Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Injektion von Cricket-Eiern vor, eine Technik, die als grundlegende Methode in vielen Experimenten im Cricket dient, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, RNA-Interferenz und genomische Manipulation.
Abstract
Die Veränderung der Genfunktion in einem sich entwickelnden Organismus ist für verschiedene Arten von Experimenten von zentraler Bedeutung. Während in traditionellen Modellsystemen enorm leistungsfähige genetische Werkzeuge entwickelt wurden, ist es in den meisten anderen Organismen schwierig, Gene oder Boten-RNA (mRNA) zu manipulieren. Gleichzeitig basieren evolutionäre und vergleichende Ansätze auf einer Erforschung der Genfunktion bei vielen verschiedenen Arten, was die Entwicklung und Anpassung von Techniken zur Manipulation von Expressionen außerhalb der derzeit genetisch behördlichen Spezies. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Injektion von Reagenzien in Cricket-Eier, um die Auswirkungen einer bestimmten Manipulation auf die embryonale oder Larvenentwicklung zu testen. Anweisungen zum Sammeln und Injizieren von Eiern mit abgeschrägten Nadeln werden beschrieben. Diese relativ einfache Technik ist flexibel und potenziell an andere Insekten anpassbar. Man kann Dutzende von Eiern in einem einzigen Experiment sammeln und injizieren, und die Überlebensraten für Pufferinjektionen verbessern sich mit der Praxis und können bis zu 80% betragen. Diese Technik unterstützt verschiedene Arten von experimentellen Ansätzen, einschließlich der Injektion von pharmakologischen Wirkstoffen, in vitro capped mRNA, um Gene von Interesse auszudrücken, doppelsträngige RNA (dsRNA), um RNA-Interferenzen zu erreichen, die Verwendung von clusterierten regelmäßig kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) in Abstimmung mit CRISPR-assoziierten Protein-9 (Cas9)-Reagenzien zur genomischen Modifikation und transposierbaren Elementen zur Erzeugung transienter oder stabiler transgener Linien.
Introduction
Die Fähigkeit, das Genom zu modifizieren oder die Genexpression in Organismen zu beeinflussen, ist die Grundlage für die Entwicklung vieler Arten von Experimenten, die funktionelle Kausalität testen. Entscheidend für die vergleichende und evolutionär relevante Arbeit ist auch, dass genomische und nicht-genomische Modifikationstechniken in Organismen außerhalb traditioneller genetischer Labortiermodellsysteme (z. B. Mus musculus, Danio) verfügbar sind. rerio, Drosophila melanogasterund Caenorhabditis elegans). Ob es der Wunsch ist, die Vielfalt des Organismus zu verstehen1 oder die Einhaltung des Krogh-Prinzips, dass es für jede biologische Frage einen Organismus gibt, der am besten zu seinerLösung2,3, der Fähigkeit, Genome zu modifizieren oder Einfluss auf die Genexpression ist für moderne Experimentelle Designs unerlässlich.
Der Cricket Gryllus bimaculatus ist ein aufstrebendes Modellsystem. Verwendet für das letzte Jahrhundert in neuroethologischen Experimenten4, die letzten zwei Jahrzehnte haben ein erhöhtes experimentelles Interesse an der Cricket erlebt, vor allem auf die Entwicklung und Entwicklung dieses Organismuskonzentriert 5. Die Cricket ist ein hemimetabolous Insekt, das basal zu gut untersuchten holometabolen Insekten, wie D. melanogaster und Tribolium castaneum6. Aufgrund seiner nützlichen Position auf dem Evolutionsbaum sind Wissenschaftler daran interessiert, moderne, anspruchsvolle experimentelle Fragen an diesem Insekt zu stellen, was zu einem wachsenden Interesse an der Anpassung molekularer Werkzeuge für den Einsatz in G. bimaculatusgeführt hat.
Injektionen molekularer Reagenzien in Cricket-Eier können für genomische Modifikationsexperimente sowie nicht-genomische Manipulationen der Genexpression in Embryonen verwendet werden. Zum Beispiel wurden transgene G. bimaculatus tragen degfP Insertionen wurden mit der Transposase piggyBac7,8erstellt. Die Forscher haben erfolgreich Knockout G. bimaculatus mit Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-ähnlichen (TAL) Effektornukleasen (TALENs) erstellt, um doppelsträngige Brüche in bestimmten Genomregionen einzuführen9. Obwohl ZFNs und TALENs ortsspezifisches Targeting bei Tieren über die großen vier Modellsysteme hinaus ermöglichen, wurden diese Reagenzien schnell durch das CRISPR/Cas9-System übertroffen, das einfacher zu bedienen, effizienter und hochflexiblerist 10. CRISPR wurde in G. bimaculatus zur Herstellung von Knock-out11 sowie Knock-in-Linien12,13 Zusätzlich zur genomischen Modifikation kann dsRNA in Eier injiziert werden, um die mRNA-Expression bei der Entwicklung Embryonen, so dass die Forscher die Rolle der spezifischen Transkripte während der Entwicklung verstehen14,15. Einige begrenzte Details über die Injektion von Cricket-Eiern wurden bereits veröffentlicht12.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Injektion früher G. bimaculatus Eier. Dieses Protokoll ist effektiv und leicht an verschiedene Laboreinstellungen, Injektionsmaterialien und möglicherweise an andere Insekten anpassbar. Während zusätzliche Details für die Gestaltung und Umsetzung von Genommodifikations- und Knockdown-Experimenten an anderer Stelle veröffentlicht wurden12,13, werden diese Ansätze letztlich auf das hier beschriebene Injektionsprotokoll angewiesen sein.
