を注入する。卵の中の蛍光材料の小さなボーラスは、注射が成功したことを示します(図1D)。
注:注射中に卵黄が卵から排出されることは珍しくありません(図1F)。 - 卵から針を引き込む。針の引き込み時に卵が意図せず井戸から持ち上げられた場合は、小さな鉗子を使用して、針を引き込みながら卵を井戸に押し戻します。
- 注射中に針が詰まった場合は、卵から針を取り出し、HBSプラス1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液に浸した針を保ち、クリア機能を使用するか、注入を押すことによって詰まった針をクリアします。ボタン。
- 同じ針を使用し続け、できるだけ多くの卵の注射手順を繰り返します。最初は、これは約20または30卵かもしれませんが、練習で100以上に増加します。
- 針が詰まってクリアできない場合は、針を捨て、新しい針を満たし、再び開始します(すなわち、ステップ5.7に戻ります)。
- 注入された卵の皿を、胚が分析のために開発の所望の段階に達するまで、わずかに湿気のある(蒸発を最小限に抑えるために)暖かいインキュベーター(23.5〜26°C)に保存します。
- 少なくとも24時間ごとに、もはや生存不可能な卵を取り除き(図3A、B)、懸濁液を新鮮なHBSプラス1%ペニシリン/ストレプトマイシンに置き換えます。
- 注射後2~3日後に、穏やかなピペッティングまたはプラスチック鉗子で卵をHBSプラス1%ペニシリン/ストレプトマイシンで湿らせてペーパータオルに移し、暖かく湿ったインキュベーターで開発を続けます。
- 卵を監視し、毎日実行可能でなくなった卵を取り除きます(図3A,B)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
コオロギは湿った材料に卵を容易に産み、湿った砂や汚れなどの適切な材料を提供し、大量の卵を産むよう誘導します。これは、コオロギが最初に8-10 hのために卵を産む材料を奪われた場合に特に効果的です。解剖顕微鏡、マイクロインジェクター、マイクロマニピュレータ(図1A)を用いて、様々な材料で個々の卵を注入することができる(図1D)。卵は後端付近に注入され、前軸に沿って約20〜30%の点で注入される(図1E)。これらの違いはしばしば微妙である(図1E)ので、より鈍い後端からより尖った前端を区別することは困難な場合があります。卵を左右に転がすのは、どちらがどちらの端かを明らかにするのに役立ちます。注射針を取り出した後、卵黄が排出されることがある(図1F)が、これは内部の発達胚の健康を損なうものではないようだ。
このプロトコルの最も重要なステップの1つは、ベベロード針の準備です。長く、細い針を引っ張った後、それらは20°の角度に斜めされ、10μm(±2 μm)の開始直径を持たなければならない。直径が大きすぎると、注射液が針から漏れ出し、これらの針は卵に大きな穴を作り、生存率を低下させる。針が狭いと生存率が上がりますが、狭すぎると目詰まりが起きやすくなり、注射が遅くなりイライラします。針径が10μm±2μmの場合、針詰まりなしで1本の針で100個以上の卵を注入することが可能です。
針はマイクログラインダーまたはベベラーによってベウラとすることができる(図2A)。これらの装置は顕微鏡を取り付け、または顕微鏡を含まないモデルのための独立した立場の解剖の範囲を加えることができる。小さなマイクロマニピュレータは、所望の角度に傾け、滴下水で湿らせる回転粉砕面の表面に下げることができる針を保持します。引っ張られたが、斜めにされていない針の例を図2Bに見ることができ、図2Cに20°ベベルを持つ針を示す。針は損傷を避け、清潔に保つために安全に保管する必要があります(図2D)。
マイクロインジェクターにバランスと注入圧力を適切に設定すると、同じ針で注入された各卵に同等の量の材料を注入できるようにする必要があります。異なる直径の針に変更する場合は、注入とバランス圧力の最適化が必要になります。この最適化は、射出パルスの一貫性を最大化します。
生存率は、これらの実験の成功を評価するための重要なパラメータの1つです。ほとんどの死んだ卵は、卵の中の黄身と胚組織が不均一に凝集し始め、最終的には卵の大部分が卵の片側に移動します(図3B)。4~6日後(ステージ8~15に相当)19日後に評価した場合、実験試薬を注入した卵は一般に生存率が低い一方で、未注入卵の85%以上が生存した(図3C)。注射自体のあらゆる側面(針穿刺、色素およびバッファーの導入、または車両またはdsRNAの存在を含む)の制御は、試みられた実験操作の真の効果を理解するために必要とされる(図)3C)実験操作によっては、より高いレベルの致死性が予想され、操作の非致命的な影響を評価するためにアッセイのタイミングまたは注射のタイミングを変更する必要がある場合があります。
