Summary
Her presenterer vi en protokoll for å injisere cricket egg, en teknikk som fungerer som en grunnleggende metode i mange eksperimenter i cricket, inkludert, men ikke begrenset til, RNA forstyrrelser og genomisk manipulasjon.
Abstract
Endring av gen funksjon i en utvikler organisme er sentral for ulike typer eksperimenter. Mens enormt kraftige genetiske verktøy har blitt utviklet i tradisjonelle modellsystemer, er det vanskelig å manipulere gener eller Messenger RNA (mRNA) i de fleste andre organismer. Samtidig, evolusjonære og komparative tilnærminger stole på en utforskning av gen funksjon i mange forskjellige arter, nødvendiggjør utvikling og tilpasning av teknikker for å manipulere uttrykk utenfor for tiden genetisk medgjørlig Arter. Denne protokollen beskriver en metode for å injisere reagenser i cricket egg til analysen virkningene av en gitt manipulasjon på embryonale eller larvestadiet utvikling. Instruksjoner for hvordan du samler inn og injiserer egg med skrå nåler er beskrevet. Denne relativt enkle teknikken er fleksibel og potensielt kan tilpasses andre insekter. Man kan samle og injisere dusinvis av egg i et enkelt eksperiment, og overlevelses rater for buffer bare injeksjoner bedre med praksis og kan være så høyt som 80%. Denne teknikken vil støtte flere typer eksperimentelle tilnærminger inkludert injeksjon av farmakologiske midler, in vitro avkortet mRNA å uttrykke gener av interesse, dobbel-strandet RNA (dsRNA) for å oppnå RNA interferens, bruk av gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic repetisjoner (CRISPR) i samspill med CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) reagenser for genomisk modifikasjon, og transposable elementer for å generere forbigående eller stabile transgene Lines.
Introduction
Evnen å endre det Genova eller innvirkningen gen gjengivelsen inne organisere er grunnlaget for planen av mange typer av eksperimenter tester funksjonell årsakssammenheng. Det er også kritisk for det komparative og evolutionarily arbeidet som genomisk og ikke-genomisk modifikasjons teknikker er tilgjengelig i organismer utenfor tradisjonelle genetiske laboratoriedyr modellsystemer (f. eks mus laboratoriemusmusculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, og Caenorhabditis elegans). Enten det er et ønske om å forstå organismal mangfold1 eller ens overholdelse av Krogh ' s prinsipp, at for alle biologiske spørsmål er det en organisme som er best egnet til løsningen2,3, evnen til å modifisere genomer eller påvirke genuttrykket er essensielt for moderne eksperimentell design.
The cricket Gryllus bimaculatus er en ny modell system. Brukt for forrige århundre i neuroethology eksperimenter4, de siste to ti årene har vært vitne til en økt eksperimentell interesse i cricket, spesielt fokusert på utviklingen og utviklingen av denne organismen5. The cricket er et hemimetabolous insekt som grener basally til godt studert holometabolous insekter, slik som D. melanogaster og Tribolium castaneum6. På grunn av sin nyttige posisjon på den evolusjonære treet, forskere er interessert i å spørre moderne, sofistikerte eksperimentelle spørsmål i dette insekt, som har ført til en økende interesse for å tilpasse molekylære verktøy for bruk i G. bimaculatus.
Injeksjoner av molekylære reagenser i cricket egg kan brukes til genomisk modifikasjon eksperimenter så vel som ikke-genomisk manipulasjoner av genuttrykk i embryo. For eksempel er transgene G. bimaculatus bærer eGFP innsettinger opprettet ved hjelp av transposase piggyBac7,8. Etterforskerne har opprettet knockout G. bimaculatus bruke sink-finger Nukleaser (zfner) og transkripsjon aktivator-lignende (TAL) effektor Nukleaser (TALENs) å innføre dobbel-strandet pauser i bestemte genomisk regioner9. Selv om Zfner og TALENs tillater områdespesifikk målretting i dyr utover de fire store modell systemene, har disse reagensene raskt blitt overgått av CRISPR/Cas9-systemet, noe som er enklere å bruke, mer effektivt og svært fleksibelt10. CRISPR har vært brukt i G. bimaculatus å produsere Knock-Out11 samt knock-in linjer12,13 i tillegg til genomisk modifikasjon, dsRNA kan injiseres i egg for å slå ned mRNA uttrykk i utviklingsland embryo, slik at etterforskerne å forstå rollen til bestemte transkripsjoner gjennom utvikling14,15. Noen begrensede detaljer om hvordan å injisere cricket egg har blitt publisert tidligere12.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for injisering av tidlige G. bimaculatus egg. Denne protokollen er effektiv og lett tilpasses ulike laboratorie innstillinger, injeksjon materialer, og muligens til andre insekter. Mens ytterligere detaljer for å designe og implementere genomisk modifikasjon og knockdown eksperimenter har blitt publisert andre steder12,13, vil disse tilnærmingene til slutt stole på injeksjon protokollen detaljert her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hardware oppsett og utarbeidelse av materialer
Merk: Vennligst se tabell 1 og tabell over materialer for utarbeidelse av løsninger, reagens og utstyrs detaljer.