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Protocol
1. Hardware-Einrichtung und -Vorbereitung von Materialien
HINWEIS: Zur Vorbereitung von Lösungen, Reagenz und Ausstattungsdetails finden Sie in Tabelle 1 und Materialtabelle.
- Richten Sie ein Sezieren des Mikroskops ein, um Eier zu sehen und die Injektionsnadel zu führen. (Abbildung1A zeigt ein mit Fluoreszenz ausgestattetes Sezierendes Mikroskop.) Fluoreszenzfähigkeit ist vorteilhaft, aber nicht notwendig.
- Positionieren Sie einen 3-Achsen-Mikromanipulator, um die Injektionsnadel an Ort und Stelle zu manövrieren (Abbildung 1A).
- Richten Sie einen Mikroinjektor mit Schläuchen und einem Nadelhalter ein, um kleine Mengen Material zu injizieren (Abbildung 1A). Verwenden Sie optional ein Fußpedal, das in der Abbildung nicht dargestellt ist.
- Entwerfen und erstellen Sie einen Stempel, um Bohrungen für Eier zu erstellen (Abbildung 1C), indem Sie die Umkehrung des gewünschten Musters drucken, entweder mit einem 3D-Drucker oder einem Lasergravierer.
HINWEIS: Der gezeigte 3D-gedruckte Musterstempel ist 4,5 cm x 5 cm mit 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm Vorsprung zur Herstellung individueller Brunnen. Details, wie man eine Vielzahl von anpassbaren Formen zu machen wurden an anderer Stelle veröffentlicht16. - 10x Injektionspuffer, HEPES gepufferte Saline (HBS) und eine Stammlösung aus Tetramethylrhodamin Dextran Farbstoff vorbereiten und bei 4 °C lagern.
- Vorbereiten sie experimentelle Lösungen, die injiziert werden sollen, wie dsRNA, CRISPR/Cas912, transponierbare Elemente, in vitro gekappte mRNA7,8, pharmakologische Wirkstoffe17, ZFNs oder TALENS9.
- Legen Sie Doppelklebeband auf mehrere Schichten Standard-Laborband auf einem Glasmikroskop-Dia, um eine Plattform 1 mm oder so über dem Glasschlitten zu erstellen, die zum Halten von Nadeln für die Bewertung verwendet wird.
- Bereiten Sie einen Cricket-Behälter ca. 40 cm x 60 cm größe mit einem Deckel mit einer mesh-bedeckten Öffnung für die Luftzirkulation.
- Fügen Sie Lebensmittel, Wasser und schutzbeschützende Materialien hinzu.
- Fügen Sie mehrere Dutzend gesunde männliche und weibliche erwachsene Grillen. Identifizieren Sie erwachsene Cricket durch die Anwesenheit von Flügeln.
HINWEIS: Eine Reihe von post-imaginalen Alter kann die Eierträge erhöhen. Die Dichte der Grillen sollte relativ hoch sein, um genug Eier für ein Experiment sammeln zu können, aber nicht so überfüllt, dass Kannibalismus auftritt. Zum Beispiel sollten etwa zwei Dutzend gesunde Grillen, mit einem ungefähr gleichen Verhältnis von Mann zu Frau, in einem Behälter der oben genannten Größe ausreichen, um etwa 200 Eier in einem Ein- bis Zwei-Stunden-Zeitraum zu sammeln. Grillen können bei Raumtemperatur gehalten werden, aber Entwicklung und Verhalten sind optimal, wenn Grillen in einem warmen (23,5–26 °C), feuchten (40 - 60% relativen Luftfeuchtigkeit) Brutkasten gehalten werden.
2. Herstellung von Nadeln für die Injektion
- Verwenden Sie Borosilikatglaskapillaren mit Filament (siehe Tabelle der Materialien für Größendetails). Bereiten Sie die Zugnadeln am selben Tag oder bis zu einigen Tagen vor der Injektion vor.
- Legen Sie ein Kapillarglas in den Puller, zentrieren Sie das Glas auf das Filament, und ziehen Sie die Knöpfe, um das Glas an Ort und Stelle zu sichern.
- Stellen Sie die Abziehertemperatur in der Nähe der Glasrampentemperatur (-5 °C bis +10 °C) ein.
- Verwenden Sie ein einstufiges Hochwärmeprotokoll, um eine lange Verjüngung mit einer kleinen Öffnung zu ziehen, aber vermeiden Sie das Schmelzen der endenliegenden Enden geschlossen.
HINWEIS: Verwenden Sie z. B. bei Verwendung des Mikropipette-Ziehers, der in der Tabelle der Materialien mit einem Kastenfilament ausgestattet ist, die folgenden Parameter für Glas mit einer Rampentemperatur von 478: Hitze 478; Ziehen 45; Vel 75; Del 120. Die optimalen Bedingungen für die Herstellung einer Nadel mit der in Abbildung 2B dargestellten Form sollten von jedem Anwender empirisch bestimmt werden. - Nadelspitzen zur Vorbereitung auf die Injektionen abschrägen.
- Befeuchten Sie die Spinnschleiferebene des Kegels (Abbildung 2A) mit tropfendem Wasser. Verwenden Sie entweder Umkehrosmose (RO) oder Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltes destilliertes Wasser.
- Legen Sie die gezogene Nadel in den Verweser und drehen Sie sie in einen 20°-Winkel.
- Senken Sie die Nadel, bis sie nur die Schleifebene berührt und 2 bis 3 min abschrägen.
- Bewerten Sie die Abschrägung, indem Sie die abgeschrägte Nadel auf ein Doppelklebeband legen, das an einem Glasmikroskopschlitten verklebt wurde.
