Summary
여기에서 우리는 크리켓 계란을 주입하는 프로토콜을 제시, 크리켓의 많은 실험에서 기초 방법 역할을하는 기술, 포함하되 이에 국한되지 않음, RNA 간섭 및 게놈 조작.
Abstract
개발 유기체에서 유전자 기능을 변경하는 것은 다양한 종류의 실험의 중심입니다. 엄청나게 강력한 유전 공구가 전통적인 모형 시스템에서 개발되는 동안, 대부분의 그밖 유기체에 있는 유전자 또는 메신저 RNA (mRNA)를 조작하는 것은 어렵습니다. 동시에, 진화및 비교 접근법은 많은 다른 종에 있는 유전자 기능의 탐사에 의존합니다, 현재 유전으로 견인할 수 있는 외부 표현을 조작하기 위한 기술의 발달 그리고 적응을 필요로 합니다 종. 이 프로토콜은 배아 또는 애벌레 발달에 주어진 조작의 효력을 분석하기 위하여 크리켓 계란으로 시약을 주입하는 방법을 기술합니다. 벨바늘로 계란을 수집하고 주입하는 방법에 대한 지침이 설명되어 있습니다. 이 비교적 간단한 기술은 유연하고 잠재적으로 다른 곤충에 적응할 수 있습니다. 하나는 수집하고 하나의 실험에 계란 수십 주입 할 수 있습니다, 버퍼 전용 주사에 대한 생존율은 연습으로 개선하고 80 %로 높을 수 있습니다. 이 기술은 약리학 에이전트의 주입을 포함하여 실험적인 접근의 몇몇 모형을 지원할 것입니다, 관심있는 유전자를 표현하기 위하여 시험관 외에서 덮인 mRNA, RNA 간섭을 달성하기 위하여 이중 좌초된 RNA (dsRNA), 군집된 정규의 사용 CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) 시약과 함께 협착한 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPR) 및 과도 또는 안정적인 형질전환 라인을 생성하기 위한 트랜스포저 블론트.
Introduction
유기체에서 게놈을 수정하거나 유전자 발현에 영향을 미치는 능력은 기능적 인과관계를 테스트하는 많은 유형의 실험설계의 기초가 된다. 또한 전통적인 유전 실험실 동물 모델 시스템(예: Mus musculus,Danio) 외부의 유기체에서 게놈 및 비게놈 변형 기술을 사용할 수 있는 비교 및 진화학적 관련 작업에도 중요합니다. rerio, 드로필라 멜라노가스터,그리고 케노하브디티스 예쁜꼬마선충). 생물다양성1을 이해하려는 욕구이든, 크로의 원리를 고수하는 것이든, 모든 생물학적 질문에 대해 그 해결책2,3,게놈을 수정할 수 있는 능력에 가장 적합한 유기체가 있다는 것입니다. 현대 실험 설계에 필수적인 유전자 발현에 영향을 미칩니다.
크리켓 그릴루스 바이마쿨라투스는 신흥 모델 시스템입니다. 신경과 실험 4에서 지난 세기동안 사용, 지난 2 년 은 특히이 유기체의 진화와 개발에 초점을 맞춘 크리켓에 대한 증가 된 실험적 관심을 목격했다5. 크리켓은 D. 멜라노가스터와 트리볼륨 카스타뇌6과같은 잘 연구된 홀로메타볼루스 곤충에 기초로 분기하는 헤미메타볼루블 곤충이다. 진화 나무에 그것의 유용한 위치 때문에, 과학자들은 이 곤충에 있는 현대, 정교한 실험적인 질문을 하는 것에 흥미, G. bimaculatus에있는 사용을 위한 분자 공구 적응에 있는 증가로 이끌어 냈습니다.
크리켓 계란에 분자 시약의 주사는 배아에서 유전자 발현의 비 게놈 조작뿐만 아니라 게놈 수정 실험에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, eGFP 삽입을 운반하는 형질전환 G. 바이마쿨라투스는 트랜스포사제 피기박7,8을사용하여 생성되었다. 연구자들은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFNs) 및 전사 활성제(TAL) 이펙터 뉴클레아제(TALENs)를 사용하여 특정 게놈 영역에서 이중 가닥 의 분리를 도입하는 녹아웃 G. 바이마쿨라투스를 성공적으로 생성하였다9. ZFN과 TALENs는 4대 모델 시스템을 넘어서는 동물에 대한 사이트별 타겟팅을 허용하지만, 이러한 시약은 사용하기 쉽고 효율적이며 매우 유연한CRISPR/Cas9 시스템을 통해 빠르게 능가되었습니다 10. CRISPR은 G. bimaculatus에서 녹아웃11뿐만 아니라 노크 인 라인12,13 게놈 수정 이외에, dsRNA는 개발에 mRNA 발현을 노크하기 위해 계란에 주입 될 수있다 배아, 조사자가 개발 전반에 걸쳐 특정 성적 증명서의 역할을 이해할 수 있도록14,15. 크리켓 계란을 주입하는 방법에 대한 몇 가지 제한된 세부 사항은 이전에 게시 되었습니다12.