- Sett opp et dissekere mikroskop for å se egg og veilede injeksjonsnålen. (Figur 1a viser et dissekere mikroskop utstyrt med fluorescens.) Fluorescens evne er fordelaktig, men ikke nødvendig.
- Plasser en 3-akse-micromanipulator for å manøvrere injeksjonsnålen på plass (figur 1a).
- Sett opp en microinjector med slange og en nål holder for å injisere små mengder materiale (figur 1a). Du kan også bruke en fot pedal som ikke er vist i figuren.
- Design og lage et stempel for å lage brønner for egg (figur 1C) ved å skrive ut det inverse av ønsket mønster, enten med en 3D-skriver eller en lasergravering.
Merk: Eksempel stempelet som vises i 3D, er 4,5 cm x 5 cm med 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm utstikkende for å skape individuelle brønner. Detaljer om hvordan å lage en rekke passelig muggsopp har blitt publisert andre steder16. - Forbered 10x injeksjon buffer, HEPES bufret saltvann (HBS), og en lagerløsning av Tetramethylrhodamine Dextran fargestoff og lagre ved 4 ° c.
- Forbered eksperimentelle løsninger som skal injiseres, for eksempel dsRNA, CRISPR/Cas912, transposable elementer, in vitro avkortet mRNA7,8, farmakologiske agenter17, zfner, eller TALENS9.
- Plasser dobbel pinne tape på flere lag av standard Lab tape på et glass mikroskop lysbilde for å skape en plattform 1 mm eller så over glasset lysbildet, som vil bli brukt for å holde nåler for vurderingen.
- Forbered en cricket container ca 40 cm x 60 cm i størrelse med et lokk inneha en mesh-dekket åpning for luftsirkulasjon.
- Legg til mat, vann og ly materialer.
- Legg til flere dusin friske mannlige og kvinnelige voksen gresshopper. Identifiser voksen cricket av tilstedeværelsen av vinger.
Merk: En rekke post-imaginal aldre kan øke egg rentene. Tettheten av gresshopper bør være relativt høy for å kunne samle nok egg til et eksperiment, men ikke så overfylt at kannibalisme oppstår. For eksempel, ca to dusin sunne gresshopper, med en omtrent lik mannlig til kvinnelig ratio, i en beholder av størrelsen nevnt ovenfor bør være tilstrekkelig til å samle inn om 200 egg i en til to h periode. Gresshopper kan oppbevares ved romtemperatur, men utvikling og adferd vil være optimalt hvis gresshopper opprettholdes i en varm (23.5 – 26 ° c), fuktig (40-60% relativ fuktighet) inkubator.
2. Making nåler for injeksjon
- Bruk Borosilikatglass glass kar med filament (se materialfortegnelsen for størrelsesdetaljer). Forbered pull nåler på samme dag, eller opp til noen dager før injeksjoner er fullført.
- Sett et kapillær glass inn i avtrekker, Midtstill glasset på filament, og stram knottene for å feste glasset på plass.
- Still inn den avtrekker temperaturen nær glass rampe Temp (-5 ° c til + 10 ° c).
- Bruk en enkelt-trinns, høy varme protokoll for å trekke en lang taper med en liten åpning, men unngå å smelte endene lukket.
Merk: For eksempel, når du bruker micropipette avtrekker beskrevet i tabellen av materialer utstyrt med en boks filament, bruk følgende parametre for glass med en rampe temperatur på 478: Heat 478; Trekk 45; Vel 75; Del 120. Optimale forhold for å produsere en nål med formen vist i figur 2b bør fastsettes empirisk av hver bruker. - Skrå nål tips i forberedelse til injeksjoner.
- Fukt det roterende slipe flyet til beveler (figur 2a) med dryppende vann. Bruk enten omvendt osmose (RO) eller diethylpyrocarbonate (DEPC)-behandlet destillert vann.
- Plasser den trekkes nålen inn i beveler og drei til en 20 ° vinkel.
- Senk nålen til den bare berører slipe planet og skråkant for 2 til 3 min.