- Platzieren Sie das Dia, das die Nadel hält, auf die Bühne eines zusammengesetzten Mikroskops, das mit einer Kamera und einer Bildaufnahmesoftware ausgestattet ist.
- Erfassen Sie ein Bild der Nadelspitze mit einem 20-fachen Objektiv.
- Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um den inneren Lumendurchmesser der Nadel zu messen, der nur proximal zur abgeschrägten Öffnung ist (Abbildung 2C). Die optimale Größe beträgt 10 m + 2 m.
- Entsorgen Sie Nadeln, die eine Öffnung unter 8 m und über 12 m haben.
- Bewahren Sie die Nadeln in einem Behälter mit Deckel auf, um zu vermeiden, dass sie staubig werden. Verwenden Sie einen Streifen Wachs oder ähnliches Material, um die Nadeln von der Unterseite des Behälters zu heben, um zu verhindern, dass die Spitzen brechen (Abbildung 2D).
3. Eiersammlung und -zubereitung
- Maximieren Sie die Anzahl der Eier, die gelegt werden, indem Sie Grillen jegliches feuchtes Ledermaterial (Wasserfläschchen, Eierschalen) über Nacht oder für mindestens 8–10 h vor dem Versuch, Eier zu sammeln, vorenthalten.
HINWEIS: Da Weibchen die Fähigkeit haben, Spermien intern zu speichern, kann ein anders getimtes Verfahren erforderlich sein, wenn eine sorgfältig getimte Befruchtung experimentell wesentlich ist18. - 40 ml 1% Agarose in Wasser machen und in eine 10 cm Petrischale gießen.
- Legen Sie einen Eierbrunnenstempel auf die Oberfläche der Agarose, bevor sie erstarrt.
- Entfernen Sie den Stempel, sobald die Agarose verfestigt ist, um die Brunnen zu offenbaren (Abbildung 1C).
- Füllen Sie die Agarose-Wellplatte mit HBS, die 1% Penicillin/Streptomycin enthält.
- Den Deckel auf die Schale legen, in Parafilm wickeln und bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Geschirr kann für ein paar Tage bei 4 °C gelagert werden, sollte aber vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmt werden, um Kondensation zu vermeiden. - Machen Sie eine Ei-SammlungSchale für Grillen Eier zu legen, indem Sie eine 35 mm Petrischale mit weißen Spielplatz Sand füllen (Abbildung1B).
HINWEIS: Der in der Materialtabelle angegebene Sand hat die entsprechende Korngröße. Wenn die Sandkörner zu groß sind, wird der Sand die Eier beschädigen. - Die Eierschale mit einem Quadrat papiertuch, das etwa 18 cm x 18 cm groß geschnitten ist, mit einem Quadrat papierenen Handtuchs bedecken und mit Sand auf die Oberseite legen. Durch dieses Papierhandtuch bedecken Sie die gefüllte Schale mit Leitungswasser.
- Neigen Sie die Petrischale und drücken Sie vorsichtig die Oberseite, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
- Stecken Sie die Ecken des Papiertuchquadrats unter die Schale und legen Sie die Eierschale in den umgekehrten Deckel, der dazu beiträgt, die Papiertuchabdeckung an Ort und Stelle zu halten.
- Legen Sie die Eierschale in den Cricket-Behälter und lassen Sie die erwachsenen Weibchen Eier für ein bis zwei h oviposit.
HINWEIS: Die relativ kurze Zeit hier stellt sicher, dass alle Eier im Entwicklungsstadium zum Zeitpunkt der Injektion ähnlich sein werden. Wenn eine Injektion vor der Zellzellisierung wichtig ist, sollten Injektionen innerhalb von 14 h von Eiablage19auftreten. - In der Zwischenzeit die Agaroseschale (ab Schritt 3.6) auf die Raumtemperatur erwärmen lassen, um Eier zur Injektion zu halten.
- Entfernen Sie die Eiersammelschale, die jetzt frisch gelegte Eier enthält, aus dem Cricket-Behälter, und entfernen Sie den Papiertuchdeckel. Legen Sie ein Sieb mit einer Porengröße von 0,5–1 mm über einen Becher mit einer Kapazität von mindestens 500 ml (Abbildung 1B).
- Spülen Sie den Inhalt der Eierlegende (Sand und Eier) in das Sieb unter sanft fließendem Leitungswasser, so dass die Sandkörner durch das Siebgitter in das Wasser im Becher unten fallen, aber die Cricket-Eier im Siebkorb zurücklassen.
- Füllen Sie einen Behälter mit RO-Wasser und legen Sie es in ein Tablett. Das Sieb über den Behälter umkehren und gegen die Schale anzapfen, um die Eier ins Wasser zu entwirn. Die Eier sinken auf den Boden des Behälters.
- Schneiden Sie die Spitze mit einer P1000 Pipettenspitze mit einer Schere ab, um eine Öffnung von ca. 3 mm Durchmesser zu machen. Legen Sie diese Spitze auf einen P1000 Pipettier und verwenden Sie ihn, um die Eier aus dem Behälter auf die Agarose-Ei-Formschale zu übertragen, so wenig Wasser wie möglich zu übertragen.
- Verwenden Sie Eine Kunststoff-Pinzette, um Eier in MitHBS gefüllten Agarosebrunnen plus 1% Penicillin/Streptomycin anzulegen. Jedes Ei sinkt auf den Boden eines einzelnen Brunnens. Mit dem Petrischalendeckel abdecken, bis er injiziert werden kann.
4. Bereiten Sie den Mikroinjektor vor
- Befestigen Sie den Mikroinjektor an einer Druckluft- oder Gasquelle (dieses Protokoll wurde entweder mit Druckluft oder N2optimiert).
