Summary
Hier presenteren we een protocol om Cricket eieren te injecteren, een techniek die als basismethode dient in vele experimenten in de cricket, inclusief, maar niet beperkt tot, RNA-interferentie en genomische manipulatie.
Abstract
Het veranderen van de genfunctie in een zich ontwikkelende organisme staat centraal in verschillende soorten experimenten. Terwijl enorm krachtige genetische hulpmiddelen zijn ontwikkeld in traditionele modelsystemen, is het moeilijk om genen of boodschapper RNA (mRNA) in de meeste andere organismen te manipuleren. Tegelijkertijd zijn evolutionaire en vergelijkende benaderingen gebaseerd op een verkenning van de genfunctie in veel verschillende soorten, waardoor de ontwikkeling en aanpassing van technieken voor het manipuleren van expressie buiten de huidige genetisch Tractable Soort(en). Dit protocol beschrijft een methode voor het injecteren van reagentia in Cricket-eieren om de effecten van een bepaalde manipulatie op embryonale of larvale ontwikkeling te testen. Instructies voor het verzamelen en injecteren van eieren met afgeschuurd naalden worden beschreven. Deze relatief ongecompliceerde techniek is flexibel en mogelijk aanpasbaar aan andere insecten. Men kan verzamelen en injecteren van tientallen eieren in een enkel experiment, en de overlevingskansen voor buffer-only injecties verbeteren met de praktijk en kan zo hoog zijn als 80%. Deze techniek zal verschillende soorten experimentele benaderingen ondersteunen, waaronder injectie van farmacologische agentia, in vitro afgetopte mRNA om genen van belang te uiten, dubbel-streng RNA (dsRNA) om RNA-interferentie te bereiken, het gebruik van geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen (CRISPR) in overleg met CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) reagentia voor genomische modificatie, en transposeer bare elementen om voorbijgaande of stabiele transgene lijnen te genereren.
Introduction
Het vermogen om het genoom te wijzigen of de genexpressie in organismen te beïnvloeden is de basis voor het ontwerp van vele soorten experimenten die functionele causaliteit testen. Het is ook van cruciaal belang voor het vergelijkende en evolutionair relevante werk dat genomische en niet-genomische wijzigings technieken beschikbaar zijn in organismen buiten traditionele genetische laboratorium systemen voor diermodellen (bijv. Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogasteren Caenorhabditis elegans). Of het nu gaat om het verlangen om de organisatorische diversiteit1 of iemands naleving van het principe van Krogh te begrijpen, dat er voor elke biologische vraag een organisme is dat het meest geschikt is voor zijn oplossing2,3, de mogelijkheid om genomen te wijzigen of invloed van de genexpressie is essentieel voor moderne experimentele ontwerpen.
De cricket gryllus krekel is een opkomend modelsysteem. Gebruikt voor de vorige eeuw in neuroethologie experimenten4, de laatste twee decennia zijn getuige geweest van een toegenomen experimentele interesse in de cricket, met name gericht op de evolutie en ontwikkeling van dit organisme5. De Cricket is een hemimetabolous insect dat basaal vertakt tot goed bestudeerde holometaboleuze insecten, zoals D. melanogaster en Tribolium castaneum6. Door zijn nuttige positie op de evolutionaire boom, zijn wetenschappers geïnteresseerd in het vragen van moderne, verfijnde experimentele vragen in dit insect, dat heeft geleid tot een groeiende interesse in het aanpassen van moleculaire gereedschappen voor het gebruik in G. krekel.
Injecties van moleculaire reagentia in Cricket eieren kunnen worden gebruikt voor genomische modificatie-experimenten en niet-genomische manipulaties van genexpressie in embryo's. Transgene G. krekel met EGFP-inserties is bijvoorbeeld gemaakt met behulp van de transposase piggybac7,8. Onderzoekers hebben met succes Knockout G. krekel gemaakt met behulp van zink-vinger nucleasen (zfns) en transcriptie Activator-achtige (tal) Effector nucleasen (Talens) om dubbel-gestrande pauzes in specifieke genomische regio's te introduceren9. Hoewel ZFNs en TALENs locatiespecifieke targeting mogelijk maken bij dieren buiten de grote vier modelsystemen, zijn deze reagentia snel overtroffen door het CRISPR/Cas9-systeem, dat eenvoudiger te gebruiken, efficiënter en zeer flexibel is10. Crispr is gebruikt in G. krekel voor de productie van Knock-out 11 evenals knock-in lijnen12,13 naast de genomische modificatie, kan dsRNA in eieren worden geïnjecteerd om mRNA-expressie op te nemen in het ontwikkelen embryo's, waardoor onderzoekers de rol van specifieke transcripten in de ontwikkeling14,15kunnen begrijpen. Enkele beperkte Details over het injecteren van Cricket eieren zijn eerder gepubliceerd12.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het injecteren van vroege G. krekel -eieren. Dit protocol is effectief en gemakkelijk aanpasbaar aan verschillende laboratorium instellingen, injectiematerialen en mogelijk aan andere insecten. Hoewel aanvullende Details voor het ontwerpen en implementeren van genomische modificatie en knockdown-experimenten elders zijn gepubliceerd12,13, zullen deze benaderingen uiteindelijk afhankelijk zijn van het injectie protocol dat hier wordt beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hardware instellen en voorbereiden van materialen
Opmerking: Zie tabel 1 en tabel met materialen voor de bereiding van oplossingen, reagens en apparatuurgegevens.