- Vurder skråkant ved å plassere skrå nålen på dobbel-Stick tape som er levd opp til et glass mikroskop lysbilde.
- Plasser lysbildet som holder nålen på scenen av en sammensatt mikroskop utstyrt med et kamera og bilde oppkjøpet programvare.
- Skaff deg et bilde av nålespissen ved hjelp av en 20x objektiv.
- Bruk bildebehandlingsprogrammet til å måle den innvendige lumen diameteren på nålen bare proksimale til skrå åpningen (figur 2C). Den optimale størrelsen er 10 μm + 2 μm.
- Kast nåler som har en åpning under 8 μm og over 12 μm.
- Oppbevar nålene i en beholder med et lokk for å unngå å bli støvete. Bruk en stripe av voks eller lignende materiale for å heve nålene av bunnen av beholderen for å unngå å bryte tips (figur 2D).
3. egg innsamling og forberedelse
- Maksimer antall egg lagt av frata gresshopper av noe fuktig legging materiale (vann hetteglass, eggeretter) over natten eller i minst 8-10 timer før du prøver å samle egg.
Merk: Siden kvinner har evnen til internt store sperm, en annerledes tidsbestemt prosedyre kan være nødvendig hvis nøye timet befruktning er eksperimentelt viktig18. - Lag 40 mL 1% agarose i vann og hell i en 10 cm Petri parabolen.
- Plasser et egg-brønn stempel på overflaten av agarose før det stivner.
- Fjern stempelet når agarose er befestet, for å avdekke brønnene (figur 1C).
- Fyll den agarose brønn platen med HBS som inneholder 1% penicillin/Streptomycin.
- Plasser lokket på fatet, Pakk inn parafilm og oppbevar ved 4 ° c.
Merk: Rettene kan oppbevares i noen dager ved 4 ° c, men skal varmes opp til romtemperatur før bruk for å unngå kondens. - Lag en egg samling rett for gresshopper å legge egg i ved å fylle en 35 mm Petri parabol med hvit lekeplass sand (figur 1B).
Merk: Sanden angitt i tabellen av materialer er av riktig kornstørrelse. Hvis sandkorn er for store, vil sanden skade eggene. - Dekk egg parabolen med en firkant av papir håndkle kuttet å være ca 18 cm x 18 cm, og plasser på toppen av parabolen med sand. Gjennom denne papir håndkle dekke fylt parabolen med vann fra springen.
- Vipp Petri fatet og klem forsiktig på toppen for å fjerne overflødig vann.
- Brette hjørnene av papir håndkle kvadrat under fatet og plasser egg parabolen i det omvendte lokket, som vil bidra til å holde papir håndkle dekselet på plass.
- Plasser egget parabolen i cricket bin og la den voksne kvinner til å oviposit egg for en til to h.
Merk: Den relativt korte tiden her sikrer at alle eggene vil være lik i utviklingsfasen på injeksjons tidspunktet. Hvis injeksjon før cellularization er viktig, bør injeksjoner forekomme innen 14 h av egglegging19. - I mellomtiden, la agarose parabolen (fra trinn 3,6) for å varme til romtemperatur i forberedelse til å holde egg til injeksjon.
- Fjern egg samling parabol, som nå inneholder fersk lagt egg, fra cricket bin, og fjerne papir håndkle dekselet. Plasser en sil med en pore størrelse på 0,5 – 1 mm over et beger med minst 500 mL kapasitet (figur 1B).
- Skyll innholdet i egg-legging parabol (sand og egg) inn i sil under forsiktig rennende springvann la sanden korn faller gjennom sil mesh i vannet i begeret nedenfor, men forlater cricket eggene i sil kurv.
- Fyll en container med RO vann og legg den i en skuff. Vend sil over beholderen og trykk den mot fatet for å løsne eggene i vannet. Eggene vil synke til bunnen av beholderen.
- Skjær spissen av en P1000 pipette spissen med saks for å lage en åpning ca 3 mm i diameter. Plasser dette tipset på en P1000 pipettehjelper og bruke den til å overføre eggene fra beholderen til agarose egg mold parabolen, overføre så lite vann som mulig.
- Bruk plast pinsett til å stille opp egg i agarose brønner fylt med HBS pluss 1% penicillin/Streptomycin. Hvert egg vil synke til bunnen av en individuell brønn. Dekk med Petri parabolen lokket til klar til å injisere.
4. klargjør Microinjector
- Fest microinjector til en trykkluft eller gasskilde (denne protokollen ble optimalisert ved hjelp av enten trykkluft eller N2).