HINWEIS: Wenn Sie einen tragbaren Lufttank verwenden, füllen Sie ihn auf mindestens 75 psi. Der Tank verliert luftdruck während der Injektionen und muss möglicherweise wieder aufgefüllt werden; Injektionen werden schwierig unter 40psi. - Schalten Sie den Mikroinjektor ein. Stellen Sie die Einspritzzeit auf 0,17 s und den Druck auf 10–15 psi ein.
HINWEIS: Der genaue Druckbedarf hängt vom Öffnen der Nadel ab und muss empirisch für jede verwendete Injektionsrunde und/oder neue Nadel bestimmt werden. - Stellen Sie sicher, dass der BALANCE-Regler des Mikroinjektors auf 0 (in der Regel vollständig gegen den Uhrzeigersinn) gedreht wird und dass der Mikroinjektor unter Druck steht und sich im Injektionsmodus befindet.
5. Injektionen
- Filtern Sie ca. 500 l 10x Injektionspuffer mit einer 1 ml Spritze und einem 0,45 m Spritzenfilter.
- Mischen Sie Injektionsreagenzien (die folgenden Details sind für die Injektion von dsRNA hergestellt, wie in12beschrieben ).
HINWEIS: Es kann ratsam sein, mehrere Steuerelemente zu entwerfen und durchzuführen, vor allem, wenn man diese Technik zum ersten Mal lernt. Das Poking-Eier ohne Injektion, das Injizieren von Puffer + Farbstoff allein oder das Injizieren von Puffer + Farbstoff + ein Kontrollreagenz (wie eGFP dsRNA) sind gute Tests dafür, wie störend verschiedene Elemente des Injektionsprotokolls sein könnten. Siehe Abbildung 3 für die Überlebensfähigkeit einer Reihe verschiedener Steuerelemente. - Beginnen Sie mit einem 4 ml dsRNA aliquot.
- 0,5 ml des gefilterten 10x Injektionspuffers in die dsRNA aliquot geben.
- 0,5 ml von 50 mg/ml Tetramethylrhodam Dextran Farbstofflösung hinzufügen. Wenn Sie an einem Sezieren von Bereichen ohne Fluoreszenz arbeiten, verwenden Sie stattdessen Phenol Red.
- Halten Sie alle Materialien für die Dauer der Injektionszeit auf Eis.
- Die Injektionslösung mit 20 ml Ladespitzen und einer p10 Pipette in eine Injektionsnadel geben.
- Ziehen Sie eine 1,5 ml Injektionslösung auf und legen Sie die Ladespitze in das breite Ende der Injektionsnadel ein.
- Auswerfen Der Lösung so weit wie möglich in die Nadel und beseitigen Luftblasen durch sanftes Streichen; Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu brechen.
- Legen Sie die Schale der Eier unter das Sezieren Mikroskop und wählen Sie eine niedrige Vergrößerung von etwa 10x (1x Vergrößerung durch 10x Augenobjektive betrachtet).
- Setzen Sie die Nadel in das Injektionsgehäuse ein und ziehen Sie sie fest.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Nadel richtig und fest in das Gehäuse eingesetzt wird. Ziehen Sie dazu das breite Ende der Nadel wieder aus dem Metallgehäuse und bringen Sie die Siliziumschläuche in das Gehäuse. Stellen Sie die Siliziumschläuche so ein, dass das Glasende der Nadel direkt über das Silizium hinausragt. Wenn dies nicht geschieht, können die Siliziumschläuche zwischen dem Glas und dem Metallgehäuse eingeklemmt werden, wodurch das Ende der Nadel blockiert wird. - Setzen Sie das Injektionsgehäuse vorsichtig mit einer befestigten Nadel in den Mikromanipulator ein. Achten Sie auf das scharfe Ende der Nadel und achten Sie darauf, dass sie nicht auf Oberflächen gestoßen und gebrochen wird.
- Wenn Sie sowohl die Eier als auch die Nadel durch das Mikroskop betrachten, bewegen Sie die Nadel in der Nähe der Eier in der oberen linken Ecke des Tellergitters.
- Senken Sie die Nadel, bis die Spitze in die HBS plus 1% Penicillin/Streptomycin gepufferte Lösung in der Schale.
- Zentrieren Sie die Nadel im Sichtfeld und bewegen Sie die Eierschale so, dass die Nadel ein paar Mm näher am Rand der Schale als die Eier ist.
- Versperren Sie nicht den Blick auf das Gitter von Eiern mit der Nadel.
- Stellen Sie das Mikroskop auf den Filter, der für Rhodamine geeignet ist, so dass es möglich ist, die Fluoreszenz in der Nadel zu beobachten und sich auf die Spitze der Nadel zu konzentrieren.
- Drehen Sie am Mikroinjektor den BALANCE-Regler langsam im Uhrzeigersinn, bis die Injektionslösung aus der Nadel in die Suspensionslösung austritt. Die Bilanznummer auf dem Bildschirm des Mikroinjektors beginnt zu steigen, obwohl der numerische Wert nicht wichtig ist. Als nächstes drehen Sie den Knopf gegen den Uhrzeigersinn leicht zurück, bis der Farbstoff nicht mehr aus der Nadel austritt.
HINWEIS: Es ist wichtig, dieses Gleichgewicht jedes Mal festzulegen, wenn eine neue Nadel verwendet wird. Ohne das entsprechend eingestellte Gleichgewicht wird der Mikroinjektor noch einige Zeit nach dem Auslösen der Injektion injizieren. Es ist sogar möglich, dass ein einziger Druck des Injektionsknopfes mit einer unsymmetrischen Nadel zum Ausschluss des gesamten Inhalts der geladenen Nadel führt. - Mit der Nadel im Sichtfeld zentriert, bewegen Sie die Eischale, so dass die Nadel auf das Ei gerichtet ist, das zuerst injiziert werden soll. Es wird empfohlen, dass Injektionen in einer Ecke des Gitters von angeordneten Eiern beginnen, zum Beispiel die obere linke Ecke.