- Stel een ontleed Microscoop in om eieren te zien en de injectienaald te geleideren. (Figuur 1a toont een ontleed Microscoop uitgerust met fluorescentie.) Fluorescentie vermogen is voordelig maar niet noodzakelijk.
- Plaats een 3-assige micro manipulator om de injectienaald op zijn plaats te manoeuvreren (Figuur 1a).
- Stel een micro injector met slang en een naald houder in om kleine hoeveelheden materiaal te injecteren (Figuur 1a). Gebruik desgewenst een voetpedaal dat niet in de afbeelding wordt weergegeven.
- Ontwerp en maak een stempel om putten te maken voor eieren (figuur 1c) door de inverse van het gewenste patroon af te drukken, hetzij met een 3D-printer of een laser graveur.
Opmerking: De getoonde 3D gedrukte voorbeeld stempel is 4,5 cm x 5 cm met 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm uitsteeksels voor het maken van individuele putten. Meer informatie over het maken van een verscheidenheid aan aanpasbare mallen zijn elders gepubliceerd16. - Bereid 10x injectie buffer, HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS), en een Stock Solution van Tetramethylrhodamine dextran kleurstof en bewaren bij 4 °C.
- Bereid experimentele oplossingen voor die geïnjecteerd moeten worden, zoals dsRNA, crispr/Cas912, transposeer bare elementen, in vitro afgetopte mRNA7,8, farmacologische agentia17, zfns of Talens9.
- Plaats plakband op meerdere lagen standaard labtape op een glazen Microscoop glijbaan om een perron van 1 mm of meer boven de glazen glijbaan te maken, die gebruikt zal worden voor het vasthouden van naalden voor de beoordeling.
- Bereid een cricket container van ongeveer 40 cm x 60 cm in grootte met een deksel met een mesh-bedekte opening voor luchtcirculatie.
- Voeg voedsel, water en opvang materialen toe.
- Voeg enkele tientallen gezonde mannelijke en vrouwelijke volwassen krekels. Identificeer volwassen cricket door de aanwezigheid van vleugels.
Opmerking: Een bereik van post-imaginale leeftijden kan de Eier opbrengsten verhogen. De dichtheid van krekels moet relatief hoog zijn om voldoende eieren te kunnen verzamelen voor een experiment, maar niet zo druk dat kannibalisme voorkomt. Bijvoorbeeld, ongeveer twee dozijn gezonde krekels, met een ruwweg gelijke mannelijke/vrouwelijke verhouding, in een container van de hierboven genoemde grootte moet voldoende zijn om over te verzamelen 200 eieren in een één tot twee h periode. Krekels kunnen op kamertemperatuur worden gehouden, maar ontwikkeling en gedrag zal optimaal zijn als krekels worden gehandhaafd in een warme (23.5 – 26 °C), vochtige (40-60% relatieve vochtigheid) incubator.
2. naalden voor injectie maken
- Gebruik borosilicaatglas capillairen met gloeidraad (Zie de tabel met materialen voor de details van de maat). Bereid de pull naalden op dezelfde dag, of tot een paar dagen voordat de injecties zijn voltooid.
- Plaats een capillair glas in de puller, midden het glas op de gloeidraad en draai de knoppen vast om het glas op zijn plaats te zetten.
- Stel de temperatuur van de trekker in de buurt van de glazen helling temperatuur (-5 °c tot + 10 °c).
- Gebruik een één-stap, hoog-warmte protocol om een lange taper met een kleine opening te trekken, maar vermijd het smelten van de uiteinden gesloten.
Opmerking: Als u bijvoorbeeld de pipet-trekker gebruikt die gedetailleerd is in de tabel met materialen die zijn uitgerust met een doos gloeidraad, gebruikt u de volgende parameters voor glas met een helling temperatuur van 478: Heat 478; Pull 45; Vel 75; Del 120. De optimale omstandigheden voor het vervaardigen van een naald met de in Figuur 2b getoonde vorm moeten door elke gebruiker empirisch worden bepaald. - Schuine naald tips ter voorbereiding van de injecties.
- Bevochtig het vlak van de draaiende molen van de beveler (Figuur 2a) met druipend water. Gebruik ofwel omgekeerde osmose (RO) of diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld gedistilleerd water.
- Plaats de getrokken naald in de beveler en draai naar een hoek van 20 °.
- Verlaag de naald totdat deze het slijp vlak en de schuine kant 2 tot 3 minuten aanraakt.
- Beoordeel de schuine kant door de afgeschuinde naald op een dubbele kleefband te plaatsen die is vastgehouden aan een glazen Microscoop-dia.
- Plaats de schuif die de naald vasthoudt op het podium van een samengestelde microscoop die is uitgerust met een camera-en beeldverwervings software.