Merk: Hvis du bruker en bærbar luft tank, fyll til minst 75 PSI. Tanken vil miste lufttrykket gjennom injeksjoner og må kanskje etterfylles; injeksjoner blir vanskelig under 40psi. - Slå på microinjector. Sett injeksjonen tid til 0,17 s og trykket til 10 – 15 PSI.
Merk: Det eksakte trykket som trengs vil avhenge av åpningen av nålen og må bestemmes empirisk for hver runde av injeksjon og/eller ny nål brukes. - Kontroller at BALANCE-knotten på microinjector er slått til 0 (vanligvis helt mot klokken), og at microinjector er satt på trykk og i injeksjons modus.
5. injeksjoner
- Filtrer rundt 500 μL av 10x injeksjons buffer ved hjelp av en 1 mL sprøyte og et sprøyte filter på 0,45 μm.
- Bland injeksjon reagenser (detaljene som følger er for injeksjon av dsRNA fremstilt som beskrevet i12).
Merk: Det kan være tilrådelig å designe og utføre flere kontroller, spesielt når man først lære denne teknikken. Poking egg uten sprøytebruk, sprøytebruk buffer + fargestoff alene, eller injisere buffer + fargestoff + en kontroll reagens (for eksempel eGFP dsRNA) er alle gode tester av hvor forstyrrende ulike elementer av injeksjon protokollen kan være. Se Figur 3 for overlevelsesevne av en rekke forskjellige kontroller. - Start med en 4 mL dsRNA alikvot.
- Tilsett 0,5 mL av den filtrerte 10x injeksjons buffer til dsRNA alikvot.
- Tilsett 0,5 mL 50 mg/mL Tetramethyl rhodamine Dextran fargestoff lagerløsning. Hvis du arbeider med et dissekere omfang uten fluorescens, bør du bruke fenol Red i stedet.
- Oppbevar alt materiale på isen i hele injeksjons perioden.
- Legg injeksjons oppløsningen i en sprøyte nål ved hjelp av 20 mL laste spisser og en P10-Pipet.
- Trekk opp en 1,5 mL injeksjons løsning og sett laste spissen inn i den brede enden av injeksjonsnålen.
- Løs ut løsningen så langt ned i nålen som mulig og Eliminer luftbobler ved å sveipe forsiktig; Vær forsiktig så du ikke bryter nålen.
- Plasser fatet av egg under dissekere mikroskop og velg en lav forstørrelse på rundt 10x (1x forstørrelse sett gjennom 10x øye mål).
- Stikk nålen inn i injeksjons huset og stram til.
Merk: Pass på at nålen er riktig og satt godt inn i huset. For å gjøre dette, trekker den brede enden av nålen tilbake ut av metall huset, og bringer silisium slangen i huset med den. Juster silisium slangen slik at glasset enden av nålen stikker like utenfor silisium. Hvis dette ikke er gjort, kan silisium slangen få klemt mellom glasset og metall huset, blokkerer enden av nålen. - Sett injeksjons huset forsiktig inn med en nål i micromanipulator. Vær oppmerksom på den skarpe enden av nålen og være forsiktig at det ikke er bumped inn overflater og brukket.
- Mens du ser på både eggene og nålen gjennom mikroskopet, flytter nålen nær eggene i øvre venstre hjørne av parabolen rutenettet.
- Senk nålen til spissen kommer inn i HBS pluss 1% penicillin/Streptomycin bufret oppløsning i fatet.
- Midt i nålen i synsfeltet og flytte egg parabolen slik at nålen er noen mm nærmere kanten av fatet enn eggene.
- Ikke hindre visning av rutenettet av egg med nålen.
- Sett mikroskopet til filteret som passer for Rhodamine, så det er mulig å observere fluorescens i nålen og fokusere på tuppen av nålen.
- På microinjector, Drei balanse knotten langsomt med urviseren til injeksjons løsningen begynner å lekke ut av nålen inn i fjærings løsningen. Balanse nummeret på skjermen på microinjector vil begynne å øke, selv om tallverdien ikke er viktig. Deretter vrir du knotten tilbake mot klokken litt like til fargestoffet slutter å lekke ut av nålen.
Merk: Det er viktig å sette denne balansen hver gang en ny nål brukes. Uten at saldoen er riktig innstilt, vil microinjector fortsette å injisere en stund etter at injeksjonen er utløst. Det er også mulig at et enkelt trykk på injeksjonsknappen med en ubalansert nål vil føre til utvisning av hele innholdet i den lastede nålen. - Med nålen sentrert i synsfeltet, flytte egg parabolen slik at nålen er rettet mot egget skal injiseres først. Det anbefales at injeksjoner starter i et hjørne av rutenettet av arrangerte egg, for eksempel øvre venstre hjørne.