- Stellen Sie die Vergrößerung auf ca. 50x ein; bei dieser Vergrößerung füllt ein einzelnes Ei den größten Teil des Sichtfeldes.
- Verwenden Sie sowohl den Mikromanipulator als auch die Hand auf der Eierschale, um die Nadel für die Injektion in Position zu bringen.
- Fördern Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator und setzen Sie die Spitze der Nadel in das erste zu injizierende Ei ein.
- Legen Sie die Nadel bei 20–30% Eilänge vom hinteren (blunter) Ende des Eis (Abbildung 1E), senkrecht zur langen Achse des Eis.
- Injektionslösung entweder mit dem Injektionsfußpedal oder dem Injektionsknopf am Mikroinjektor. Ein kleiner Bolus aus fluoreszierendem Material im Ei zeigt eine erfolgreiche Injektion an (Abbildung 1D).
HINWEIS: Es ist nicht ungewöhnlich, dass etwas Dotter während der Injektion aus dem Ei ausgeworfen wird (Abbildung 1F), und dies deutet nicht unbedingt darauf hin, dass das injizierte Ei unrentabel sein wird. - Ziehen Sie die Nadel aus dem Ei. Wenn das Ei beim Zurückziehen der Nadel unbeabsichtigt aus seinem Brunnen gehoben wird, verwenden Sie kleine Zangen, um das Ei beim Zurückziehen der Nadel wieder in seinen Brunnen zu schieben.
- Wenn die Nadel während der Injektion verstopft, entfernen Sie die Nadel aus dem Ei und, halten Sie die Nadel in der HBS eingetaucht plus 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung, die die Eier bedeckt, löschen Sie die verstopfte Nadel entweder mit der Clear-Funktion oder durch Drücken der Injektion knopf.
- Weiterhin die gleiche Nadel zu verwenden, wiederholen Sie das Injektionsverfahren für so viele Eier wie möglich. Zunächst können es nur etwa 20 oder 30 Eier sein, werden aber mit der Praxis auf über 100 anwachsen.
- Wenn die Nadel verstopft wird und nicht gelöscht werden kann, entsorgen Sie die Nadel, füllen Sie eine neue Nadel und beginnen Sie erneut (d. h. kehren Sie zu Schritt 5.7 zurück).
- Bewahren Sie die Schale der injizierten Eier in einem warmen Inkubator (23,5–26 °C) auf, der leicht feucht ist (um die Verdunstung zu minimieren), bis die Embryonen das gewünschte Entwicklungsstadium für die Analyse erreicht haben.
- Entfernen Sie mindestens alle 24 h Eier, die nicht mehr lebensfähig sind (Abbildung 3A,B), und ersetzen Sie die Suspensionslösung durch frische HBS plus 1% Penicillin/Streptomycin.
- Zwei bis drei Tage nach der Injektion die Eier durch sanftes Pipettieren oder mit Plastikzangen auf mit HBS befeuchtete Papiertücher plus 1% Penicillin/Streptomycin in einer verpfuschen Petrischale übertragen, um die Entwicklung im warmen, feuchten Inkubator fortzusetzen.
- Überwachen Sie die Eier und entfernen Sie Eier, die nicht mehr lebensfähig sind jeden Tag (Abbildung 3A,B).
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Representative Results
Grillen legen leicht Eier in das feuchte Material, und die Bereitstellung von ausreichendem Material, wie feuchter Sand oder Schmutz, veranlasst sie, eine große Anzahl von Eiern zu legen. Dies ist besonders wirksam, wenn Grillen zuerst eilegendes Material für 8–10 h vorenthalten werden. Eier, die in sauberen Sand gelegt werden, können leicht getrennt, gesammelt (Abbildung 1B) und in maßgeschneiderte Eibrunnen zur Injektion gelegt werden (Abbildung 1C). Ein Sezierendes Mikroskop, ein Mikroinjektor und ein Mikromanipulator (Abbildung 1A) können verwendet werden, um einzelne Eier mit einer Vielzahl von Materialien zu injizieren (Abbildung 1D). Die Eier werden in der Nähe des hinteren Endes injiziert, an einem Punkt etwa 20–30% entlang der vorderen-hinteren Achse (Abbildung1E). Die Unterscheidung des spitzeren vorderen Endes vom stumpferen hinteren Ende kann schwierig sein, da diese Unterschiede oft subtil sind (Abbildung 1E). Ein Ei von Seite zu Seite zu rollen hilft oft zu zeigen, welches Ende welches ist. Nach dem Entfernen der Injektionsnadel wird manchmal Eigelb ausgeworfen (Abbildung 1F), obwohl dies die Gesundheit des sich entwickelnden Embryos im Inneren nicht zu beeinträchtigen scheint.
Einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist die Herstellung von abgeschrägten Nadeln. Nach dem Ziehen langer, schlanker Nadeln müssen sie auf einen 20°-Winkel abgeschrägt werden und einen Öffnungsdurchmesser von 10 m haben. Wenn der Durchmesser zu groß ist, tritt die Injektionslösung aus der Nadel aus, und diese Nadeln verursachen große Löcher in Eiern, wodurch die Überlebensraten sinken. Schmalere Nadeln erhöhen die Überlebensfähigkeit, aber wenn sie zu schmal sind, neigen sie dazu, leicht zu verstopfen, was Injektionen langsam und frustrierend macht. Bei einem Nadeldurchmesser von 10 m bei 2 m ist es möglich, bis zu 100 Eier mit einer einzigen Nadel zu injizieren, ohne dass die Nadel verstopft ist.
