Summary
Aquí presentamos un protocolo para inyectar huevos de cricket, una técnica que sirve como método fundamental en muchos experimentos en el cricket, incluyendo, pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica.
Abstract
La alteración de la función génica en un organismo en desarrollo es fundamental para diferentes tipos de experimentos. Si bien se han desarrollado herramientas genéticas tremendamente poderosas en los sistemas de modelos tradicionales, es difícil manipular genes o ARN mensajero (ARNm) en la mayoría de los otros organismos. Al mismo tiempo, los enfoques evolutivos y comparativos se basan en una exploración de la función génica en muchas especies diferentes, lo que requiere el desarrollo y la adaptación de técnicas para manipular la expresión fuera actualmente tratable genéticamente Especies. Este protocolo describe un método para inyectar reactivos en huevos de grillo para analizar los efectos de una manipulación dada en el desarrollo embrionario o larvario. Se describen las instrucciones para recoger e inyectar óvulos con agujas biseladas. Esta técnica relativamente sencilla es flexible y potencialmente adaptable a otros insectos. Uno puede reunir e inyectar docenas de óvulos en un solo experimento, y las tasas de supervivencia para las inyecciones sólo de amortiguación mejoran con la práctica y pueden ser tan altas como 80%. Esta técnica apoyará varios tipos de enfoques experimentales, incluida la inyección de agentes farmacológicos, el ARNm tapado in vitro para expresar genes de interés, el ARN de doble cadena (dsRNA) para lograr la interferencia del ARN, el uso de Repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas (CRISPR) en conjunto con reactivos de proteína 9 (Cas9) asociados a CRISPR para modificación genómica y elementos transposables para generar líneas transgénicas transitorias o estables.
Introduction
La capacidad de modificar el genoma o influir en la expresión génica en los organismos es la base para el diseño de muchos tipos de experimentos que prueban la causalidad funcional. También es fundamental para el trabajo comparativo y evolutivo relevante que las técnicas de modificación genómica y no genómica estén disponibles en organismos fuera de los sistemas de modelos animales de laboratorio genético sin importancia (por ejemplo, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, y Caenorhabditis elegans). Ya sea el deseo de entender la diversidad del organismo1 o la adhesión de uno al principio de Krogh, que para cada pregunta biológica hay un organismo más adecuado para su solución 2,3, la capacidad de modificar genomas o la expresión génica es esencial para los diseños experimentales modernos.
El grillo Gryllus bimaculatus es un sistema modelo emergente. Utilizado durante el siglo pasado en experimentos de neuroetología4, las últimas dos décadas han sido testigos de un mayor interés experimental en el cricket, particularmente centrado en la evolución y desarrollo de este organismo5. El grillo es un insecto hemimetabolous que se ramifica basalmente a los insectos holometabolosos bien estudiados, como D. melanogaster y Tribolium castaneum6. Debido a su posición útil sobre el árbol evolutivo, los científicos están interesados en hacer preguntas experimentales modernas y sofisticadas en este insecto, lo que ha llevado a un creciente interés en adaptar las herramientas moleculares para su uso en G. bimaculatus.
Las inyecciones de reactivos moleculares en huevos de grillo se pueden utilizar para experimentos de modificación genómica, así como manipulaciones no genómicas de la expresión génica en embriones. Por ejemplo, se han creado inserciones transgénicas G. bimaculatus que transportan eGFP utilizando la transposase piggyBac7,8. Los investigadores han creado con éxito noqueos G. bimaculatus utilizando nucleasas de zinc-dedo (ZFN) y nucleasas de efector de activador de tipo activador de transcripción (TAL) (TALENs) para introducir roturas de doble cadena en regiones genómicas específicas9. Aunque los ZFN y los TALENs permiten la segmentación específica del sitio en animales más allá de los cuatro grandes sistemas de modelos, estos reactivos han sido rápidamente superados por el sistema CRISPR/Cas9, que es más fácil de usar, más eficiente y altamente flexible10. CRISPR se ha utilizado en G. bimaculatus para producir knock-out11, así como las líneas de knock-in12,13 Además de la modificación genómica, dsRNA se puede inyectar en los huevos para derribar la expresión de ARNm en el desarrollo embriones, permitiendo a los investigadores comprender el papel de las transcripciones específicas a lo largo del desarrollo14,15. Algunos detalles limitados sobre cómo inyectar huevos de grillo se han publicado anteriormente12.