여기에서, 우리는 초기 G. bimaculatus 계란을 주입하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 효과적이고 다양한 실험실 설정, 사출 재료 및 기타 곤충에 쉽게 적응할 수 있습니다. 게놈 수정 및 녹다운 실험을 설계하고 구현하기 위한 추가 세부 사항이12,13다른 곳에 게시되었지만, 이러한 접근법은 궁극적으로 여기에 상세한 주입 프로토콜에 의존할 것이다.
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Protocol
1. 하드웨어 설정 및 재료 준비
참고: 솔루션, 시약 및 장비 세부 사항에 대한 준비는 표 1 및 재료 표를 참조하십시오.
- 계란을 보고 주사 바늘을 안내 하기 위해 해부 현미경을 설정 합니다. (그림1A는 형광이 장착된 해부 현미경을 나타낸다.) 형광 능력은 유리하지만 필요하지 않습니다.
- 주사 바늘을 제자리에 기동하기 위해 3축 마이크로조작기를 배치합니다(그림 1A).
- 소량의 재료를 주입하기 위해 튜브와 바늘 홀더가있는 마이크로인젝터를 설정합니다 (그림 1A). 선택적으로 그림에 표시되지 않는 풋 페달을 사용합니다.
- 3D 프린터 또는 레이저 조각기로원하는 패턴의 역인쇄를 통해 계란용 우물을 만들 수 있는 스탬프를 디자인하고 생성합니다(그림 1C).
참고: 표시된 3D 인쇄 샘플 스탬프는 4.5 cm x 5cm이며 128, 3cm x 1cm x 1mm 돌출부로 개별 우물을 생성합니다. 다양한 사용자 정의 금형을 만드는 방법에 대한 자세한 내용은16다른 곳에서 게시되었습니다. - 10x 주입 버퍼, HEPES 완충식염수(HBS) 및 테트라메틸호다민 덱스트렌 염료의 스톡 용액을 준비하고 4°C에서 보관합니다.
- dsRNA, CRISPR/Cas912,트랜스포저블 원소, 체외 캡식 mRNA7,8,약리제17,ZFNs 또는 TALENS9와같은 주입할 실험용 액을 준비한다.
- 유리 슬라이드 위에 플랫폼 1mm 정도를 만들기 위해 유리 현미경 슬라이드에 표준 실험실 테이프의 여러 층에 이중 스틱 테이프를 놓고, 이는 평가를 위해 바늘을 유지하는 데 사용됩니다.
- 공기 순환을 위해 메쉬 로 덮인 개구부를 가지고 뚜껑으로 약 40cm x 60cm 크기의 크리켓 용기를 준비하십시오.
- 음식, 물, 보호 재료를 추가합니다.
- 수십 명의 건강한 남성 및 여성 성인 크리켓을 추가하십시오. 날개의 존재에 의해 성인 크리켓을 식별합니다.
참고: 사후 상상력 시대의 범위는 계란 수율을 증가시킬 수 있습니다. 크리켓의 밀도는 실험을위한 충분한 계란을 수집 할 수 있도록 상대적으로 높어야하지만, 식인 풍습이 발생하는 너무 혼잡하지 않아야합니다. 예를 들어, 약 2다스 건강한 크리켓, 대략 동일한 남성 대 여성 비율, 위에서 언급 한 크기의 용기에 1 ~ 2 시간 기간에 약 200 개의 계란을 수집하기에 충분해야한다. 크리켓은 실온에서 보관할 수 있지만, 크리켓이 따뜻한 (23.5-26 °C), 습기 (40 - 60 % 상대 습도) 인큐베이터에서 유지되면 개발 및 행동이 최적입니다.
2. 주입을 위한 바늘 만들기
- 필라멘트가 있는 보로실리케이트 유리 모세혈관을 사용합니다(크기 세부 사항은 재료 표 참조). 같은 날 또는 주사가 완료되기 며칠 전까지 당겨 바늘을 준비하십시오.
- 모세관 유리를 풀러에 넣고 필라멘트 에 유리를 중앙에 놓고 손잡이를 조여 유리를 제자리에 고정시십시오.
- 유리 램프 온도 근처의 풀러 온도를 설정합니다(-5°C ~ +10°C).
- 단일 단계, 고열 프로토콜을 사용하여 작은 개구부로 긴 테이퍼를 당기고 끝이 닫히지 않도록하십시오.
참고: 예를 들어, 박스 필라멘트가 장착된 재료 표에 상세히 기술된 마이크로파이펫 풀러를 사용하는 경우, 램프 온도가 478인 유리에 대해 다음 매개변수를 사용한다: 열 478; 당기기 45; 벨 75; 델 120. 도 2B에 나타낸 형상으로 바늘을 제조하기 위한 최적의 조건은 각 사용자에 의해 경험적으로 결정되어야 한다. - 주사를 준비하는 베벨 바늘 팁.
- 베블러의 회전 분쇄기 평면을 적시고 (그림2A)떨어지는 물로 적시다. 역삼투압(RO) 또는 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리된 증류수를 사용하십시오.
- 당겨진 바늘을 베벨러에 넣고 20° 각도로 돌립니다.
- 바늘을 내리고 분쇄기에 닿을 때까지 2-3 분 동안 경작하십시오.