- Verkrijg een afbeelding van de naaldpunt met behulp van een 20x-doelstelling.
- Gebruik de imaging software om de inwendige lumen diameter van de naald net proximale te meten met de afgeschuurd opening (figuur 2c). De optimale grootte is 10 μm + 2 μm.
- Gooi naalden met een opening onder 8 μm en boven 12 μm weg.
- Bewaar de naalden in een bakje met een deksel om te voorkomen dat ze stoffig worden. Gebruik een strook wax of soortgelijk materiaal om de naalden van de bodem van de container te verheffen om te voorkomen dat de uiteinden worden gebroken (figuur 2D).
3. inzameling en bereiding van eieren
- Maximaliseer het aantal eieren dat wordt gelegd door krekels van een vochtig legmateriaal (waterflesjes, eiergerechten) 's nachts of gedurende ten minste 8 – 10 uur te ontnemen voordat u eieren probeert te verzamelen.
Opmerking: Aangezien vrouwtjes de mogelijkheid hebben om inwendig sperma op te slaan, kan een anders getimede procedure nodig zijn als zorgvuldig getimede bemesting experimenteel essentieel is18. - Maak 40 mL van 1% agarose in water en giet in een 10 cm petrischaaltje.
- Plaats een ei-goed stempel op het oppervlak van de agarose voordat het stolt.
- Verwijder de stempel, zodra de agarose is gestijgd, om de putjes te onthullen (figuur 1c).
- Vul de agarose-goed plaat met HBS met 1% Penicillaire/streptomycine.
- Plaats de deksel op de schaal, wikkel in Parafilm en bewaar bij 4 °C.
Opmerking: Gerechten kunnen een paar dagen worden bewaard bij 4 °C, maar moeten vóór gebruik worden opgewarmd tot kamertemperatuur om condensatie te voorkomen. - Maak een ei-collectie schotel voor krekels om eieren te leggen door het vullen van een 35 mm petrischaaltje met witte Speeltuin zand (Figuur 1b).
Opmerking: Het in de inhoudstafel gespecificeerde zand is van de juiste korrelgrootte. Als de zandkorrels te groot zijn, zal het zand de eieren beschadigen. - Bedek de eierschaal met een vierkant van een papieren handdoek die ongeveer 18 cm x 18 cm is en plaats op de bovenkant van het gerecht met zand. Door deze papieren handdoek Bedek je het gevulde gerecht met kraanwater.
- Kantel de petrischaal en Knijp zachtjes in de top om overtollig water te verwijderen.
- Plooi de hoeken van het papieren handdoekenrek onder de schaal en plaats de eierschaal in het omgekeerde deksel, waardoor de papieren handdoek afdekking op zijn plaats blijft.
- Plaats de eierschaal in de kreeften emmer en laat de volwassen vrouwtjes eieren voor een tot twee uur oviposit.
Opmerking: De relatief korte tijd hier zorgt ervoor dat alle eieren vergelijkbaar in het stadium van ontwikkeling op het moment van de injectie zal zijn. Als injectie voordat cellularisatie belangrijk is, injecties moeten plaatsvinden binnen 14 h van ei leggen19. - Ondertussen, laat de agarose schotel (vanaf stap 3,6) te verwarmen tot de kamertemperatuur ter voorbereiding op het houden van eieren voor injectie.
- Verwijder de eiopvangschaal, die nu vers gelegde eieren bevat, uit de krekel emmer, en verwijder het deksel van de papieren handdoek. Plaats een zeef met een poriegrootte van 0,5 – 1 mm in een bekerglas met een inhoud van ten minste 500 mL (Figuur 1b).
- Spoel de inhoud van de eierschaal (zand en eieren) in de zeef onder zacht stromend kraanwater en laat de zandkorrels door het zeefgaas in het water in het bekerglas vallen, maar verlaat de cricket eitjes in de zeef korf.
- Vul een bakje met RO water en plaats het in een bakje. Keer de zeef over de container en tik erop tegen het gerecht om de eitjes in het water te Verdoe- De eieren zinken naar de bodem van de container.
- Snijd de tip van een P1000 pipetpunt met een schaar om een opening van ongeveer 3 mm in diameter te maken. Plaats deze tip op een P1000 pipet en gebruik deze om de eieren van de container over te brengen naar de agarose Eier schimmel schaal, die zo weinig mogelijk water overbrengt.
- Gebruik plastic pincet om eieren op te maken in agarose Wells gevuld met HBS plus 1% penicilline/streptomycine. Elk ei zal zinken naar de bodem van een individu goed. Dek af met de Petri schaaldeksel tot u klaar bent om te injecteren.
4. bereid de micro injector voor
- Bevestig de micro injector aan een perslucht of gasbron (dit protocol is geoptimaliseerd met behulp van perslucht of N2).
Opmerking: Als u een draagbare luchttank gebruikt, vult u deze in ten minste 75 psi. De tank zal de luchtdruk tijdens de injecties verliezen en moet mogelijk worden aangevuld; injecties worden moeilijk onder 40psi. - Zet de micro injector aan. Stel de injectie tijd in op 0,17 s en druk tot 10 – 15 psi.