Aquí, describimos un protocolo detallado para inyectar los primeros huevos de G. bimaculatus. Este protocolo es eficaz y fácilmente adaptable a varios entornos de laboratorio, materiales de inyección, y posiblemente a otros insectos. Si bien se han publicado detalles adicionales para diseñar e implementar experimentos de modificación genómica y derribo en otros lugares12,13, estos enfoques se basarán en última instancia en el protocolo de inyección detallado aquí.
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Protocol
1. Configuración de hardware y preparación de materiales
NOTA: Consulte la Tabla 1 y la Tabla de Materiales para la preparación de soluciones, reactivos y detalles del equipo.
- Colocar un microscopio de disección para ver los huevos y guiar la aguja de inyección. (LaFigura 1A muestra un microscopio de disección equipado con fluorescencia.) La capacidad de fluorescencia es ventajosa pero no necesaria.
- Coloque un micromanipulador de 3 ejes para maniobrar la aguja de inyección en su lugar (Figura1A).
- Configure un microinyector con tubo y un porta agujas para inyectar pequeñas cantidades de material (Figura1A). Opcionalmente, utilice un pedal que no se muestra en la figura.
- Diseñe y cree un sello para crear pozos para huevos (Figura1C)imprimiendo la inversa del patrón deseado, ya sea con una impresora 3D o un grabador láser.
NOTA: El sello de muestra impreso en 3D que se muestra es de 4,5 cm x 5 cm con protuberancias de 128, 3 cm x 1 cm x 1 cm para crear pozos individuales. Los detalles sobre cómo hacer una variedad de moldes personalizables se han publicado en otros lugares16. - Preparar 10x Injection Buffer, HEPES buffered saline (HBS), y una solución en stock de Tetramethylrhodamine Dextran tinte y almacenar a 4 oC.
- Preparar soluciones experimentales a inyectar, como dsRNA, CRISPR/Cas912, elementos transposibles, ARNm tapado in vitro7,8, agentes farmacológicos17, ZFN s o TALENS9.
- Coloque cinta adhesiva doble en varias capas de cinta de laboratorio estándar en una diapositiva de microscopio de vidrio para crear una plataforma de 1 mm más o menos por encima de la diapositiva de vidrio, que se utilizará para sostener agujas para la evaluación.
- Preparar un recipiente de cricket de aproximadamente 40 cm x 60 cm de tamaño con una tapa que posee una abertura cubierta de malla para la circulación de aire.
- Agregue alimentos, agua y materiales de refugio.
- Añadir varias docenas de grillos masculinos y femeninos sanos para adultos. Identifique el críquet adulto por la presencia de alas.
NOTA: Una gama de edades post-imaginales puede aumentar el rendimiento de los huevos. La densidad de los grillos debe ser relativamente alta para poder recoger suficientes huevos para un experimento, pero no tan lleno como que se produce el canibalismo. Por ejemplo, aproximadamente dos docenas de grillos sanos, con una proporción de macho a hembra aproximadamente igual, en un recipiente del tamaño mencionado anteriormente debe ser suficiente para recoger alrededor de 200 huevos en un período de uno a dos h. Los grillos se pueden mantener a temperatura ambiente, pero el desarrollo y el comportamiento serán óptimos si los grillos se mantienen en una incubadora cálida (23,5-26 oC), húmeda (40 - 60% de humedad relativa).
2. Fabricación de agujas para inyección
- Utilice capilares de vidrio borosilicato con filamento (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de tamaño). Prepare las agujas de tracción el mismo día, o hasta unos días antes de que se completen las inyecciones.