- Juster forstørrelsen til ca 50x; på denne forstørrelsen, vil et enkelt egg fylle det meste av synsfeltet.
- Bruk både micromanipulator og en hånd på egg fatet til å flytte nålen i posisjon for injeksjon.
- Før nålen ved hjelp av micromanipulator og sett tuppen av nålen inn i det første egget som skal injiseres.
- Sett nålen på 20-30% egg lengde fra bakre (blunter) enden av egget (figur 1e), vinkelrett på den lange aksen av egget.
- Injiser løsningen enten med injeksjons fotpedalen eller injeksjonsknappen på microinjector. En liten bolus av fluorescerende materiale inne i egget vil indikere en vellykket injeksjon (figur 1d).
Merk: Det er ikke uvanlig for noen eggeplomme å bli kastet ut av egget under injeksjon (figur 1F), og dette betyr ikke nødvendigvis indikere at injisert egg vil bli inviable. - Trekk nålen ut av egget. Hvis egget utilsiktet løftes ut av sin brønn ved tilbaketrekking av nålen, bruke små tang til å dytte egget tilbake i sin brønn mens trekke nålen.
- Hvis nålen tetter under injeksjonen, Fjern nålen fra egget, og hold nålen under vann i HBS pluss 1% penicillin/Streptomycin-løsning som dekker eggene, og fjern den tette nålen ved hjelp av enten Clear -funksjonen eller ved å skyve Knappen.
- Fortsetter å bruke den samme nålen, gjenta injeksjon prosedyren for så mange egg som mulig. Ved første, dette kan være bare 20 eller 30 egg, men vil øke til over 100 med praksis.
- Hvis nålen blir tilstoppet og ikke kan tømmes, kast nålen, Fyll en ny nål og start på nytt (dvs. gå tilbake til trinn 5,7).
- Oppbevar parabolen av injisert egg i en varm inkubator (23.5-26 ° c) som er litt fuktig (for å minimere fordampning) til embryo har nådd ønsket stadium av utviklingen for analysen.
- Minst hver 24 h, fjerne egg som ikke lenger er levedyktig (figur 3a, B), og erstatte suspensjon løsning med frisk HBS pluss 1% penicillin/Streptomycin.
- To til tre dager etter injeksjon, overføre eggene ved milde pipettering eller med plast tang til papirhåndklær fuktet med HBS pluss 1% penicillin/Streptomycin i en lidded Petri parabolen å fortsette utviklingen i den varme, fuktig inkubator.
- Overvåk eggene, og fjerne egg som ikke lenger er levedyktig hver dag (figur 3a, B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gresshopper lett legge egg i fuktig materiale, og gi tilstrekkelig materiale, for eksempel fuktig sand eller skitt, induserer dem å legge et stort antall egg. Dette er spesielt effektivt hvis gresshopper først er fratatt egg-legging materiale for 8-10 h. egg lagt i ren sand kan lett skilles, samlet (figur 1B) og plasseres i spesialdesignede egg brønner for injeksjon (figur 1C). Et dissekere mikroskop, en microinjector og en micromanipulator (figur 1a) kan brukes til å injisere individuelle egg med en rekke materialer (figur 1d). Eggene injiseres nær bakre ende, på et punkt ca 20-30% langs fremre-bakre akse (figur 1e). Skille de mer spisse fremre enden fra de mer avstumpet bakre enden kan være vanskelig, da disse forskjellene er ofte subtile (figur 1e). Rullende et egg fra side til side ofte bidrar til å avdekke hvilken ende er som. Etter fjerning av injeksjonsnålen, eggeplomme noen ganger utløst (figur 1F), selv om dette ikke synes å kompromittere helsen til å utvikle embryo inne.
En av de mest kritiske trinnene i denne protokollen er utarbeidelse av skrå nåler. Etter å trekke lange, slanke nåler må de være skrå til en 20 ° vinkel og har en åpning diameter på 10μm (± 2 μm). Hvis diameteren er for stor, vil injeksjons oppløsningen lekke ut av nålen, og disse nålene vil skape store hull i egg, redusere overlevelsesraten. Smalere nåler øke overlevelsesevne, men hvis de er for smale, har de en tendens til å tette lett, noe som gjør injeksjoner langsom og frustrerende. Med en nål diameter på 10 μm ± 2 μm er det mulig å injisere i overkant av 100 egg med en enkelt nål uten at nålen tetter.