- 유리 현미경 슬라이드에 부착 된 이중 스틱 테이프에 경사진 바늘을 배치하여 경사를 평가합니다.
- 카메라 및 이미지 수집 소프트웨어가 장착된 복합 현미경의 무대에 바늘을 들고 슬라이드를 놓습니다.
- 20배 대목표를 사용하여 바늘 팁 이미지를 획득합니다.
- 이미징 소프트웨어를 사용하여 바늘의 내부 내강 직경을 경구 개구부와근접하여 측정합니다(도 2C). 최적의 크기는 10 μm + 2 μm입니다.
- 8 μm 이하 및 12 μm 이상의 개구부가있는 바늘을 버리십시오.
- 먼지가 쌓이는 것을 방지하기 위해 뚜껑이 있는 용기에 바늘을 보관하십시오. 팁이 깨지지 않도록 용기 바닥에서 바늘을 높이기 위해 왁스 또는 이와 유사한재료의 스트립을 사용합니다(그림 2D).
3. 계란 수집 및 준비
- 밤새 또는 계란을 수집하기 전에 적어도 8-10 시간 동안 모든 습한 누워 재료 (물 유리병, 계란 요리)의 크리켓을 박탈하여 누워 계란의 수를 극대화.
참고: 여성은 내부적으로 정자를 저장하는 능력을 가지고 있기 때문에, 신중하게 시기 를 정한 수정이 실험적으로 필수적인 경우 다르게 시기 정된 절차가 필요할 수 있습니다18. - 물에 아가로즈 1%의 40 mL을 만들고 10cm 페트리 접시에 붓습니다.
- 아가로즈 표면에 달걀 우물 스탬프를 놓습니다.
- 우표를 제거하고, 아가로즈가 고화되면, 우물을 드러낸다(그림1C).
- 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 HBS로 아가로즈 웰 플레이트를 채웁니다.
- 접시에 뚜껑을 놓고 파라필름으로 싸서 4 °C에서 보관하십시오.
참고: 접시는 4 °C에서 며칠 동안 보관할 수 있지만 결로를 피하기 위해 사용하기 전에 실온까지 따뜻하게해야합니다. - 흰 놀이터 모래 (그림 1B)와 35mm 페트리 접시를 작성하여계란을 낳는 크리켓에 대한 계란 수집 접시를 확인합니다.
참고: 재료 표에 지정된 모래는 적절한 입자 크기입니다. 모래 알갱이가 너무 크면 모래가 달걀을 손상시게 됩니다. - 달걀 접시를 약 18cm x 18cm로 자른 종이 타월로 덮고 접시 위에 모래를 뿌합니다. 이 종이 타월을 통해 채워진 접시를 수돗물로 덮습니다.
- 페트리 접시를 기울이고 상단을 부드럽게 짜서 여분의 물을 제거합니다.
- 접시 아래에 종이 타월 사각형의 모서리를 감싸고 종이 타월 커버를 제자리에 유지하는 데 도움이되는 거꾸로 된 뚜껑에 달걀 접시를 놓습니다.
- 계란 접시를 크리켓 빈에 넣고 성인 암컷이 1 ~ 2 시간 동안 계란을 oviposit 할 수 있습니다.
참고: 여기에 상대적으로 짧은 시간은 모든 계란이 주입 시 개발 단계에서 유사할 것을 보장합니다. 세포화 전에 주사가 중요한 경우, 주사는 내 발생해야 14 계란 누워의 시간19. - 한편, 아가로즈 접시(3.6단계부터)를 주입용 계란을 보관할 준비를 하여 실온으로 따뜻하게 한다.
- 이제 갓 낳은 달걀이 들어있는 달걀 을 크리켓 빈에서 제거하고 종이 타월 커버를 제거합니다. 적어도 500 mL 용량의 비커 위에 0.5-1 mm의 기공 크기의여과기를 놓습니다 (그림 1B).
- 달걀 누워 접시 (모래와 계란)의 내용을 부드럽게 흐르는 수돗물 아래 스트레이너에 헹구어 모래 알이 스트레이너 메쉬를 통해 물속으로 떨어지지만 스트레이너 바구니에 크리켓 계란을 남깁니다.
- 용기에 RO 물을 채우고 트레이에 놓습니다. 용기 위에 스트레이너를 반전시키고 접시에 대고 두드려 계란을 물에 빼내세요. 계란은 용기의 바닥에 가라 앉을 것입니다.
- P1000 파이펫 팁의 팁을 가위로 잘라 직경 약 3mm의 개구부를 만듭니다. 이 팁을 P1000 파이펫터에 놓고 용기에서 아가로즈 계란 몰드 접시로 계란을 옮기고 가능한 한 적은 물을 옮김하십시오.
- 플라스틱 핀셋을 사용하여 HBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 채워진 아가로즈 우물에 계란을 줄만 있습니다. 각 계란은 개인의 바닥에 잘 가라 앉을 것입니다. 주입할 준비가 될 때까지 페트리 접시 뚜껑으로 덮습니다.
4. 마이크로 인젝터 준비
- 마이크로 인젝터를 압축 공기 또는 가스 소스에 부착합니다(이 프로토콜은압축 공기 또는 N 2를 사용하여 최적화되었습니다).