- Coloque un vidrio capilar en el tirador, centre el vidrio en el filamento y apriete las perillas para fijar el vidrio en su lugar.
- Ajuste la temperatura del tirador cerca de la temperatura de la rampa de vidrio (-5 oC a +10 oC).
- Utilice un protocolo de un solo paso y alto calor para tirar de un cono largo con una pequeña abertura, pero evite fundir los extremos cerrados.
NOTA: Por ejemplo, cuando utilice el tirador de micropipetas detallado en la Tabla de Materiales equipados con un filamento de caja, utilice los siguientes parámetros para vidrio con una temperatura de rampa de 478: Calor 478; Tire 45; Vel 75; Del 120. Las condiciones óptimas para producir una aguja con la forma mostrada en la Figura 2B deben ser determinadas empíricamente por cada usuario. - Puntas de aguja biselada en preparación para las inyecciones.
- Humedezca el plano de la trituradora giratoria del biselador (Figura2A)con agua goteando. Utilice ósmosis inversa (RO) o agua destilada tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).
- Coloque la aguja tirada en el biselador y gire a un ángulo de 20o.
- Baje la aguja hasta que toque el plano de molienda y bisele durante 2 a 3 minutos.
- Evalúe el bisel colocando la aguja biselada en cinta de doble palo que se haya adherido a un portaobjetos de microscopio de vidrio.
- Coloque la diapositiva sosteniendo la aguja en el escenario de un microscopio compuesto equipado con una cámara y un software de adquisición de imágenes.
- Adquiera una imagen de la punta de la aguja utilizando un objetivo de 20x.
- Utilice el software de imágenes para medir el diámetro de los lúmenes interiores de la aguja sólo proximal a la abertura biselada (Figura2C). El tamaño óptimo es de 10 m + 2 m.
- Deseche las agujas que tengan una abertura por debajo de 8 m y por encima de 12 m.
- Guarde las agujas en un recipiente con una tapa para evitar que se enpolvoree. Utilice una tira de cera o material similar para elevar las agujas de la parte inferior del recipiente para evitar romper las puntas (Figura2D).
3. Recogida y preparación de huevos
- Maximizar el número de huevos puestos privando a los grillos de cualquier material de puesta de humedad (viales de agua, platos de huevo) durante la noche o durante al menos 8-10 h antes de intentar recoger los huevos.
NOTA: Dado que las hembras tienen la capacidad de almacenar internamente espermatozoides, un procedimiento cronometrado diferente puede ser necesario si la fertilización cuidadosamente cronometrada es experimentalmente esencial18. - Hacer 40 ml de agarosa al 1% en agua y verter en un plato de petri de 10 cm.
- Coloque un sello de pozo de huevo en la superficie de la agarosa antes de que se solidifique.
- Retire el sello, una vez que la agarosa se solidifica, para revelar los pozos (Figura1C).
- Llene la placa de pozo de agarosa con HBS que contiene 1% Penicilina/Estreptomicina.
- Colocar la tapa en el plato, envolver en parafilm y almacenar a 4oC.
NOTA: Los platos se pueden almacenar durante unos días a 4 oC, pero deben calentarse a temperatura ambiente antes de su uso para evitar la condensación. - Haga un plato de recolección de huevos para que los grillos pongan huevos llenando un plato de petri de 35 mm con arena blanca del patio de recreo (Figura1B).
NOTA: La arena especificada en la Tabla de Materiales es del tamaño de grano adecuado. Si los granos de arena son demasiado grandes, la arena dañará los huevos. - Cubra el plato de huevo con un cuadrado de toalla de papel cortado para ser de aproximadamente 18 cm x 18 cm, y colóquelo en la parte superior del plato con arena. A través de esta toalla de papel cubra el plato lleno con agua del grifo.
- Incline el plato de petri y apriete suavemente la parte superior para eliminar el exceso de agua.