Nåler kan bli skråstilt med en mikro jeksel eller skades (figur 2a). Disse delene av utstyret kan fås med et mikroskop vedlagt, eller man kan legge til en dissekere omfang på et uavhengig stativ for modeller som ikke inkluderer mikroskopet. En liten micromanipulator holder nålen, som kan vippes til ønsket vinkel og senket til overflaten av en roterende sliping flyet, som er fuktet med dryppende vann. Et eksempel på en trukket, men unbeveled nål kan sees i figur 2b, og en nål med en 20 ° skråkant er vist i figur 2C. Nåler må da oppbevares trygt for å unngå skader og holdes rene (figur 2D).
Innstilling av balanse og injeksjons trykk hensiktsmessig på microinjector bør tillate en å injisere en sammenlignbar mengde materiale i hvert egg injisert med samme nål. Optimalisering av injeksjon og balanse trykk vil være nødvendig når du skifter til en nål med en annen diameter. Denne optimaliseringen vil maksimere konsistensen av injeksjon pulser.
Overlevelsesraten er en viktig parameter for å vurdere suksessen til disse eksperimentene. De fleste døde egg kan lett identifiseres ved synet som følger: eggeplomme og embryonale vev i egget begynner å klump ujevnt (figur 3a) og til slutt det meste av eggeplomme vil migrere til den ene siden av egget (figur 3b). Ved vurdering etter 4 – 6 dager (tilsvarende etapper 8 – 15)19, overlevde større enn 85% av uninjected egg mens egg injisert med eksperimentelle reagenser generelt hadde en lavere overlevelsesrate (figur 3c). Kontrollere for alle aspekter av injeksjon selv, inkludert nålen punktering, innføring av fargestoff og buffer, eller tilstedeværelsen av kjøretøyet eller dsRNA, er nødvendig for å forstå den sanne effekten av eksperimentell manipulasjon forsøkt (figur 3C). avhengig av eksperimentell manipulasjon, kan et høyere nivå av dødelighet forventes, og man må endre tidspunktet for analysen eller tidspunktet for injeksjon for å vurdere eventuelle ikke-dødelige effekter av manipulasjon.
Måten man vurderer fenotypiske resultatene av injeksjon avhenger av hva som ble injisert. Fenotypiske endringer som følge av spesifikke mRNA-nedslaging kan for eksempel være tydelige på brutto anatomi nivået. For eksempel undertrykker genet Enhancer av zeste (E (z)) normalt Hox gener inkludert Ultrabithorax (Ubx). Sprøytebruk dsRNA for e (z) slår ned E (z) funksjon og utgivelser Ubx undertrykkelse, noe som resulterer i utenfor livmoren Ubx Expression. Dette fører til transformasjon av fem par ventrale vedheng (antenne, maxilla, labium, T1 og T2 etappe) i T3 etappe-lignende vedheng, på grunn av derepression av Ubx i disse segmentene20. I et annet eksempel er det mulig å bruke GFP-uttrykk til å sette opp en vellykket innsetting av en transgene. For eksempel, når en cDNA koding en eGFP-Tagged histone 2b genet under kontroll av en G. bimaculatus utgangen promoter ble satt inn i cricket-Genova ved hjelp av piggyBac transposase, ble det mulig å visualisere hver kjerne i egget ved hjelp av fluorescens å opphisse eGFP-Tagged His2B protein (figur 4c, D). I dette tilfellet var det mulig å overvåke bevegelsen av kjerner over tid7.
| Navn på løsning | Komponenter | Kommentarer/beskrivelse |
| 10x injeksjon buffer løsning | I 1 L H2O Legg til: 0,8 g NaCl, 0,09 g na2HPO4, 0,04 g KH2PO4, 2,98 g KCl | Store lager ved 4 ° c. Filtrer et lite beløp umiddelbart før bruk med en 1 mL sprøyte utstyrt med et sprøyte filter på 0,45 μm. Gjenta etter behov for å filtrere ca. 500 μL av injeksjons løsning. Hold filtrert injeksjon løsning på isen for varigheten av eksperimentet. |
| HEPES bufret saltvann | I 1 L H2O, tilsett: 8,77 g NaCl, 5,2 g HEPES, | pH til 7,0 og oppbevares ved 4 ° c. |
| Tetramethyl Rhodamine Dextran (10 000 MW) Dye lagerløsning | Rhodamine fargestoff fra Thermofisher | Dette fargestoffet er ofte solgt som et lyofilisert pulver. I dette tilfellet utgjør en lagerløsning av 50 mg/mL med vann. Sentrifuger på 12 000 x g i 5 min for å fjerne eventuelle uløselig partikler. Samle supernatanten etter sentrifugering, unngå partikler i bunnen av røret, alikvot og Frys ved-20 ° c. Stock alikvoter i bruk kan oppbevares ved 4 ° c i en til to uker. Unngå å fryse-tine alikvoter flere ganger. Hvis nåler er tilstopping på grunn av fargestoff, kan fargestoffet også filtreres gjennom Whatman #2 filter papir. |
Tabell 1: løsnings oppskrifter og notater.