Opmerking: De precieze druk die nodig is, hangt af van de opening van de naald en moet empirisch worden bepaald voor elke injectie ronde en/of nieuwe naald die wordt gebruikt. - Zorg ervoor dat de balans knop van de micro injector op 0 wordt gedraaid (doorgaans volledig linksom) en dat de micro injector onder druk staat en in de injectie modus.
5. injecties
- Filtreer ongeveer 500 μL 10x injectie buffer met een 1 mL spuit en een spuit filter van 0,45 μm.
- Meng injectie reagentia (de details die volgen zijn voor de injectie van dsRNA bereid zoals beschreven in12).
Opmerking: Het kan raadzaam zijn om verschillende besturingselementen te ontwerpen en uit te voeren, vooral wanneer men deze techniek voor het eerst leert. Poking eieren zonder te injecteren, injecteren buffer + kleurstof alleen, of injecteren buffer + Dye + een controle reagens (zoals eGFP dsRNA) zijn allemaal goede testen van hoe storend verschillende elementen van het injectie protocol zou kunnen zijn. Zie Figuur 3 voor de overlevingskansen van een aantal verschillende besturingselementen. - Beginnen met een 4 mL dsRNA aliquot.
- Voeg 0,5 mL van de gefilterde 10x injectie buffer toe aan het dsRNA aliquot.
- Voeg 0,5 mL 50 mg/mL tetramethyl Rhodamine dextran kleurstof voorraadoplossing toe. Gebruik in plaats daarvan fenolrood als u werkt aan een ontleed bereik zonder fluorescentie.
- Bewaar alle materialen op ijs voor de duur van de injectie periode.
- Laad de injectie oplossing in een injectienaald met 20 mL laad tips en een P10 pipet.
- Trek een injectie oplossing van 1,5 mL op en steek de laadpunt in het brede uiteinde van de injectienaald.
- Werp de oplossing zo ver mogelijk naar beneden in de naald en Elimineer luchtbellen door zachtjes te flikken; Let op dat u de naald niet breekt.
- Plaats het Gerecht van eieren onder de ontsnij Microscoop en selecteer een lage vergroting van ongeveer 10x (1x vergroting bekeken door 10x oogdoelstellingen).
- Steek de naald in de injectie behuizing en draai deze vast.
Opmerking: Zorg dat de naald goed en stevig in de behuizing is gestoken. Om dit te doen, trek het brede uiteinde van de naald terug uit de metalen behuizing, het brengen van de Silicon tubing in de behuizing met het. Stel de silicium slang zo in dat het glas uiteinde van de naald net buiten het silicium uitsteekt. Als dit niet gebeurt, kan de Siliconen slang worden geknepen tussen het glas en de metalen behuizing, waarbij het uiteinde van de naald wordt geblokkeerd. - Plaats voorzichtig de injectie behuizing met een bijgevoegde naald in de micro manipulator. Wees u bewust van het scherpe uiteinde van de naald en wees voorzichtig dat het niet in de oppervlakken wordt geraakt en gebroken.
- Terwijl het kijken naar zowel de eieren en de naald door de Microscoop, verplaats de naald in de buurt van de eieren in de linkerbovenhoek van het rooster van de schotel.
- Verlaag de naald totdat de tip de HBS plus 1% Penicilinein/streptomycine gebufferde oplossing in de schaal invoert.
- Plaats de naald in het gezichtsveld en verplaats de eierschaal zodat de naald zich een paar mm dichter bij de rand van het schaaltje bevindt dan de eieren.
- De weergave van het rooster van eieren met de naald niet belemmeren.
- Stel de Microscoop in op het filter dat geschikt is voor Rhodamine, dus het is mogelijk om de fluorescentie in de naald te observeren en zich te concentreren op de punt van de naald.
- Draai de balans knop op de micro injector langzaam rechtsom totdat de injectie oplossing uit de naald in de suspensie begint te lekken. Het balans nummer op het scherm van de micro injector zal beginnen te stijgen, hoewel de numerieke waarde niet belangrijk is. Draai de knop vervolgens weer tegen de klok in, net totdat de kleurstof uit de naald lekt.
Opmerking: Het is essentieel om dit evenwicht te stellen telkens wanneer een nieuwe naald wordt gebruikt. Zonder dat de balans op de juiste wijze is ingesteld, zal de micro injector gedurende enige tijd blijven injecteren nadat de injectie is geactiveerd. Het is zelfs mogelijk dat een enkele druk op de injectieknop met een onevenwichtige naald zal resulteren in de uitzetting van de gehele inhoud van de geladen naald. - Met de naald gecentreerd in het gezichtsveld, verplaats de eierschaal zodat de naald gericht is op het ei dat eerst moet worden geïnjecteerd. Het wordt aanbevolen dat injecties beginnen in een hoek van het rooster van gearrangeerde eieren, bijvoorbeeld, de linker bovenhoek.
- Stel de vergroting in op ongeveer 50x; bij deze vergroting zal één ei het grootste deel van het gezichtsveld vullen.