注射の見せ薬の結果を評価する方法は、注入されたものに依存します。例えば、特定のmRNAノックダウンの結果としての表現術の変化は、総解剖学レベルで明らかであり得る。例えば、ゼステの遺伝子エンハンサー(E(z))は、通常、ウルトラビトラックス(Ubx)を含むホックス遺伝子を抑制する。E(z)にdsRNAを注入することで、E(z)関数がノックダウンされ、Ubx抑制が放出され、子宮外性Ubx発現が生じる。これは、それらのセグメント20におけるUbxの抑圧のために、5組の腹部付属品(アンテナ、マキシラ、ラビウム、T1およびT2脚)をT3脚のような付属品に変換する。第2の例では、GFP式を使用してトランスジーンの正常な挿入をアッセイすることができる。例えば、G.ビマキュラタスアクチンプロモーターの制御下でeGFPタグ付きヒストン2B遺伝子をコードするcDNAをピギーバクトランスポザーゼを用いてクリケットゲノムに挿入すると、各核を可視化することが可能となった。蛍光を用いて卵中にeGFPタグ付きHis2Bタンパク質を励起する(図4C,D)。この場合、時間7の間に核の動きを監視することが可能であった。
| ソリューションの名前 | コンポーネント | コメント/説明 |
| 10xインジェクションバッファソリューション | 1 L H2O 追加: 0.8 g NaCl, 0.09 g Na2HPO4,0.04 g KH2PO4,2.98 g KCl | 在庫を4°Cに保存します。0.45 μmのシリンジフィルターを搭載した1 mLシリンジで使用直前に少量をろ過してください。必要に応じて繰り返し、約 500 μL の注入液をろ過します。実験中は、氷の上に濾過された注入液を保管してください。 |
| HEPES バッファリングされた生理生理生理生理 | 1 L H2O で、追加: 8.77 g NaCl, 5.2 g HEPES, | pH~7.0、4°Cで保存します。 |
| テトラメチルローダミンデキストラン(10,000MW)染料ストックソリューション | サーモフィッシャーのローダミン染料 | この染料は、しばしば凍結乾燥粉末として販売されています。この場合、水で50mg/mLのストック溶液を構成します。不溶性粒子を除去するために5分間12,000 x gで遠心分離機。遠心分離後に上清を回収し、チューブの底部の粒子状物質を避け、アリコートと-20°Cで凍結する。使用中のストックアリコートは、1〜2週間4°Cで保つことができます。凍結解凍アリコートを複数回避けてください。染料による針の詰まりがある場合は、Whatman#2フィルターペーパーを通して色素を濾過することもできます。 |
表 1: ソリューションのレシピとメモ。
図1:卵注入プロトコルの概要。(A) 卵注射に使用できる典型的なセットアップ。(B) 卵はふるいを通して砂から分離される。(C)卵は、カビを温かく液体アガロースに入れて作られた小さな井戸に注入するために保持されます。(D)針中および5個の注入された卵の蛍光は、蛍光解剖顕微鏡を通して見ることができる。(E) 注入されていない卵。前端(わずかに尖った、左)と後端(より鈍い、右)は互いに区別可能です。注射に最も適した領域は、後端付近に、ブラケットで示される。(F) 注射の2日後に卵を産む。注射部位はわずかに変色として見え、少量の黄身が明らかである(矢印)。スケールバー = 1 mm (D);0.5 mm (E および F)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:針はマイクログラインダーまたはベベラーを使用してベベラーされる。(A) RO水を滴下して湿らせる円形の紡糸粉砕面を持つマイクロ粉砕機の一例(画像上部に示すシリンジから水滴を滴下する)。(B) ベリングする前に、引っ張られた針は長くて狭いです。(C) 20°にベバリングした後、鋭い注射針が作成されます。内側の内膜の直径が 10 μm に上る点に注意してください。(赤いスケールバー = 10 μm)。(D)引っ張られ、ベバリード針は蓋付きのペトリ皿に貯え、歯科ワックスを使用して所定の位置に保持することができる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:注射は生存率を低下させることができる。(A) 死んだ卵と死んだ卵は目視検査で明らかである。(B) 時間が経つにつれて、材料は卵の片側に移動します。(C) 卵産卵後4~6日の生存率の比較:未注入卵(n=6実験)を含む様々な条件。卵は9 μmの針で穿刺されたが、注入されていない(n = 2実験);。バッファーと染料を注入した卵(n = 13実験);。バッファー、色素、プラスミドベクターを注入した卵(n = 2実験);バッファー、染料、および DMSO を注入した卵 (n = 11 実験);バッファー、染料、および制御dsRNAを注入した卵(n = 22実験)。使用されるコントロールdsRNAのタイプは、eGFPまたはdsRedに対してdsRNAを含んでいた。各バーのベースの数字は、各条件に使用される生存卵/総卵の総数を示しています。誤差余数は、平均値の標準誤差を表します。スケール バー = 1 mm (A および B) です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 射出結果の評価(A-B)ゼステのエンハンサー(E(z))dsRNAの注入は、Ubx mRNA((A)に示す野生型)の正常な発現を変化させ、アンテナ(AN)および口部(Mx,Lb)を脚のような付属物(B)に変換する。(C-D)移植可能な元素piggyBacとhistone2B-eGFPを用いた初期卵の注入は、すべての核でGFPを発現するトランスジェニック胚を産生する。核の位置は、産卵後8時間(C)、産卵後20時間(D)を観察することができる。