참고: 휴대용 공기 탱크를 사용하는 경우 적어도 75 psi로 채우하십시오. 탱크는 주사 전체에 걸쳐 공기 압력을 잃게되며 다시 채워야 할 수도 있습니다. 주사는 40psi 이하어렵게 됩니다. - 마이크로 인젝터를 켭니다. 주입 시간을 0.17s로 설정하고 압력을 10-15 psi로 설정합니다.
참고: 필요한 정확한 압력은 바늘의 개구부에 따라 달라지며 사용되는 모든 주사 및 / 또는 새로운 바늘에 대해 경험적으로 결정해야합니다. - 마이크로인젝터의 BALANCE 노브가 0(일반적으로 완전히 시계 반대 방향으로) 켜져 있고 마이크로 인젝터가 가압및 주입 모드에 있는지 확인합니다.
5. 주사
- 1 mL 주사기 및 0.45 μm 주사기 필터를 사용하여 10x 주입 버퍼의 약 500 μL을 필터링합니다.
- 혼합 주입 시약(다음에 하는 세부 사항은도 12에기재된 바와 같이 제조된 dsRNA의 주사를 위한 것이다).
참고: 특히 이 기술을 처음 학습할 때 여러 컨트롤을 설계하고 수행하는 것이 좋습니다. 주입없이 계란을 찌르고, 버퍼 + 염료를 단독으로 주입하거나, 버퍼 + 염료 + 제어 시약 (예 : eGFP dsRNA)을 주입하는 것은 주사 프로토콜의 다양한 요소가 얼마나 파괴적인지에 대한 좋은 테스트입니다. 여러 가지 다른 컨트롤의 생존 가능성은 그림 3을 참조하십시오. - 4 mL dsRNA aliquot로 시작합니다.
- dsRNA aliquot에 여과된 10x 주입 버퍼의 0.5 mL를 추가합니다.
- 0.5 mL의 50 mg/mL 테트라메틸 로다민 덱스트란 염료 스톡 솔루션을 추가하십시오. 형광없이 해부 범위에서 작업하는 경우, 대신 페놀 레드를 사용합니다.
- 주입 기간 동안 모든 물질을 얼음 위에 보관하십시오.
- 20 mL 로딩 팁과 p10 파이펫을 사용하여 사출 용액을 사출 바늘에 로드하십시오.
- 1.5 mL 주입 용액을 그리고 로딩 팁을 주입 바늘의 넓은 끝에 삽입합니다.
- 가능한 한 바늘로 솔루션을 꺼내 부드럽게 쓸어 기포를 제거; 바늘이 부러지지 않도록 주의하십시오.
- 계란의 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 약 10 배 (10 배 눈 목표를 통해 볼 1 배 배율)의 낮은 배율을 선택합니다.
- 주사 하우징에 바늘을 삽입하고 조입니다.
참고: 바늘이 하우징에 적절하고 단단히 삽입되도록 주의하십시오. 이렇게하려면, 그것으로 하우징에 실리콘 튜브를 가져, 금속 하우징에서 다시 바늘의 넓은 끝을 당겨. 실리콘 튜브를 조정하여 바늘의 유리 끝이 실리콘 바로 너머로 돌출되도록합니다. 이 작업을 수행하지 않으면 실리콘 튜브가 유리와 금속 하우징 사이에 끼어 바늘 끝을 막을 수 있습니다. - 조심스럽게 마이크로 매니더레이터에 부착 된 바늘로 주입 하우징을 삽입합니다. 바늘의 날카로운 끝을 인식하고 표면에 부딪히지 않고 부러지지 않도록주의하십시오.
- 현미경을 통해 계란과 바늘을 모두 보면서 접시 그리드의 왼쪽 상단 모서리에있는 계란 근처의 바늘을 움직입니다.
- 팁이 HBS에 들어가고 접시에 1% 페니실린/스트렙토마이신 완충액이 들어갈 때까지 바늘을 낮춥습니다.
- 시야의 바늘을 중앙에 두고 계란 접시를 움직여 바늘이 계란보다 접시 가장자리에 몇 mm 더 가까워지도록 합니다.
- 바늘로 계란 격자의 보기를 방해하지 마십시오.
- 로다민에 적합한 필터에 현미경을 설정하여 바늘의 형광을 관찰하고 바늘 끝에 초점을 맞출 수 있습니다.
- 마이크로인젝터에서 사출 용액이 바늘에서 서스펜션 용액으로 새기 시작할 때까지 BALANCE 노브를 시계 방향으로 천천히 돌립니다. 숫자 값은 중요하지 않지만 마이크로 인젝터 화면의 균형 번호가 증가하기 시작합니다. 다음으로, 염료가 바늘에서 새는 것을 멈출 때까지 손잡이를 시계 반대 방향으로 약간 돌립니다.