- Coloque las esquinas del cuadrado de la toalla de papel debajo del plato y coloque el plato de huevo en la tapa invertida, lo que ayudará a mantener la toalla de papel en su lugar.
- Coloque el plato de huevo en el recipiente de cricket y deje que las hembras adultas ovipositen huevos durante uno a dos h.
NOTA: El tiempo relativamente corto aquí asegura que todos los huevos serán similares en la etapa de desarrollo en el momento de la inyección. Si la inyección antes de la celularización es importante, las inyecciones deben ocurrir dentro de 14 h de la puesta de óvulos19. - Mientras tanto, deje que el plato de agarosa (desde el paso 3.6) se caliente a temperatura ambiente en preparación para la retención de los huevos para la inyección.
- Retire el plato de recolección de huevos, que ahora contiene huevos recién puestos, del cubo de cricket, y retire la toalla de papel. Coloque un colador con un tamaño de poro de 0,5-1 mm sobre un vaso de precipitados de al menos 500 ml de capacidad (Figura1B).
- Enjuague el contenido del plato de puesta de huevos (arena y huevos) en el colador bajo el agua del grifo que corre suavemente dejando que los granos de arena caigan a través de la malla del colador en el agua en el vaso de precipitados de abajo, pero dejando los huevos de grillo en la cesta del colador.
- Llene un recipiente con agua RO y colóquelo en una bandeja. Invierta el colador sobre el recipiente y tóquelo contra el plato para desalojar los huevos en el agua. Los huevos se hundirán en el fondo del recipiente.
- Corte la punta de una punta de pipeta P1000 con tijeras para hacer una abertura de aproximadamente 3 mm de diámetro. Coloque esta punta en un pipeteador P1000 y úsela para transferir los huevos del recipiente al plato de molde de huevo de agarosa, transfiriendo la menor agua posible.
- Use pinzas de plástico para alinear los huevos en pozos de agarosa llenos de HBS más 1% Penicilina/Estreptomicina. Cada huevo se hundirá en el fondo de un pozo individual. Cubra con la tapa del plato de petri hasta que esté listo para inyectar.
4. Prepare el microinyector
- Conecte el microinyector a una fuente de aire comprimido o gas (este protocolo se optimizó utilizando aire comprimido o N2).
NOTA: Si utiliza un tanque de aire portátil, llene a por lo menos 75 psi. El tanque perderá presión de aire durante todas las inyecciones y puede necesitar ser rellenado; las inyecciones se vuelven difíciles por debajo de 40psi. - Encienda el microinyector. Ajuste el tiempo de inyección a 0,17 s y la presión a 10-15 psi.
NOTA: La presión exacta necesaria dependerá de la apertura de la aguja y debe determinarse empíricamente para cada ronda de inyección y/o nueva aguja utilizada. - Asegúrese de que la perilla BALANCE del microinyector esté girada a 0 (normalmente completamente en sentido contrario a las agujas del reloj) y que el microinyector esté presurizado y en el modo de inyección.
5. Inyecciones
- Filtrar alrededor de 500 l de búfer de inyección de 10x utilizando una jeringa de 1 ml y un filtro de jeringa de 0,45 m.
- Reactivos de inyección de mezcla (los detalles que siguen son para la inyección de dsRNA preparado como se describe en12).
NOTA: Puede ser aconsejable diseñar y realizar varios controles, especialmente cuando uno está aprendiendo esta técnica por primera vez. Poking eggs without injectioning, injecting buffer + dye alone, or injecting buffer + dye + a control reagent (such as eGFP dsRNA) are all good tests of how disrupt various elements of the injection protocol might be. Consulte la figura 3 para la supervivencia de varios controles diferentes. - Comience con una alícuota de 4 ml dsRNA.
- Agregue 0,5 ml del búfer de inyección filtrado 10x a la alícuota dsRNA.
- Añadir 0,5 ml de 50 mg/ml de tetrametil rhodamina Dextran solución de tinte. Si trabaja en un ámbito de diseción sin fluorescencia, utilice Phenol Red en su lugar.