- Gebruik zowel de micromanipulator als de hand op de eierschaal om de naald in positie te brengen voor de injectie.
- Breng de naald met behulp van de micromanipulator en steek de punt van de naald in het eerste ei dat moet worden geïnjecteerd.
- Steek de naald met een lengte van 20 – 30% van het achterste (blunter) uiteinde van de Egg (Figuur 1e), loodrecht op de lange as van de Egg.
- Injecteer de oplossing ofwel met de injectie voetpedaal of de injectieknop op de micro injector. Een kleine bolus van fluorescerende stof in de Egg geeft een geslaagde injectie aan (figuur 1d).
Opmerking: Het is niet ongewoon dat sommige dooier tijdens de injectie uit de Egg worden uitgeworpen (Figuur 1f), en dit geeft niet noodzakelijkerwijs aan dat het geïnjecteerde ei niet levensvatbaar is. - Trek de naald uit de Egg. Als het ei onbedoeld uit zijn goed wordt getild bij het terugtrekken van de naald, gebruik dan kleine tang om het ei terug in zijn put te duwen terwijl de naald wordt teruggetrokken.
- Als de naald verstopt tijdens de injectie, verwijder de naald uit de Egg en, houd de naald ondergedompeld in de HBS plus 1% Penicillaire/streptomycine oplossing die de eieren bedekt, Wis de verstopte naald met behulp van de Clear -functie of door de injectie te duwen Knop.
- Als u dezelfde naald blijft gebruiken, herhaalt u de injectieprocedure voor zo veel mogelijk eieren. In eerste, dit kan slechts ongeveer 20 of 30 eieren, maar zal toenemen tot meer dan 100 met de praktijk.
- Als de naald verstopt raakt en niet kan worden gewist, gooi de naald dan weg, vul een nieuwe naald en begin opnieuw (d.w.z., keer terug naar stap 5,7).
- Bewaar de schaal van de ingespoten eieren in een warme incubator (23,5 – 26 °C) die licht vochtig is (om de verdamping te minimaliseren) totdat de embryo's de gewenste ontwikkelingsfase voor de analyse hebben bereikt.
- Ten minste elke 24 uur, eieren verwijderen die niet langer levensvatbaar zijn (Figuur 3a, B) en de suspensie oplossing vervangen door verse HBS plus 1% Penicileen/streptomycine.
- Twee tot drie dagen na de injectie, breng de eieren door voorzichtig pipetteren of met een plastic Tang naar papieren handdoeken bevochtigd met HBS plus 1% Penicillaire/streptomycine in een hard plastic petrischaaltje om de ontwikkeling in de warme, vochtige incubator voort te zetten.
- De eieren controleren en eieren verwijderen die elke dag niet meer levensvatbaar zijn (Figuur 3a, B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Krekels leggen gemakkelijk eieren in het vochtige materiaal en zorgen voor voldoende materiaal, zoals vochtig zand of vuil, om een groot aantal eieren te leggen. Dit is vooral effectief als krekels voor het eerst worden beroofd van eierlegmateriaal voor 8 – 10 h. eieren die in schoon zand worden gelegd, kunnen gemakkelijk worden gescheiden, opgevangen (Figuur 1b) en in op maat ontworpen Eier putten voor injectie worden geplaatst (figuur 1c). Een ontleed Microscoop, een micro injector en een micro manipulator (Figuur 1a) kunnen worden gebruikt om afzonderlijke eieren te injecteren met een verscheidenheid aan materialen (figuur 1d). Eieren worden geïnjecteerd in de buurt van het achterste uiteinde, op een punt van ongeveer 20 – 30% langs de voorste-posterieure as (Figuur 1e). Het kan moeilijk zijn om het meer puntige voorste uiteinde van het meer geblonken achterste uiteinde te onderscheiden, omdat deze verschillen vaak subtiel zijn (Figuur 1e). Een ei van de zijkant naar de zijkant rollen helpt vaak om te onthullen welk uiteinde dat is. Na verwijdering van de injectienaald wordt eidooier soms uitgeworpen (Figuur 1f), hoewel dit de gezondheid van het zich ontwikkelende embryo binnen niet lijkt te compromitteren.
Een van de meest kritische stappen in dit protocol is de bereiding van afgeschuurd naalden. Na het trekken van lange, slanke naalden moeten ze worden afgeschuurd tot een hoek van 20 ° en een openings diameter hebben van 10 μm (± 2 μm). Als de diameter te groot is, zal de injectie oplossing uit de naald lekken, en deze naalden zullen grote gaten in eieren creëren, waardoor de overlevingskansen afnemen. Smallere naalden verhogen de overlevingskansen, maar als ze te smal zijn, hebben ze de neiging om gemakkelijk te verstoppen, wat injecties traag en frustrerend maakt. Met een naald diameter van 10 μm ± 2 μm is het mogelijk om 100 eieren met een enkele naald naar boven te injecteren zonder de naald te verstoppen.