Nadeln können mit einem Mikroschleifer oder Beveller abgeschrägt werden (Abbildung 2A). Diese Geräte können mit einem mikroskopischen Angeschlossenen erhalten werden, oder man könnte einen Sezieren Bereich auf einem unabhängigen Ständer für Modelle hinzufügen, die das Mikroskop nicht enthalten. Ein kleiner Mikromanipulator hält die Nadel, die in den gewünschten Winkel gekippt und auf die Oberfläche einer rotierenden Schleifebene abgesenkt werden kann, die mit tropfendem Wasser befeuchtet wird. Ein Beispiel für eine gezogene, aber unabgeschrägte Nadel ist in Abbildung 2Bzu sehen, und eine Nadel mit einer 20°-Abschrägung ist in Abbildung 2Cdargestellt. Die Nadeln müssen dann sicher gelagert werden, um Beschädigungen zu vermeiden und sauber zu halten (Abbildung 2D).
Die Einstellung des Gleichgewichts und des Injektionsdrucks auf dem Mikroinjektor sollte es ermöglichen, eine vergleichbare Menge an Material in jedes Ei zu injizieren, das mit derselben Nadel injiziert wird. Die Optimierung der Einspritz- und Ausgleichsdrücke ist beim Wechsel zu einer Nadel mit einem anderen Durchmesser notwendig. Diese Optimierung maximiert die Konsistenz der Injektionsimpulse.
Die Überlebensrate ist ein wichtiger Parameter für die Beurteilung des Erfolgs dieser Experimente. Die meisten toten Eier können leicht durch Das Sehen wie folgt identifiziert werden: das Eigelb und das embryonale Gewebe im Ei beginnen ungleichmäßig zu verklumpen (Abbildung 3A) und schließlich wird der größte Teil des Eigelbs auf eine Seite des Eis esmigr (Abbildung 3B). Bei der Bewertung nach 4–6 Tagen (entspricht den Stadien 8–15)19überlebten mehr als 85 % der nicht injizierten Eier, während Eier, die mit experimentellen Reagenzien injiziert wurden, im Allgemeinen eine niedrigere Überlebensrate aufwiesen (Abbildung3C). Die Kontrolle aller Aspekte der Injektion selbst, einschließlich der Nadelpunktion, der Einführung von Farbstoff und Puffer oder des Vorhandenseins von Fahrzeug oder dsRNA, ist erforderlich, um die wahren Auswirkungen des versuchsexperimentellen Manipulationsversuchs zu verstehen (Abbildung 3C). Je nach experimenteller Manipulation kann mit einem höheren Grad an Letalität gerechnet werden, und man muss möglicherweise den Zeitpunkt des Assays oder den Zeitpunkt der Injektion ändern, um die nicht-tödlichen Auswirkungen der Manipulation zu bewerten.
Die Art und Weise, wie man die phänotypischen Ergebnisse der Injektion beurteilt, hängt davon ab, was injiziert wurde. Zum Beispiel können phänotypische Veränderungen als Folge spezifischer mRNA-Knockdowns auf der Bruttoanatomieebene offensichtlich sein. Beispielsweise unterdrückt das Gen Enhancer von zeste (E(z)) normalerweise Hox-Gene wie Ultrabithorax (Ubx). Das Injizieren von dsRNA für E(z) drückt die E(z)-Funktion herunter und löst die Ubx-Unterdrückung frei, was zu einer ektopischen Ubx-Expression führt. Dies führt zur Umwandlung von fünf Paaren von ventralen Anhängseln (Antenne, Maxilla, Labium, T1 und T2 Bein) in T3 beinähnliche Anhängsel, aufgrund der Unterdrückung von Ubx in diesen Segmenten20. In einem zweiten Beispiel ist es möglich, die GFP-Expression zu verwenden, um die erfolgreiche Einfügung eines Transgens zu assayen. Wenn beispielsweise eine cDNA, die ein eGFP-markiertes Histone 2B-Gen unter der Kontrolle eines G. bimaculatus Actin-Promotors kodiert, mit PiggyBac-Transposase in das Cricket-Genom eingeführt wurde, wurde es möglich, jeden Kern zu visualisieren. im Ei mit Fluoreszenz, um das eGFP-markierte His2B-Protein zu erregen (Abbildung 4C,D). In diesem Fall war es möglich, die Bewegung von Kernen im Laufe der Zeit7zu überwachen.
| Name der Lösung | Komponenten | Kommentare/Beschreibung |
| 10x Injektionspufferlösung | In 1 L H2O hinzufügen: 0.8 g NaCl, 0.09 g Na2HPO4, 0.04 g KH2PO4, 2.98 g KCl | Lagerbestand bei 4 °C lagern. Filtern Sie eine kleine Menge unmittelbar vor der Verwendung mit einer 1 ml Spritze, die mit einem 0,45 m Spritzenfilter ausgestattet ist. Wiederholen Sie dies bei Bedarf, um ca. 500 l Injektionslösung zu filtern. Halten Sie gefilterte Injektionslösung auf Eis für die Dauer des Experiments. |
| HEPES gepufferte Saline | In 1 L H2O hinzufügen: 8.77 g NaCl, 5.2 g HEPES, | pH bis 7,0 und bei 4 °C lagern. |
| Tetramethyl Rhodamine Dextran (10.000 MW) Farbstoff-Lagerlösung | Rhodamine Farbstoff von Thermofisher | Dieser Farbstoff wird oft als lyophilisiertes Pulver verkauft. In diesem Fall bilden Sie eine Stammlösung von 50 mg/ml mit Wasser. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min, um unlösliche Partikel zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand nach der Zentrifugation, vermeiden Sie Partikel an der Unterseite des Rohres, aliquot und gefrieren bei -20 °C. Die im Einsatz stehenden Lager-Aliquots können ein bis zwei Wochen bei 4 °C gehalten werden. Vermeiden Sie das Einfrieren von Aliquots mehrmals. Wenn Nadeln durch Farbstoff verstopft sind, kann der Farbstoff auch durch Whatman #2 Filterpapier gefiltert werden. |
Tabelle 1: Lösungsrezepte und Notizen.