- Mantenga todos los materiales sobre hielo durante el período de inyección.
- Cargue la solución inyectable en una aguja de inyección con puntas de carga de 20 ml y un pipeta p10.
- Elaborar una solución de inyección de 1,5 ml e insertar la punta de carga en el extremo ancho de la aguja de inyección.
- Expulse la solución lo más abajo posible en la aguja y elimine las burbujas de aire parpadeando suavemente; tenga cuidado de no romper la aguja.
- Coloque el plato de huevos bajo el microscopio de disección y seleccione un aumento bajo de alrededor de 10x (1x aumento visto a través de objetivos oculares 10x).
- Inserte la aguja en la carcasa de inyección y apriete.
NOTA: Tenga cuidado de que la aguja esté bien insertada y firmemente insertada en la carcasa. Para ello, tire del extremo ancho de la aguja hacia atrás fuera de la carcasa de metal, trayendo el tubo de silicio en la carcasa con él. Ajuste el tubo de silicio para que el extremo de vidrio de la aguja sobresalga justo más allá del silicio. Si esto no se hace, el tubo de silicio puede ser pellizcado entre el vidrio y la carcasa de metal, bloqueando el extremo de la aguja. - Inserte cuidadosamente la carcasa de inyección con una aguja conectada en el micromanipulador. Tenga en cuenta el extremo afilado de la aguja y tenga cuidado de que no se tropieza con superficies y se rompa.
- Mientras mira los huevos y la aguja a través del microscopio, mueva la aguja cerca de los huevos en la esquina superior izquierda de la rejilla del plato.
- Baje la aguja hasta que la punta entre en el HBS más una solución tamponada con 1% de penicilina/estreptomicina en el plato.
- Centra la aguja en el campo de visión y mueve el plato de huevo para que la aguja esté unos pocos mm más cerca del borde del plato que los huevos.
- No obstruya la vista de la rejilla de los huevos con la aguja.
- Ajuste el microscopio al filtro adecuado para Rhodamine para que sea posible observar la fluorescencia en la aguja y centrarse en la punta de la aguja.
- En el microinyector, gire lentamente la perilla BALANCE en el sentido de las agujas del reloj hasta que la solución inyectable comience a salir de la aguja en la solución de suspensión. El número de saldo en la pantalla del microinyector comenzará a aumentar, aunque el valor numérico no es importante. A continuación, gire la perilla hacia atrás en sentido contrario a las agujas del reloj ligeramente hasta que el tinte deje de salir de la aguja.
NOTA: Es fundamental ajustar este equilibrio cada vez que se utiliza una nueva aguja. Sin el conjunto de equilibrio adecuadamente, el microinyector continuará inyectándose durante algún tiempo después de que se active la inyección. Incluso es posible que un solo pulsador del botón de inyección con una aguja desequilibrada resulte en la expulsión de todo el contenido de la aguja cargada. - Con la aguja centrada en el campo de visión, mueva la placa de huevo para que la aguja esté dirigida al huevo que se va a inyectar primero. Se recomienda que las inyecciones comiencen en una esquina de la cuadrícula de huevos dispuestos, por ejemplo, la esquina superior izquierda.
- Ajuste el aumento a unos 50x; en este aumento, un solo huevo llenará la mayor parte del campo de visión.
- Utilice tanto el micromanipulador como la mano en la bandeja de huevo para mover la aguja en su posición para la inyección.
- Avance la aguja con el micromanipulador e inserte la punta de la aguja en el primer óvulo que se va a inyectar.
- Inserte la aguja a una longitud de huevo de 20–30% desde el extremo posterior (más contundente) del huevo (Figura1E),perpendicular al eje largo del huevo.
- Inyecte la solución con el pedal de inyección o el botón de inyección en el microinyector. Un pequeño bolo de material fluorescente dentro del huevo indicará una inyección exitosa (Figura1D).