Naalden kunnen worden afgeschuurd met een micro slijper of afschuinmachine (Figuur 2a). Deze uitrustingsstukken kunnen worden verkregen met een microscoop die is bevestigd, of men zou een ontleed bereik op een onafhankelijke stand kunnen toevoegen voor modellen die de Microscoop niet bevatten. Een kleine micro manipulator houdt de naald, die kan worden gekanteld naar de gewenste hoek en verlaagd naar het oppervlak van een roterende slijp vlak, die wordt bevochtigd met druipend water. Een voorbeeld van een getrokken, maar onafgeschuinde naald is te zien in Figuur 2b, en een naald met een schuine kant van 20 ° wordt weergegeven in figuur 2c. Naalden moeten vervolgens veilig worden opgeslagen om beschadiging te voorkomen en schoon te houden (figuur 2D).
Het instellen van de balans en de injectiedruk op de juiste wijze op de micro injector moet het mogelijk maken om een vergelijkbare hoeveelheid materiaal te injecteren in elk ei geïnjecteerd met dezelfde naald. Optimalisatie van de injectie-en balans druk zal nodig zijn bij het overstappen op een naald met een andere diameter. Deze optimalisatie zal de consistentie van injectiepulsen maximaliseren.
Het overlevingspercentage is een belangrijke parameter voor het beoordelen van het succes van deze experimenten. De meeste dode eieren kunnen gemakkelijk als volgt worden geïdentificeerd: de dooier en het embryonale weefsel binnen het ei beginnen ongelijkmatig te klonteren (Figuur 3a) en uiteindelijk zal het grootste deel van de dooier naar één kant van de Egg migreren (Figuur 3b). Bij beoordeling na 4 – 6 dagen (equivalent aan stadia 8 – 15)19, overleefde meer dan 85% van de ongespoten eieren terwijl de met experimentele reagentia geïnjecteerde eieren over het algemeen een lager overlevingspercentage hadden (figuur 3c). Controle voor alle aspecten van de injectie zelf, met inbegrip van de naald punctie, de introductie van kleurstof en buffer, of de aanwezigheid van voertuig of dsRNA, is vereist om de ware effecten van de experimentele manipulatie te begrijpen (figuur 3C). afhankelijk van de experimentele manipulatie kan een hoger niveau van letaliteit worden verwacht, en kan het nodig zijn om de timing van de test of de timing van de injectie te wijzigen om eventuele niet-dodelijke effecten van de manipulatie te beoordelen.
De manier waarop men de fenotypische resultaten van de injectie beoordeelt, hangt af van wat werd geïnjecteerd. Bijvoorbeeld, fenotypische veranderingen als gevolg van specifieke mRNA knockdowns kunnen duidelijk zijn op het niveau van de grove anatomie. Bijvoorbeeld, de gen Enhancer van sinaasappelzeste (E (z)) onderdrukt gewoonlijk Hox -genen, inclusief ultrabithorax (ubx). Het injecteren van dsRNA voor e (z) klopt e (z) functie en releases ubx onderdrukking, resulterend in ectopische ubx expressie. Dit leidt tot de transformatie van vijf paar ventrale aanhangsels (antenne, maxilla, labium, T1 en T2 poot) in T3 beenachtige aanhangsels, als gevolg van de afsplitsing van Ubx in die segmenten20. In een tweede voorbeeld is het mogelijk om GFP-expressie te gebruiken om de succesvolle invoeging van een transgene te testen. Wanneer bijvoorbeeld een cDNA-codering van een met EGFP gelabeld histone 2b -gen onder de controle van een G. krekel actin promoter in het cricket genoom werd ingebracht met behulp van piggybac transposase, werd het mogelijk om elke Nucleus te visualiseren in de Egg met fluorescentie om het eGFP-Tagged His2B-eiwit te prikkelen (figuur 4c, D). In dit geval was het mogelijk om de beweging van kernen in de tijd7te monitoren.
| Naam van de oplossing | Onderdelen | Opmerkingen/beschrijving |
| 10x injectie buffer oplossing | In 1 L H2O toevoegen: 0,8 g NaCl, 0,09 g na2hpo4, 0,04 g KH2po4, 2,98 g KCl | Winkelvoorraad bij 4 °C. Filtreer een kleine hoeveelheid direct voor gebruik met een 1 mL spuit met een spuit filter van 0,45 μm. Herhaal zo nodig om ongeveer 500 μL injectie oplossing te filteren. Bewaar de gefilterde injectie oplossing op ijs gedurende de duur van het experiment. |
| HEPES gebufferde zoutoplossing | In 1 L H2O, toevoegen: 8,77 g nacl, 5,2 g Hepes, | pH tot 7,0 en bewaren bij 4 °C. |
| Tetramethyl Rhodamine dextran (10.000 MW) kleurstof voorraadoplossing | Rhodamine kleurstof van Thermofisher | Deze kleurstof wordt vaak verkocht als een gelyofiliseerd poeder. In dit geval, make-up een stamoplossing van 50 mg/mL met water. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 5 minuten om onoplosbare deeltjes te verwijderen. Verzamel het supernatant na centrifugeren, Vermijd eventuele deeltjes aan de onderkant van de buis, aliquot en Vries bij-20 °C. Voorraad aliquots in gebruik kunnen gedurende één tot twee weken bij 4 °C worden bewaard. Vermijd het bevriezen en ontdooien van aliquots meerdere malen. Als naalden verstopt zijn door kleurstof, kan de kleurstof ook worden gefilterd door Whatman #2 filtreerpapier. |
Tabel 1: oplossings recepten en notities.