Abbildung 1: Übersicht des Eiinjektionsprotokolls. (A) Eine typische Einrichtung, die für Eiinjektionen verwendet werden kann. (B) Eier werden über ein Sieb vom Sand getrennt. (C) Eier werden zur Injektion in kleine Brunnen gehalten, die durch Das Einlegen einer Form in warme, flüssige Agrose hergestellt werden. (D) Fluoreszenz in der Nadel und in fünf injizierten Eiern kann durch das fluoreszierende Sezierenmikroskop gesehen werden. (E) Ein nicht injiziertes Ei. Das vordere Ende (leicht spitz; links) und das hintere Ende (stumpfer; rechts) unterscheiden sich voneinander. Die für die Injektion am besten geeignete Region in der Nähe des hinteren Endes wird mit der Halterung angezeigt. (F) Ein Ei zwei Tage nach der Injektion. Die Injektionsstelle ist als leichte Verfärbung sichtbar, und eine kleine Menge von ausgestoßenem Eigelb ist offensichtlich (Pfeil). Skalenbalken = 1 mm (D); 0,5 mm (E und F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Nadeln werden mit einem Mikroschleifer oder Abschräger abgeschrägt. (A) Ein Beispiel für einen Mikroschleifer mit einer kreisförmigen, sich drehenden Schleiffläche, die durch tropfendes RO-Wasser befeuchtet wird (Wasser tropft aus der Spritze oben im Bild). (B) Vor dem Abschrägen sind gezogene Nadeln lang und schmal. (C) Nach dem Abschrägen auf 20° entsteht eine scharfe Injektionsnadel. Beachten Sie den Durchmesser des inneren Lumens um 10 m. (Rote Skalenbalken = 10 m). (D) Gezogen, abgeschrägte Nadeln können in einer Petrischale mit einem Deckel gelagert und mit Zahnwachs an Ort und Stelle gehalten werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Injektionen können die Überlebensrate verringern. (A) Tote und sterbende Eier sind bei der Sichtkontrolle offensichtlich. (B) Im Laufe der Zeit wird das Material auf eine Seite des Eis wandern. (C) Vergleich der Überlebensraten vier bis sechs Tage nach der Eiablage für eine Vielzahl von Bedingungen, einschließlich: nicht injizierte Eier (n = 6 Versuche); Eier, die mit einer 9-m-Nadel punktiert, aber nicht injiziert werden (n = 2 Experimente); Eier mit Puffer und Farbstoff injiziert (n = 13 Experimente); Eier mit Puffer, Farbstoff und Plasmidvektor injiziert (n = 2 Experimente); Eier mit Puffer, Farbstoff und DMSO injiziert (n = 11 Experimente); und Eier, die mit Puffer, Farbstoff und Kontroll dsRNA injiziert werden (n = 22 Experimente). Die Art der verwendeten Kontroll-dsRNA umfasste dsRNA gegen eGFP oder dsRed. Die Zahlen an der Basis jedes Balkens notieren die Gesamtzahl der überlebenden Eier / Gesamteier, die für jede Bedingung verwendet werden. Fehlerbalken stellen einen Standardfehler des Mittelwerts dar. Skalenstange = 1 mm (A und B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bewertung der Injektionsergebnisse. (A-B) Die Injektion von Enhancer von Zeste (E(z)) dsRNA verändert die normale Expression von Ubx mRNA (wilder Typ in (A) und führt zur Umwandlung von Antennen (AN) und Mundpartien (Mx, Lb) in beinähnliche Anhängsel (B). (C-D) Die Injektion von frühen Eiern mit dem transponierbaren Element piggyBac und histone2B-eGFP produziert transgene Embryonen, die GFP in allen Kernen exemittieren. Lage der Kerne kann 8 h nach der Eiablage beobachtet werden (C) und 20 h nach der Eiablage (D). Abkürzungen: An = Antenne; Mx = maxilla; Lb = Labium; T1-3 = Brustbeine 1 bis 3; RNAi = RNA-Interferenz; Gb = G. bimaculatus; Akt = Actin; H2B = Histon H2B; GFP = grünes fluoreszierendes Protein. Skalenstäbe = 200 m (A und B); 500 m (E und F). Diese experimentellen Ergebnisse wurden ursprünglich an anderer Stelle beschrieben7,20. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die beiden größten Herausforderungen bei dieser Technik sind die damit verbundenen Fragen der optimalen Nadelgröße und Überlebensfähigkeit. Obwohl kleinere Nadeln die Überlebensfähigkeit verbessern, haben Nadeln mit schmaleren Lumen ein höheres Maß an Kapillarkräften bei der Arbeit, was es wahrscheinlicher macht, dass sich Dasgelb in die Nadel bewegt, wodurch es verstopft wird. Im besten Fall können Verstopfungen einfach durch Injektion eines anderen Eis oder durch Löschen der Nadel wie oben beschrieben beseitigt werden. Man kann auch versuchen, den Gleichgewichtsdruck auf den Mikroinjektor zu erhöhen, bis das Eigelb aus der Nadel geschoben wird. Die andere große Herausforderung mit dieser Technik ist die Überlebensfähigkeit. In unseren Händen liegen die Überlebensraten für Eier, die mit experimentellen Lösungen injiziert werden, in der Regel zwischen 40 und 80%. Die Überlebensraten können für diejenigen, die anfangen, diese Technik zu erlernen, so niedrig wie 10 % betragen, werden sich aber mit der Praxis verbessern. Negative Kontrollen, wie oben beschrieben, sind für die Forscher wichtig, um Veränderungen der Überlebensrate mit der Praxis genau zu beurteilen, da die Einführung verschiedener Materialien die Überlebensraten senken kann (Abbildung 3C).