NOTA: No es raro que alguna yema sea expulsada del óvulo durante la inyección (Figura1F),y esto no indica necesariamente que el óvulo inyectado será inviable. - Retira la aguja del huevo. Si el huevo se levanta involuntariamente de su pozo tras la retracción de la aguja, utilice pequeños fórceps para empujar el huevo de nuevo a su pozo mientras retrae la aguja.
- Si la aguja se obstruye durante la inyección, retire la aguja del huevo y, manteniendo la aguja sumergida en el HBS más 1% solución de penicilina/estreptomicina que cubra los huevos, limpie la aguja obstruida con la función Clear o presionando la inyección Botón.
- Continuando con el uso de la misma aguja, repita el procedimiento de inyección para el mayor número de huevos posible. Al principio, esto puede ser sólo alrededor de 20 o 30 huevos, pero aumentará a más de 100 con la práctica.
- Si la aguja se obstruye y no se puede limpiar, deseche la aguja, llene una aguja nueva y comience de nuevo (es decir, vuelva al paso 5.7).
- Almacenar el plato de los huevos inyectados en una incubadora caliente (23,5–26 oC) ligeramente húmeda (para minimizar la evaporación) hasta que los embriones hayan alcanzado la etapa de desarrollo deseada para el análisis.
- Al menos cada 24 h, retire los huevos que ya no sean viables (Figura3A,B)y reemplace la solución de suspensión por HBS fresco más 1% Penicilina/Estreptomicina.
- Dos a tres días después de la inyección, transfiera los huevos mediante pipeteo suave o con fórceps de plástico a toallas de papel humedecidas con HBS más 1% penicilina/estreptomicina en un plato de petri con tapa para continuar el desarrollo en la incubadora cálida y húmeda.
- Supervise los huevos y retire los huevos que ya no sean viables cada día (Figura3A,B).
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Representative Results
Los grillos ponen fácilmente los huevos en el material húmedo, y proporcionando material adecuado, como arena húmeda o suciedad, los induce a poner un gran número de huevos. Esto es especialmente eficaz si los grillos se ven privados primero de material de puesta de huevos durante 8-10 h. Los huevos colocados en arena limpia se pueden separar fácilmente, recoger (Figura1B)y colocarse en pozos de huevo sin cáscara de inyección diseñados a medida (Figura1C). Se puede utilizar un microscopio de disección, un microinyector y un micromanipulador (Figura1A)para inyectar óvulos individuales con una variedad de materiales (Figura1D). Los huevos se inyectan cerca del extremo posterior, en un punto de aproximadamente 20-30% a lo largo del eje anterior-posterior (Figura1E). Distinguir el extremo anterior más puntiagudo del extremo posterior más contundente puede ser difícil, ya que estas diferencias son a menudo sutiles (Figura1E). Rodar un huevo de lado a lado a menudo ayuda a revelar qué extremo es cuál. Después de la extracción de la aguja de inyección, la yema de huevo a veces se expulsa (Figura1F),aunque esto no parece comprometer la salud del embrión en desarrollo en su interior.
Uno de los pasos más críticos de este protocolo es la preparación de agujas biseladas. Después de tirar de agujas largas y delgadas, se deben biselar a un ángulo de 20o y tener un diámetro de apertura de 10 m (2 m). Si el diámetro es demasiado grande, la solución inyectable se filtrará fuera de la aguja, y estas agujas crearán grandes agujeros en los huevos, disminuyendo las tasas de supervivencia. Las agujas más estrechas aumentan la supervivencia, pero si son demasiado estrechas, tienden a obstruirse fácilmente, lo que hace que las inyecciones sean lentas y frustrantes. Con un diámetro de aguja de 10 m a 2 m, es posible inyectar más de 100 huevos con una sola aguja sin tener la aguja obstruyéndose.