Figuur 1: Egg Injection protocol overzicht. A) eentypische opstelling die kan worden gebruikt voor Eier injecties. B) eieren worden gescheiden van zand via een zeef. C) eieren worden vastgehouden voor injectie in kleine putjes gemaakt door een mal in warme, vloeibare agarose te plaatsen. D) fluorescentie in de naald en in vijf geïnjecteerde eieren kan worden gezien via de fluorescerende ontsnij Microscoop. E) een ongespoten ei. Het voorste uiteinde (lichtjes gericht; links) en het achterste uiteinde (meer afgerond; rechts) zijn van elkaar te onderscheiden. De regio die het meest geschikt is voor injectie, in de buurt van het achterste uiteinde, wordt met de beugel weergegeven. F) twee dagen na de injectie een ei. De injectieplaats is zichtbaar als een lichte verkleuring, en een kleine hoeveelheid verdreven dooier is duidelijk (Arrow). Schaal staven = 1 mm (D); 0,5 mm (E en F). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: naalden worden afgeschuurd met behulp van een micro slijper of beveller. A) eenvoorbeeld van een micro slijper met een circulair, draaiend slijp oppervlak dat bevochtigd wordt door het druipen van ro-water (water druppelt uit de spuit boven aan de afbeelding). (B) voor het beveling zijn getrokken naalden lang en smal. (C) na verdraaien tot 20 ° wordt een scherpe injectienaald gemaakt. Let op de diameter van 10 μm van het binnenste lumen. (Rode schaal staven = 10 μm). D) getrokken, afgeschuurd naalden kunnen worden opgeslagen in een Petri schaaltje met deksel en op hun plaats worden gehouden met behulp van tandheelkundige wax. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: injecties kunnen de overlevings snelheid verlagen. A) dode en stervende eieren zijn duidelijk bij visuele inspectie. (B) na verloop van tijd zal het materiaal naar één kant van de Egg migreren. C) vergelijking van de overlevingskansen vier tot zes dagen na het leggen van eieren voor verschillende omstandigheden, waaronder: ongespoten eieren (n = 6 experimenten); eieren doorprikt met een naald van 9 μm maar niet geïnjecteerd (n = 2 experimenten); eieren geïnjecteerd met buffer en kleurstof (n = 13 experimenten); eieren geïnjecteerd met buffer, kleurstof en plasmide vector (n = 2 experimenten); eieren geïnjecteerd met buffer, kleurstof, en DMSO (n = 11 experimenten); en eieren geïnjecteerd met buffer, kleurstof, en controle dsRNA (n = 22 experimenten). Het type van de controle dsRNA gebruikt opgenomen dsRNA tegen eGFP of dsRed. De nummers aan de basis van elke staaf noteren het totale aantal overgebleven eieren/totaal eieren die voor elke aandoening worden gebruikt. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Schaal staaf = 1 mm (A en B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: beoordeling van de injectie resultaten. (a-B) Injectie van Enhancer van zeste (E (z)) dsRNA verandert de normale uitdrukking van ubx mRNA (wild type weergegeven in (a) en leidt tot de transformatie van antennes (an) en mondstukken (MX, lb) in beenachtige aanhangsels (B). (C-D) Injectie van vroege eieren met het transposeer bare element piggyBac en histone2B-eGFP produceert transgene embryo's die GFP in alle kernen uitdrukken. Plaats van kernen kan worden waargenomen 8 h na het leggen van eieren (C) en 20 h na het leggen van eieren (D). Afkortingen: een = antenne; MX = maxilla; LB = labium; T1-3 = thoracische benen 1 tot 3; RNAi = RNA-interferentie; GB = G. krekel; Act = actin; H2B = Histon H2B; GFP = groen fluorescerend eiwit. Schaal staven = 200 μm (A en B); 500 μm (E en F). Deze experimentele resultaten werden oorspronkelijk elders beschreven7,20. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De twee belangrijkste uitdagingen met deze techniek zijn de gerelateerde kwesties van optimale naald grootte en overlevingskansen. Hoewel kleinere naalden overlevingskansen verbeteren, hebben naalden met smallere lumen een grotere mate van capillaire krachten op het werk, wat het waarschijnlijker maakt dat dooier in de naald zal bewegen waardoor het verstopt is. In het beste geval kunnen blokkades eenvoudig worden gewist door een ander ei te injecteren of door de naald te verwijderen zoals hierboven beschreven. Men kan ook proberen de balans druk op de micro injector te verhogen totdat de dooier uit de naald wordt geduwd. De andere grote uitdaging met deze techniek is overlevingsvermogen. In onze handen zijn de overlevingspercentages voor met experimentele oplossingen geïnjecteerde eieren meestal tussen 40 en 80%. Overlevingspercentages kunnen zo laag zijn als 10% voor degenen die deze techniek beginnen te leren, maar zullen verbeteren met de praktijk. Negatieve controles, zoals hierboven beschreven, zijn belangrijk voor onderzoekers om de veranderingen in overlevingskansen nauwkeurig te beoordelen met de praktijk, gezien het feit dat de introductie van verschillende materialen de overlevingskansen kan verlagen (figuur 3c).