참고: 새로운 바늘을 사용할 때마다 이 균형을 설정하는 것이 중요합니다. 균형이 적절하게 설정되지 않으면, 마이크로 인젝터는 주사가 트리거 된 후 잠시 동안 주입을 계속합니다. 불균형 바늘로 분사 버튼을 한 번 누르면로드 된 바늘의 전체 내용이 추방 될 수도 있습니다. - 시야를 중심으로 바늘을 중심으로 바늘이 먼저 주입될 계란을 겨냥하도록 계란 접시를 움직입니다. 주사는 배열 된 계란의 격자의 한 구석에서 시작하는 것이 좋습니다, 예를 들어, 왼쪽 상단 모서리.
- 배율을 약 50배로 조정; 이 배율에서, 하나의 계란은 시야의 대부분을 채울 것입니다.
- 마이크로 매니더레이터와 한 손을 계란 접시에 사용하여 주사를 위해 바늘을 제 자리로 옮김하십시오.
- 미세 조작기를 사용하여 바늘을 전진시키고 주사할 첫 번째 계란에 바늘의 끝을 삽입합니다.
- 계란의 후부 (blunter) 끝에서 20-30 % 계란 길이에 바늘을 삽입 (그림1E),계란의 긴 축에 수직.
- 사출 풋 페달 또는 마이크로 인젝터의 사출 버튼으로 용액을 주입하십시오. 난자 내부의 형광 물질의 작은 볼러스는 성공적인주사를 나타냅니다 (그림 1D).
참고: 일부 노른자는 주입 중에 계란에서 배출되는 것이 드문 일이 아니며 (그림1F),이것은 반드시 주입 된 계란이 불가능할 것이라는 것을 나타내지는 않습니다. - 달걀에서 바늘을 철회하십시오. 계란이 바늘을 철회 할 때 의도치 않게 우물에서 들어 올린 경우, 바늘을 철회하면서 작은 집게를 사용하여 계란을 우물로 밀어 넣습니다.
- 주사 하는 동안 바늘 막힘 경우, 계란에서 바늘을 제거 하 고, HBS 플러스 에 잠긴 바늘을 유지 1% 페니실린/스트렙토 마이신 용액 계란을 덮고, 명확한 기능을 사용 하 여 막힌된 바늘을 취소 또는 주입을 밀어 단추.
- 같은 바늘을 계속 사용 하 여 가능한 한 많은 계란에 대 한 주입 절차를 반복. 처음에는 20~30개의 계란만 있지만 연습을 통해 100개 이상으로 증가할 것입니다.
- 바늘이 막히고 지울 수없는 경우, 바늘을 버리고 새 바늘을 채우고 다시 시작하십시오 (즉, 5.7 단계로 돌아갑니다).
- 배아가 분석을 위해 원하는 개발 단계에 도달할 때까지 약간 습한 따뜻한 인큐베이터(23.5-26°C)에 주입된 계란접시를 보관합니다.
- 적어도 매 24 시간마다 더 이상 생존 할 수없는 계란을 제거하고 (그림3A,B), 서스펜션 용액을 신선한 HBS와 1 % 페니실린 / 스트렙 토마이신으로 교체하십시오.
- 주입 후 2 ~3 일, 부드러운 파이펫팅또는 플라스틱 집게로 계란을 HBS플러스 뚜껑이 달린 페니실린 / 스트렙토 마이신 1 %로 적신 종이 타월로 옮겨 따뜻하고 습한 인큐베이터에서 개발을 계속하십시오.
- 계란을 모니터링하고 매일 더 이상 실행 가능하지 않은 계란을 제거합니다 (그림3A,B).
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Representative Results
크리켓은 촉촉한 재료에 알을 쉽게 낳고, 습한 모래 나 먼지와 같은 적절한 재료를 제공하면 많은 수의 알을 낳도록 유도합니다. 이것은 크리켓이 깨끗한 모래에 놓인 8-10 h. 계란을 먼저 알 을 박탈하는 경우에 특히 효과적이다 쉽게 분리, 수집 (그림1B)주입을위한 사용자 정의 설계 계란 우물에 배치 (그림1C). 해부 현미경, 마이크로인젝터 및 마이크로매니퓰레이터(그림1A)는 다양한 물질로 개별 계란을 주입하는데 사용될 수 있다(도1D). 계란은 전방 후방 축을 따라 약 20-30 %에서 후방 끝 근처에 주입됩니다(그림1E). 이러한 차이는 종종 미묘하기 때문에 더 무딘 후방 말단으로부터 더 뾰족한 전방단부들을 구별하는 것은 어려울 수 있다(도 1E). 계란을 좌우로 굴리면 어느 쪽 끝이 있는지 밝히는 데 도움이됩니다. 주사 바늘의 제거 후, 난자 노른자는 때때로 배출된다 (그림1F),이것은 내부 개발 배아의 건강을 손상하지 않는 것처럼 보이지만.
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 경마 바늘의 준비입니다. 길고 날씬한 바늘을 당긴 후 20 ° 각도로 경유되어야하며 개구름은 10μm (± 2 μm)입니다. 직경이 너무 크면 주사 액이 바늘에서 누출되고 이 바늘은 계란에 큰 구멍을 만들어 생존율을 감소시게 됩니다. 좁은 바늘은 생존력을 증가하지만, 너무 좁으면 쉽게 막히는 경향이있어 주사가 느리고 실망스럽습니다. 바늘 직경이 10 μm ±2 μm인 경우, 바늘 막힘 없이 단일 바늘로 100개의 계란을 주사할 수 있다.