Las agujas se pueden biselarse con una micro amoladora o biselada (Figura2A). Estas piezas de equipo se pueden obtener con un microscopio conectado, o se podría añadir un alcance de disección en un soporte independiente para modelos que no incluyen el microscopio. Un pequeño micromanipulador sostiene la aguja, que se puede inclinar al ángulo deseado y bajar a la superficie de un plano de molienda giratorio, que se humedece con agua que gotea. Un ejemplo de una aguja tirada, pero no biselada se puede ver en la Figura 2B,y una aguja con un bisel de 20o se muestra en la Figura 2C. Las agujas deben almacenarse de forma segura para evitar daños y mantenerse limpias (Figura2D).
Ajustar la balanza y la presión de inyección adecuadamente en el microinyector debe permitir que se inyecte una cantidad comparable de material en cada óvulo inyectado con la misma aguja. La optimización de las presiones de inyección y equilibrio será necesaria al cambiar a una aguja con un diámetro diferente. Esta optimización maximizará la consistencia de los pulsos de inyección.
La tasa de supervivencia es un parámetro importante para evaluar el éxito de estos experimentos. La mayoría de los óvulos muertos se pueden identificar fácilmente a simple vista de la siguiente manera: la yema y el tejido embrionario dentro del óvulo comienzan a aglutinarse de manera desigual (Figura3A)y, finalmente, la mayor parte de la yema migrará a un lado del óvulo (Figura3B). Cuando se evalúa después de 4-6 días (equivalente a las etapas 8–15)19, más del 85% de los huevos no inyectados sobrevivieron, mientras que los huevos inyectados con reactivos experimentales generalmente tenían una tasa de supervivencia más baja (Figura3C). El control de todos los aspectos de la inyección en sí, incluyendo la punción de la aguja, la introducción de tinte y tampón, o la presencia de vehículo o dsRNA, es necesario para entender los verdaderos efectos de la manipulación experimental intentada(Figura 3C). Dependiendo de la manipulación experimental, puede esperarse un mayor nivel de letalidad, y es posible que sea necesario modificar el momento del ensayo o el momento de la inyección para evaluar los efectos no letales de la manipulación.
La forma en que se evalúan los resultados fenotípicos de la inyección depende de lo que se inyectó. Por ejemplo, los cambios fenotípicos como resultado de derribos específicos de ARNm pueden ser obvios a nivel de anatomía gruesa. Por ejemplo, el gen Enhancer de zeste (E(z)) normalmente suprime los genes Hox, incluyendo Ultrabithorax (Ubx). La inyección de dsRNA para E(z) derriba la función E(z) y libera la supresión de Ubx, lo que da como resultado la expresión ectópica Ubx. Esto conduce a la transformación de cinco pares de apéndices ventrales (antena, maxilar, labium, T1 y T2 pierna) en apéndices tipo pierna T3, debido a la despresión de Ubx en esos segmentos20. En un segundo ejemplo, es posible utilizar la expresión GFP para probar la inserción correcta de un transgén. Por ejemplo, cuando un cDNA que codifica un gen Histone 2B con etiqueta eGFP bajo el control de un promotor de G. bimaculatus Actin se insertó en el genoma del cricket usando piggyBac transposase, se hizo posible visualizar cada núcleo en el huevo utilizando fluorescencia para excitar laproteína His2B etiquetada con eGFP (Figura 4C,D). En este caso, fue posible controlar el movimiento de los núcleos a lo largo del tiempo7.