Figur 1: oversikt over injeksjon av egg. (A) et typisk oppsett som kan brukes til egg injeksjoner. (B) eggene skilles fra sand via en sil. (C) egg er holdt for injeksjon i små brønner gjort ved å plassere en mold i varme, flytende agarose. (D) fluorescens i nålen og i fem injisert egg kan sees gjennom fluorescerende dissekere mikroskop. (E) en uninjected egg. Den fremre enden (litt spiss; venstre) og bakre ende (mer avstumpet; høyre) kan skilles fra hverandre. Regionen som er mest egnet for injeksjon, nær den bakre enden, vises med braketten. (F) egg to dager etter injeksjonen. Injeksjonsstedet er synlig som en liten misfarging, og en liten mengde av utvist eggeplomme er tydelig (pil). Skala stolper = 1 mm (D); 0,5 mm (E og F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: nåler er skrå ved hjelp av en mikro jeksel eller skades. (A) et eksempel på en mikro jeksel med en sirkulær, spinning sliping overflaten fuktet av dryppende ro vann (vann drypper fra sprøyten vist i toppen av bildet). (B) før beveling, trakk nåler er lange og smale. (C) etter beveling ° blir det opprettet en skarp injeksjonsnål. Legg merke til 10 μm diameter på indre lumen. (Rød vektstenger = 10 μm). (D) trakk, kan skrå nåler lagres i en Petri parabol med lokk og holdt på plass ved hjelp av Dental voks. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: injeksjoner kan redusere overlevelsesraten. (A) Dead and Dying egg er åpenbare på visuell inspeksjon. (B) over tid, vil materialet migrere til den ene siden av egget. (C) sammenligning av overlevelses rater fire til seks dager etter egglegging for en rekke forhold, inkludert: uninjected egg (n = 6 eksperimenter); egg punktert med en 9 μm nål, men uninjected (n = 2 eksperimenter); egg injisert med buffer og fargestoff (n = 13 eksperimenter); egg injisert med buffer, fargestoff, og plasmider vektor (n = 2 eksperimenter); egg injisert med buffer, fargestoff, og DMSO (n = 11 eksperimenter); og egg injisert med buffer, fargestoff, og kontroll dsRNA (n = 22 eksperimenter). Typen kontroll dsRNA brukt inkluderte dsRNA mot eGFP eller dsRed. Tallene på bunnen av hver bar oppmerksom på det totale antall overlevende egg/total egg brukes for hver tilstand. Feilfelt representerer standard feil i gjennomsnittet. Skala bar = 1 mm (A og B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: vurdere injeksjons resultater. (A-B) Injeksjon av Enhancer av Zeste (E (z)) dsRNA endrer det normale uttrykket av Ubx mRNA (Wild type vist i (A) og fører til transformasjon av antenner (An) og elektiske (MX, LB) i etappe-lignende vedheng (B). (C-D) Injeksjon av tidlige egg med transposable element piggyBac og histone2B-eGFP produserer transgene embryo uttrykke GFP i alle kjerner. Plassering av kjerner kan observeres 8 h etter egglegging (C) og 20 h etter egglegging (D). Forkortelser: An = antenne; MX = maxilla; Lb = labium; T1-3 = bryst Ben 1 til 3; RNAi = RNA-interferens; GB = G. bimaculatus; Act = utgangen; H2B = histone H2B; GFP = grønt fluorescerende protein. Skala stolper = 200 μm (A og B); 500 μm (E og F). Disse eksperimentelle resultatene ble opprinnelig beskrevet andre steder7,20. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De to viktigste utfordringene med denne teknikken er de relaterte problemstillingene av optimal nål størrelse og overlevelsesevne. Selv om mindre nåler bedre overlevelsesevne, nåler med smalere lumen har en større grad av kapillær krefter på jobben, noe som gjør det mer sannsynlig at eggeplomme vil flytte inn i nålen forårsaker den til å tette. I beste fall kan blokkeringer tømmes ved å injisere et annet egg eller ved å fjerne nålen som beskrevet ovenfor. Man kan også forsøke å øke balanse trykket på microinjector til eggeplomme skyves ut av nålen. Den andre store utfordringen med denne teknikken er overlevelsesevne. I våre hender er overlevelses rater for egg injisert med eksperimentelle løsninger vanligvis mellom 40 og 80%. Overlevelse kan være så lav som 10% for de som begynner å lære denne teknikken, men vil forbedre med praksis. Negative kontroller, som beskrevet ovenfor, er viktige for forskerne å nøyaktig vurdere endringer i overlevelsesraten med praksis, gitt at innføringen av ulike materialer kan senke overlevelsesraten (figur 3c).