바늘은 마이크로 그라인더 또는 베벨러(그림2A)로베벨될 수 있다. 이러한 장비는 현미경을 부착하여 얻을 수 있거나, 현미경을 포함하지 않는 모델에 대한 독립적인 스탠드에 해부 범위를 추가할 수 있습니다. 작은 마이크로 조작기는 원하는 각도로 기울어지고 떨어지는 물로 적시는 회전 분쇄 면의 표면으로 낮출 수있는 바늘을 보유합니다. 당겨진 바늘의 예는 도 2B에서볼 수 있으며, 20° 경사를 가진 바늘은 도 2C에도시되어 있다. 바늘은 손상을 피하고 깨끗하게 보관하기 위해 안전하게 보관해야합니다 (그림2D).
마이크로 인젝터에 균형과 주입 압력을 적절하게 설정하면 동일한 바늘로 주입 된 각 계란에 유사한 양의 물질을 주입 할 수 있어야합니다. 직경이 다른 바늘로 변경할 때 주입 및 균형 압력의 최적화가 필요합니다. 이 최적화는 사출 펄스의 일관성을 극대화합니다.
생존율은 이러한 실험의 성공을 평가하기 위한 하나의 중요한 매개 변수이다. 대부분의 죽은 계란은 다음과 같이 시력에 의해 쉽게 식별 될 수있다 : 난자 내의 노른자 및 배아 조직은 고르지 않게 덩어리지기 시작하고 (그림3A)결국 노른자의 대부분은 난자의 한쪽으로 이동합니다 (그림3B). 4-6일 후(단계 8-15에 해당)19,실험시약을 주입한 난자가 일반적으로 낮은 생존율을 보였을 때 85% 이상의 무주사 계란이 생존하였다(도3C). 바늘 천자, 염료 및 완충제의 도입, 또는 비히클 또는 dsRNA의 존재를 포함하여 주사 자체의 모든 양상을 제어하는 것은 실험 조작시도의 진정한 효과를 이해하기 위해 요구된다(도면 3C).실험 조작에 따라, 더 높은 수준의 치사성이 예상될 수 있으며, 조작의 비치명적인 효과를 평가하기 위해 분석의 타이밍 또는 주사 타이밍을 변경해야 할 수도 있다.
하나는 주입의 자형시 결과를 평가하는 방법은 주입 된 것에 따라 달라집니다. 예를 들면, 특정 mRNA 녹다운 결과로 서 현상형 변경은 총 해부학 수준에서 명백할 지도 모릅니다. 예를 들어, 제스테(E(z))의 유전자 인핸서(E(z))는 일반적으로 울트라비트호락스(Ubx)를 포함하는 Hox 유전자를 억제한다. E(z)에 dsRNA를 주입하면 E(z) 기능이 끊어지고 Ubx 억제가 해제되어 자궁 외 Ubx 발현이 발생합니다. 이것은 그 세그먼트20에 있는 Ubx의 억압 때문에 T3 다리 같이 부속기로 복부 부속기의 5 쌍의 변환으로 이끌어 냅니다 (안테나, 상악골, labium, T2 다리 및 T2 다리). 제2 예에서, GFP 발현을 사용하여 이식유전자의 성공적인 삽입을 분석할 수 있다. 예를 들어, g. 바이마쿨라투스 액틴 프로모터의 통제 하에 eGFP 태그가 달린 히스톤 2B 유전자를 코딩하는 cDNA가 돼지박 트랜스포세아제를 사용하여 크리켓 게놈에 삽입되었을 때, 각 핵을 시각화할 수 있게 되었다. eGFP 태그된 His2B 단백질을 자극하기 위해 형광을 이용하여 난자에 (그림4C,D). 이 경우, 시간이 지남에 따라 핵의 움직임을모니터링할 수 있었다 7.
| 솔루션 이름 | 구성 요소 | 댓글/설명 |
| 10x 사출 버퍼 솔루션 | 1 L H2O 추가: 0.8 g NaCl, 0.09 g Na2HPO4,0.04 g KH2PO4,2.98 g KCl | 재고를 4 °C에 보관하십시오. 0.45 μm 주사기 필터가 장착된 1mL 주사기로 사용하기 직전에 소량을 걸레로 걸수 있습니다. 필요에 따라 약 500 μL의 주입 용액을 걸으세요. 실험 기간 동안 얼음에 여과된 주입 용액을 보관하십시오. |
| HEPES 버퍼링 식염수 | 1 L H2O에서 추가 : 8.77g NaCl, 5.2g HEPES, | pH를 7.0으로 하고 4°C에서 보관하십시오. |
| 테트라메틸 로다민 덱스트란(10,000MW) 염료 재고 솔루션 | 써모피셔의 로다민 염료 | 이 염료는 종종 동색 분말로 판매됩니다. 이 경우 물로 50 mg / mL의 재고 용액을 구성하십시오. 12,000 x g의 원심분리기를 5분 동안 사용하여 불용성 입자를 제거합니다. 원심분리 후 상급물질을 모으고, 튜브 바닥의 미립자 물질을 피하고, 알리쿼트 및 -20°C에서 동결한다. 사용 중 의 재고 aliquots는 1 ~2 주 동안 4 °C에서 보관될 수 있다. 동결 해동 알리쿼트 여러 번 피하십시오. 염료로 인해 바늘이 막히는 경우 Whatman #2 필터 용지를 통해 염료를 여과 할 수도 있습니다. |
표 1: 솔루션 레시피 및 참고 사항.