Der Zeitpunkt der Injektionen ist auch für jeden experimentellen Ansatz eine wichtige Überlegung. Ältere Eier sind schwieriger zu injizieren als jüngere, und im Allgemeinen sind die Überlebensraten höher, wenn jüngere statt ältere Eier injizieren. Die Einführung der Nadel und des injizierten Materials in späteren Stadien kann zu unbeabsichtigten anatomischen Schäden führen. Mit Erfahrung ist jedoch eine Injektion von zwei- bis drei Tage alten Eiern möglich. Die Dorsale Seite des Eis in diesen Stadien zu zielen hilft, schäden am Embryo zu vermeiden, der sich zuerst auf der ventralen Seite bildet. Die Ausrichtung auf das hintere Ende kann den Zugang zu Reagenzien und keimbandbildung, die in der Nähe dieses Endes des Eis auftreten, erhöhen19,21. Wenn man versucht, das Genom zu manipulieren, mit dem Ziel, entweder eine weit verbreitete somatische oder Keimbahnübertragung der Genommodifikation zu erreichen, sollten Injektionen vor der Zellulisierung durchgeführt werden, die etwa 14 h nach der Eiablage beginnt19 . Wenn dsRNA in den mRNA-Spiegel eingebracht wird, sollte das Zeitfenster für Injektionen auf der Grundlage bestimmt werden, wie früh in der Entwicklung man ein Gen von Interesse niederschlagen möchte. Während die Auswirkungen von RNAi wahrscheinlich für einige Zeit dauern, dsRNA muss im Voraus eingeführt werden, zu dem man plant, änderungen des Phänotyps zu bewerten. Es kann wichtig sein, die Zeit während der Injektion und das Fortschreiten der embryonalen Entwicklung im Auge zu behalten, um sicherzustellen, dass die richtigen Eier im Stadium injiziert werden. Unabhängig davon, welches Material injiziert wird, sind Entwicklungsverzögerungen nach der Injektion üblich, obwohl der Grad der Verzögerung je nach Injektor variieren kann.
Das hier vorgestellte Protokoll stützt sich auf eine Reihe von relativ teuren Geräten. Es sollte jedoch möglich sein, Eier erfolgreich zu injizieren, ohne dass einige oder sogar alle dieser Gegenstände verwendet werden. Zum Beispiel gibt es eine Vielzahl von Mikroinjektoren auf dem Markt, und einige können billiger als die in der Tabelle der Materialienvorgeschlagen . Es ist auch möglich, einfach eine Spritze zu verwenden, um eine angemessene Menge an Material zu injizieren, obwohl dies einige Übung nehmen würde. Anstelle eines teuren Mikromanipulators könnte man eine Vielzahl von Materialien verwenden, um die Nadel stabil zu halten und einen langsamen, kontrollierten Fortschritt zu ermöglichen, und ein einfaches Kunststoff-Design wurde von anderen verwendet22. Es kann auch möglich sein, den Einsatz eines Bevellers zu vermeiden, obwohl nach unserer Erfahrung richtigeS Abschrägen einen enormen Unterschied zum Erfolg von Injektionen machen kann. Es kann möglich sein, eine gezogene Nadel zu schärfen, indem man die Spitze der Nadel von Hand über feinstes Sandpapier zieht und diesen Prozess unter dem Mikroskop bewertet. Unabhängig davon, geschärfte Nadeln werden Injektionen einfacher und verbessern Überlebensfähigkeit.
Diese Injektionstechnik ist flexibel und kann für eine Vielzahl von verschiedenen Manipulationen verwendet werden. Hier haben wir Ergebnisse für dsRNA- und piggyBac-abhängige genomische Modifikationsexperimente gezeigt, aber es ist auch möglich, CRISPR/Cas oder andere Ansätze mit dieser Technik zu verwenden. In den hier enthaltenen Experimenten waren die daraus resultierenden Phänotypen offensichtlich und leicht zu beurteilen. Einige Experimente erfordern möglicherweise die Verwendung von Immunhistochemie oder anderen Visualisierungswerkzeugen, um die Auswirkungen experimenteller Manipulation zu sehen. Eine Alternative zu Injektionen ist die Verwendung von Elektroporation, die verwendet werden kann, um DNA oder andere Makromoleküle in Zellen und Gewebe in vivo einzuführen. Elektroporation kann in älteren Cricket-Eiern verwendet werden, wo Embryonen bereits gebildet haben, um bestimmte Regionen zu zielen8, aber Injektion ist nützlicher, wenn das Experiment erfordert, dass der gesamte sich entwickelnde Embryo gezielt ist. Diese Injektionstechnik sollte auch leicht anpassungsfähig für den Einsatz in Eiern aus einer Vielzahl von verschiedenen hemimetabolen und holometabolösen Insekten sein, idealerweise verbesserungsfähig die Fähigkeit, sinnvolle vergleichende Studien durchzuführen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die in diesem Projekt berichtete Forschung wurde durch einen Institutional Development Award (IDeA) des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20GM10342 bis HH3 und durch die NSF-Vergabenummer IOS-1257217 an Cge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
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