Tidspunktet for injeksjoner er en viktig faktor for hver eksperimentell tilnærming også. Eldre egg er vanskeligere å injisere enn yngre, og generelt, overlevelse er høyere når sprøytebruk yngre enn eldre egg. Innføringen av nålen og injisert materiale på senere stadier kan føre til utilsiktede anatomiske skader. Med erfaring, derimot, er injeksjon av to-til tre-dagers gamle egg mulig. Rettet mot rygg siden av egget på disse stadier bidrar til å unngå å skade fosteret, som først danner på ventrale side. Målretting mot bakre enden kan øke reagens tilgang til de første kjernefysiske divisjoner og bakterie-bandet formasjon, som oppstår nær denne enden av egg19,21. Hvis man forsøker å manipulere de Genova, med sikte på å oppnå enten utbredt somatiske eller germline overføring av Genova modifikasjon, injeksjoner bør utføres før cellularization, som starter ca 14 h etter egglegging19 . Hvis sprøytebruk dsRNA å knockdown mRNA nivåer, tidsvinduet for injeksjoner bør fastsettes basert på hvor tidlig i utviklingen man ønsker å slå ned et gen av interesse. Mens effekten av RNAi trolig vare en stund, dsRNA må innføres i forkant av tiden der man planlegger å vurdere eventuelle endringer i fenotype. Holde styr på tiden som har gått under injeksjon og progresjon av embryoutvikling kan være viktig å sikre at de riktige scenen eggene blir injisert. Uansett hvilket materiale som injiseres, er utviklingsmessige forsinkelser etter injeksjon vanlig, selv om graden av forsinkelsen kan variere avhengig av injectant.
Protokollen som presenteres her er avhengig av en rekke relativt dyre deler av utstyret. Det bør være mulig, men å injisere egg vellykket uten bruk av noen eller til og med alle disse elementene. For eksempel er det en rekke microinjectors på markedet, og noen kan være rimeligere enn den som er foreslått i tabellen av materialer. Det er også mulig å bare bruke en sprøyte for å injisere en passende mengde materiale, selv om dette ville ta litt praksis. I stedet for en kostbar micromanipulator, kunne man bruke en rekke materialer for å holde nålen stødig og tillate en langsom, kontrollert forhånd, og en enkel plastikk design har blitt brukt av andre22. Det kan også være mulig å unngå bruk av en skades, men i vår erfaring riktig beveling kan gjøre en enorm forskjell for suksessen til injeksjoner. Det kan være mulig å skjerpe en trukket nål ved å dra tuppen av nålen for hånd over det fineste sandpapiret, vurdere denne prosessen under et mikroskop. Uansett, vil skjerpet nåler gjøre injeksjoner enklere og forbedre overlevelsesevne.
Denne injeksjon teknikken er fleksibel og kan brukes til en rekke ulike manipulasjoner. Her har vi vist resultater for dsRNA og piggyBac-avhengige genomisk modifikasjon eksperimenter, men det er også mulig å bruke CRISPR/CAS eller andre tilnærminger med denne teknikken. I forsøkene er inkludert her, resulterende fenotyper var åpenbare og lett å vurdere. Noen eksperimenter kan kreve bruk av immunhistokjemi eller andre visualiseringsverktøy for å se effekten av eksperimentell manipulasjon. Et alternativ til injeksjoner er bruk av electroporation, som kan brukes til å innføre DNA eller andre makromolekyler i celler og vev i vivo. Electroporation kan brukes i eldre cricket egg hvor embryo allerede har dannet for å målrette bestemte regioner8, men injeksjon er mer nyttig når eksperimentet krever at hele utviklingsland embryo er målrettet. Denne injeksjon teknikken bør også være lett tilpasses for bruk i egg fra en rekke ulike hemimetabolous og holometabolous insekter, ideelt forbedre evnen til å gjennomføre meningsfulle komparative studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning rapportert i dette prosjektet ble støttet av en institusjonell utvikling Award (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under Grant nummer P20GM10342 til HH3, og av NSF Award nummer IOS-1257217 til CGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