그림 1: 계란 주입 프로토콜 개요. (A) 계란 주사에 사용할 수있는 전형적인 설정. (B) 계란은 체로 모래에서 분리됩니다. (C) 계란은 따뜻하고 액체 아가로즈에 금형을 배치하여 만든 작은 우물에서 주입을 위해 개최됩니다. (D) 바늘과 5개의 주사된 계란에서 형광해 현미경을 통해 볼 수 있다. (E) 주입되지 않은 달걀. 앞쪽 끝(약간 가리개, 왼쪽)과 후방 끝(더 무딘; 오른쪽)은 서로 구별됩니다. 주사에 가장 적합한 영역은 후부 끝 근처에서 괄호와 함께 표시됩니다. (F) 주사 후 이틀 후 계란. 사출 부위는 약간의 변색으로 볼 수 있으며 소량의 추방 된 노른자는 분명합니다 (화살표). 축척 막대 = 1mm(D); 0.5 mm (E 및 F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 바늘은 마이크로 그라인더 또는 베벨러를 사용하여 베벨된다. (A) RO 물 (이미지 상단에 표시된 주사기에서 물 방울)에 의해 적신 원형, 회전 연삭 표면마이크로 분쇄기의 예. (B) 경종 전에 바늘이 길고 좁습니다. (C) 20°로 경종 한 후 날카로운 주사 바늘이 생성됩니다. 내부 루멘의 직경이 10 μm입니다. (빨간색 눈금 막대 = 10 μm). (D) 당겨진 바늘을 뚜껑이 있는 페트리 접시에 보관하고 치과 용 왁스를 사용하여 제자리에 보관 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 주사는 생존율을 감소시킬 수 있습니다. (A) 육안 검사시 죽은 계란과 죽어가는 계란이 분명합니다. (B) 시간이 지남에 따라 재료는 계란의 한쪽으로 이동합니다. (c) 난자 누워 후 4~6일 의 생존율을 비교하는 것은 다음과 같은 다양한 조건에 대해, 무주입된 난자(n=6 실험); 9 μm 바늘로 찔린 계란하지만 주입되지 않은 (n = 2 실험); 완충제 및 염료로 주입 된 계란 (n = 13 실험); 완충제, 염료 및 플라스미드 벡터(n= 2개의 실험)로 주입된 계란; 완충제, 염료 및 DMSO (n = 11 실험)로 주입 된 계란; 완충제, 염료 및 대조군 dsRNA(n = 22실험)로 주입된 계란. 사용된 대조군 dsRNA의 유형은 eGFP 또는 dsRed에 대하여 dsRNA를 포함했다. 각 바의 기지에 있는 숫자는 각 조건에 사용되는 살아남은 계란 / 총 계란의 총 수를 기록합니다. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. 배율 막대 = 1mm(A 및 B)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 주사 결과 평가. (A-B) 제스테(E(z)의인핸서(E(z)의 주입은 Ubx mRNA(A)에 도시된 야생형의 정상적인 발현을 변화시키고 안테나(AN)와 마우스파트(Mx, Lb)를 다리형 부속제(B)로 변형시킨다. (C-D) 전염 가능한 원소 인 piggyBac 및 histone2B-eGFP를 가진 초기 계란의 주입은 모든 핵에서 GFP를 발현하는 형질전환 배아를 생성합니다. 핵의 위치는 알 누워 후 8시간 (C) 및 20 시간 후 알 누워 (D)를 관찰 할 수 있습니다. 약어: = 안테나; Mx = 맥실라; Lb= 라비움; T1-3 = 흉부 다리 1 ~ 3; RNAi = RNA 간섭; Gb = G. 바이마쿨라투스; 액트 = 액틴; H2B = 히스톤 H2B; GFP = 녹색 형광 단백질. 배율 막대 = 200 μm (A 및 B); 500 μm (E 및 F). 이러한 실험 결과는 원래다른곳에서 7,20을기재하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 기술의 두 가지 주요 과제는 최적의 바늘 크기와 생존력의 관련 문제입니다. 작은 바늘은 생존을 향상하지만, 좁은 루멘을 가진 바늘은 직장에서 모세 혈관의 더 큰 정도를 가지고, 이는 노른자가 막힘을 일으키는 바늘로 이동 할 가능성이 더 높습니다. 가장 좋은 경우에, 막힘은 단순히 다른 계란을 주입하거나 위에서 설명한 대로 바늘을 치워서 지울 수 있습니다. 노른자가 바늘에서 밀려나올 때까지 마이크로인젝터의 균형 압력을 높이려고 시도할 수도 있습니다. 이 기술의 또 다른 주요 과제는 생존력입니다. 우리의 손에, 실험적인 해결책으로 주입된 계란을 위한 생존율은 전형적으로 40그리고 80% 사이에서 입니다. 생존율은 이 기술을 배우기 시작하는 사람들을 위해 10%만큼 낮을 수 있지만 연습으로 향상될 것입니다. 위에서 설명한 바와 같이 부정적인 대조는 다양한 물질의 도입이 생존율을 낮출 수 있다는 점을 감안할때, 연구자들이 연습으로 생존율의 변화를 정확하게 평가하는 것이 중요하다(그림 3C).