省略形: An = アンテナ;Mx = マキシラ;Lb = ラビウム;T1-3 = 胸部脚 1 ~ 3;RNAi = RNA 干渉;Gb = G. ビマキュラトゥス;行為 = アクチン;H2B = ヒストンH2B;GFP = 緑色蛍光タンパク質。スケールバー = 200 μm (A および B)500 μm (E および F)これらの実験結果は、もともと7,20の他の場所で説明された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この技術の2つの主な課題は、最適な針のサイズと生存性の関連する問題です。小さい針は生存率を向上させるが、より狭い内気管を持つ針は、作業中の毛細血管力の程度が大きいため、黄身が針に移動して詰まらせる可能性が高くなる。最良の場合、閉塞は、単に別の卵を注入するか、または上記のように針をクリアすることによってクリアすることができます。また、卵黄が針から押し出されるまで、マイクロインジェクターのバランス圧力を高めようとします。この技術のもう一つの大きな課題は、生存性です。私たちの手の中で、実験液を注入した卵の生存率は、通常40~80%です。生存率は、この技術を学び始めた人のために10%と低くすることができますが、練習で改善されます。否定的な対照は、上記のように、様々な物質の導入が生存率を低下させることができることを考えると、研究者が実践を通して生存率の変化を正確に評価するために重要である(図3C)。
注射のタイミングは、各実験的アプローチにとっても重要な考慮事項です。古い卵は若い卵よりも注射が難しく、一般的に、古い卵よりも若い卵を注入すると生存率が高くなります。後の段階で針と注入された材料の導入は、意図しない解剖学的損傷につながることができます。しかし、経験を持つ2〜3日の古い卵の注入は可能です。これらの段階で卵の背側を標的にすることは、最初に腹部側に形成される胚を損傷するのを避けるのに役立ちます。後端を標的とすると、卵19、21のこの終わり付近で起こる第1の核分裂および胚芽バンド形成への試薬アクセスを増加させる可能性がある。ゲノムを操作しようとする場合、ゲノム修飾の広範な体細胞または生殖細胞伝達のいずれかを達成することを目的として、注射は、卵を産んだ後に約14時間始まる細胞化の前に行われるべきである19.mRNAレベルをノックダウンするためにdsRNAを注入する場合、注射のための時間枠は、開発の早い段階で関心のある遺伝子をノックダウンしたいかに基づいて決定されるべきである。RNAiの効果はしばらくの間持続する可能性が高いが、dsRNAは表現型の変化を評価する時間の前に導入する必要がある。注射中の経過時間と胚発生の進行を追跡することは、適切な段階の卵が注入されていることを確認するために重要な場合があります。どの材料が注入されるかにかかわらず、注入後の発達遅延は一般的であるが、遅延の程度は注射剤によって異なる場合がある。
ここで説明するプロトコルは、比較的高価な機器の数に依存しています。しかし、これらのアイテムの一部またはすべてを使用せずに卵を正常に注入することは可能であるべきです。例えば、市場には様々なマイクロインジェクターがあり、材料の表に示されているものよりも安価な製品もあります。注射器を使用して適切な量の材料を注入することも可能ですが、これはいくつかの練習が必要です。高価なマイクロマニピュレータの代わりに、針を安定して保持し、ゆっくりと制御された進歩を可能にするために様々な材料を使用することができ、単純なプラスチック製の設計は、他の22によって使用されています22。また、私たちの経験では適切なベベリングは注射の成功に大きな違いを作ることができますが、ベベラーの使用を避けることも可能です。最高級の砂紙を手で針で引きずり、顕微鏡でこのプロセスを評価することで、引っ張られた針を研ぐことが可能な場合があります。いずれにせよ、鋭利な針は注射を容易にし、生存率を改善する。
この注入の技術は適用範囲が広く、さまざまな操作に使用することができる。ここでは、dsRNAおよびpiggyBac依存性ゲノム修飾実験の結果を示しましたが、この技術ではCRISPR/Casまたは他のアプローチを用いることも可能です。ここに含まれる実験では、結果として生じる型型は明白で評価が容易であった。一部の実験では、実験操作の効果を確認するために、免疫組織化学またはその他の視覚化ツールを使用する必要があります。注射に代わる1つの選択肢は、生体内の細胞や組織にDNAまたは他の高分子を導入するために使用することができるエレクトロポレーションの使用です。エレクトロポレーションは、特定の領域8を標的にするために胚が既に形成されている古いクリケットの卵で使用することができますが、実験が開発中の胚全体が標的にされる必要がある場合、注射はより有用です。この注射技術はまた、様々な異なる片代謝およびホロメタボリュース昆虫からの卵の使用に容易に適応可能であるべきであり、理想的には有意義な比較研究を行う能力を向上させる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
本プロジェクトで報告された研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所の機関開発賞(IDeA)の助成番号P20GM10342からHH3、NSF賞番号IOS-1257217の支援を受けました。Cge。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