De timing van injecties is een belangrijke overweging voor elke experimentele aanpak ook. Oudere eieren zijn moeilijker te injecteren dan jongere, en in het algemeen zijn de overlevingspercentages hoger bij het injecteren van jongere in plaats van oudere eieren. De introductie van de naald en geïnjecteerd materiaal in latere stadia kan leiden tot onbedoelde anatomische schade. Met ervaring is het echter mogelijk om twee tot drie dagen oude eieren te injecteren. Het richten op de rugzijde van de Egg in deze stadia helpt om beschadiging van het embryo te voorkomen, dat eerst aan de ventrale kant vormt. Het doel van het achterste uiteinde kan de toegang tot het reagens verhogen tot de eerste nucleaire divisies en de vorming van kiem groepen, die zich in de buurt van dit uiteinde van het ei19,21voordoen. Als men probeert om het genoom te manipuleren, met als doel om ofwel wijdverspreide somatische of kiembaan transmissie van de genoom wijziging, injecties moeten worden uitgevoerd vóór cellularisatie, die begint ongeveer 14 h na het leggen van de eieren19 . Bij het injecteren van dsRNA om mRNA-niveaus te nemen, moet het tijdvenster voor injecties worden bepaald op basis van hoe vroeg in ontwikkeling men een gen van belang wil neer zetten. Hoewel de effecten van RNAi waarschijnlijk enige tijd duren, moet dsRNA vooraf worden ingevoerd op het moment waarop één van plan is veranderingen in fenotype te beoordelen. Het bijhouden van de tijd die is verstreken tijdens de injectie en de progressie van de embryonale ontwikkeling kan belangrijk zijn om ervoor te zorgen dat de juiste podium eieren worden geïnjecteerd. Ongeacht welk materiaal wordt geïnjecteerd, ontwikkelings vertragingen na injectie zijn gebruikelijk, hoewel de mate van de vertraging kan variëren afhankelijk van de injectant.
Het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op een aantal relatief dure uitrustingsstukken. Het moet echter mogelijk zijn om eieren met succes te injecteren zonder het gebruik van sommige of zelfs al deze items. Bijvoorbeeld, er zijn een verscheidenheid aan microinjectoren op de markt, en sommige kunnen minder duur dan de voorgestelde in de tabel van de materialen. Het is ook mogelijk om gewoon een spuit te gebruiken om een geschikte hoeveelheid materiaal te injecteren, hoewel dit enige oefening zou duren. In plaats van een dure micro manipulator, zou men een verscheidenheid aan materialen kunnen gebruiken om de naald stabiel te houden en een langzame, gecontroleerde voorschot te geven, en een eenvoudig plasticine-ontwerp is gebruikt door anderen22. Het kan ook mogelijk zijn om het gebruik van een beveller te vermijden, hoewel in onze ervaring een goede Afschuining een enorm verschil kan maken voor het succes van injecties. Het kan mogelijk zijn om een getrokken naald scherper te maken door de punt van de naald met de hand over het fijnste zand papier te slepen en dit proces onder een microscoop te beoordelen. Ongeacht, geslepen naalden zal injecties gemakkelijker maken en overlevingskansen te verbeteren.
Deze injectietechniek is flexibel en kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan verschillende manipulaties. Hier hebben we resultaten voor dsRNA en piggyBac-afhankelijke genomische modificatie experimenten getoond, maar het is ook mogelijk om CRISPR/CAS of andere benaderingen met deze techniek te gebruiken. In de hier opgenomen experimenten waren de resulterende fenotypes duidelijk en gemakkelijk te beoordelen. Sommige experimenten vereisen het gebruik van Immunohistochemie of andere visualisatiehulpmiddelen om de effecten van experimentele manipulatie te kunnen zien. Een alternatief voor injecties is het gebruik van elektroporation, dat kan worden gebruikt om DNA of andere macromoleculen in cellen en weefsels in vivo in te voeren. Elektroporation kan worden gebruikt in oudere Cricket eieren waar embryo's al zijn gevormd om specifieke gebieden8te targeten, maar injectie is nuttiger wanneer het experiment vereist dat het hele ontwikkelende embryo wordt getarget. Deze injectietechniek moet ook gemakkelijk kunnen worden aangepast voor gebruik in eieren van een verscheidenheid van verschillende hemimetabolous en holometaboleuze insecten, idealiter verbeteren van de mogelijkheid om zinvolle vergelijkende studies uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het onderzoek dat in dit project werd gerapporteerd, werd gesteund door een institutionele ontwikkelings prijs (IDeA) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Grant Number P20GM10342 to HH3, en door NSF Award nummer IOS-1257217 aan Cge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