주사의 타이밍뿐만 아니라 각 실험 접근 에 대한 중요한 고려 사항입니다. 더 오래된 계란은 더 젊은 그들 보다는 주입하기 어렵고, 일반적으로, 생존율은 더 오래된 계란 보다는 오히려 더 젊은 주입할 때 더 높습니다. 바늘과 주입 된 물질의 도입은 의도하지 않은 해부학 적 손상을 초래할 수 있습니다. 그러나 경험에 따르면 2-3일 된 계란을 주입할 수 있습니다. 이 단계에서 계란의 등쪽 측을 표적으로 하는 것은 복부 측에 첫째로 형성하는 태아를 손상시키는 것을 피하는 것을 돕습니다. 후방 단부를 표적으로 하는 것은 제1 핵 분열 및 생식 대역 형성에 대한 시약 접근을 증가시킬 수 있으며, 이는 계란19,21의이 말기 근처에서 발생한다. 하나는 게놈을 조작하는 것을 시도하는 경우에, 게놈 수정의 광범위한 체세포 또는 생식선 전송을 달성하기위한 목적으로, 주사는 계란 누워 후 대략 14 시간 시작 세포화 의 앞에 수행되어야 합니다19 . mRNA 수준을 녹다운dsRNA를 주입하는 경우, 주사를 위한 시간 창은 관심의 유전자를 무너뜨리기 위하여 얼마나 초기 발달에 근거를 두어야 합니다. RNAi의 효력은 가능성이 얼마 동안 지속되는 동안, dsRNA는 표현형에 있는 어떤 변경든지 평가하기 위하여 계획하는 시간의 앞에 소개될 필요가 있습니다. 주입 도중 경과된 시간을 추적하고 배아 발달의 진행은 적당한 단계 계란이 주입되고 있다는 것을 확인하기 위하여 중요할 지도 모릅니다. 어떤 물질이 주입되든, 주입 후의 발달 지연은 일반적이지만, 지연정도는 인젝트에 따라 달라질 수 있다.
여기에 제시된 프로토콜은 비교적 비싼 여러 장비에 의존합니다. 그러나 이러한 항목의 일부 또는 전부를 사용하지 않고 계란을 성공적으로 주입할 수 있어야 합니다. 예를 들어, 시중에 다양한 마이크로 인젝터가 있으며 일부는 재료표에 제시된 것보다 저렴할 수 있습니다. 그것은 단순히 재료의 적절 한 금액을 주입 하는 주사기를 사용 하 여 가능, 비록이 몇 가지 연습을 걸릴 것 이다. 고가의 마이크로매니퓰레이터 대신에 다양한 재료를 사용하여 바늘을 안정적으로 고정하고 천천히 제어된 사전을 허용할 수 있으며, 간단한 플라스틱 설계는 다른22에의해 사용되었습니다. 그것은 또한 beveller의 사용을 피하기 위해 가능 할 수 있습니다., 비록 우리의 경험에 적절 한 경종 주사의 성공에 거 대 한 차이 만들 수 있습니다. 바늘 끝을 손으로 드래그하여 바늘을 선명하게 할 수 있으며 현미경으로이 과정을 평가할 수 있습니다. 에 관계 없이, 날카로운 바늘 주사 를 쉽게 하 고 생존을 향상 시킬 것 이다.
이 주입 기술은 유연하고 다양한 조작에 사용할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 dsRNA 및 piggyBac 의존적인 게놈 수정 실험을 위한 결과를 보여주었습니다, 그러나 이 기술로 CRISPR/Cas 또는 그밖 접근을 사용하는 것도 가능합니다. 여기에 포함된 실험에서 결과 표현형은 명백하고 평가하기 쉬웠습니다. 몇몇 실험은 실험 조작의 효력을 보기 위하여 면역성 화학 또는 그밖 시각화 공구의 사용을 요구할 수 있습니다. 주사에 대한 한 가지 대안은 생체 내에서 세포와 조직에 DNA 또는 다른 거대 분자를 도입하는 데 사용할 수있는 전기 천공의 사용입니다. 전기 천공은 배아가 특정 부위8을 표적으로 하기 위해 이미형성된 오래된 크리켓 난자에 사용될 수 있지만, 실험에서 전체 개발 배아를 표적으로 삼아야 할 때 주사가 더 유용하다. 이 주입 기술은 또한 쉽게 다른 hemimetabolous 및 holometabolous 곤충의 다양 한계란에 사용 하기 위해 적응 해야, 이상적으로 의미 있는 비교 연구를 수행 하는 능력을 향상.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트에 보고 된 연구는 기관 개발 상에 의해 지원되었다 (IDeA) 보조금 번호 P20GM10342에 따라 국립 보건원의 국립 연구소에서 HH3에, NSF 수상 번호 IOS-1257217에 CGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
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