| Nombre de la solución | Componentes | Comentarios/Descripción |
| 10x Solución de tampón de inyección | En 1 L H2O añadir: 0,8 g De NaCl, 0,09 g Na2HPO4, 0,04 g KH2PO4, 2,98 g KCl | Almacenar a 4oC. Filtrar una pequeña cantidad inmediatamente antes de usar con una jeringa de 1 ml equipada con un filtro de jeringa de 0,45 m. Repita según sea necesario para filtrar aproximadamente 500 ml de solución inyectable. Mantenga la solución de inyección filtrada en hielo durante el experimento. |
| Solución salina tamponada HEPES | En 1 L H2O, añadir: 8,77 g NaCl, 5,2 g HEPES, | pH a 7,0 y conservar a 4oC. |
| Tetrametil Rhodamine Dextran (10.000 MW) solución de stock de tinte | Tinte de Rhodamine de Thermofisher | Este tinte se vende a menudo como un polvo liofilizado. En este caso, conforman una solución de stock de 50 mg/ml con agua. Centrífuga a 12.000 x g durante 5 min para eliminar cualquier partícula insoluble. Recoger el sobrenadante después de la centrifugación, evitando cualquier partícula en la parte inferior del tubo, alícuota y congelar a -20 oC. Las alícuotas de stock en uso se pueden mantener a 4 oC durante una o dos semanas. Evite las alícuotas de congelación de descongelación varias veces. Si las agujas se obstruyen debido al tinte, el tinte también se puede filtrar a través de Whatman #2 papel de filtro. |
Tabla 1: Recetas y notas de la solución.
Figura 1: Visión general del protocolo de inyección de óvulos. (A) Una configuración típica que se puede utilizar para las inyecciones de óvulos. (B) Los huevos se separan de la arena a través de un tamiz. (C) Los huevos se mantienen inyectables en pequeños pozos fabricados colocando un molde en agarosa tibia y líquida. (D) La fluorescencia en la aguja y en cinco huevos inyectados se puede ver a través del microscopio de disección fluorescente. (E) Un huevo sin inyectar. El extremo anterior (ligeramente puntiagudo; izquierdo) y el extremo posterior (más contundente; derecho) se distinguen entre sí. La región más adecuada para la inyección, cerca del extremo posterior, se muestra con el soporte. (F) Un óvulo dos días después de la inyección. El lugar de inyección es visible como una ligera decoloración, y una pequeña cantidad de yema expulsada es evidente (flecha). Barras de escala de 1 mm (D); 0,5 mm (E y F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las agujas se biselan con una micro amoladora o biselada. (A) Un ejemplo de una micro amoladora con una superficie de molienda circular y giratoria humedecida por el agua RO que gotea (el agua gotea de la jeringa que se muestra en la parte superior de la imagen). (B) Antes de biselar, las agujas tiradas son largas y estrechas. (C) Después de biselar a 20o, se crea una aguja de inyección afilada. Tenga en cuenta el diámetro de 10 m del lumen interior. (Barras de escala roja a 10 m). (D) Las agujas biseladas tiradas se pueden almacenar en un plato de Petri con una tapa y mantenerse en su lugar con cera dental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Las inyecciones pueden disminuir la tasa de supervivencia. (A) Los huevos muertos y moribundos son obvios tras la inspección visual. (B) Con el tiempo, el material migrará a un lado del huevo. (C) Comparación de las tasas de supervivencia de cuatro a seis días después de la puesta de óvulos para una variedad de condiciones, incluyendo: huevos no inyectados (n 6 experimentos); huevos perforados con una aguja de 9 m pero sin inyectar (experimentos n a 2); huevos inyectados con tampón y tinte (n 13 experimentos); huevos inyectados con tampón, tinte y vector plásmido (experimentos n-2); huevos inyectados con tampón, tinte y DMSO (n 11 experimentos); y huevos inyectados con tampón, tinte y control dsRNA (n 22 experimentos). El tipo de dsRNA de control utilizado incluía dsRNA contra eGFP o dsRed. Los números en la base de cada barra notan el número total de huevos supervivientes / huevos totales utilizados para cada condición. Las barras de error representan un error estándar de la media. Barra de escala de 1 mm (A y B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación de los resultados de la inyección. (A-B) Inyección de Enhancer de Zeste (E(z)) dsRNA altera la expresión normal de Ubx mRNA (tipo salvaje mostrado en (A) y conduce a la transformación de antenas (AN) y partes de la boca (Mx, Lb) en apéndices similares a las piernas (B). (C-D) La inyección de óvulos tempranos con el elemento transposable piggyBac y histone2B-eGFP produce embriones transgénicos que expresan GFP en todos los núcleos. La ubicación de los núcleos se puede observar 8 h después de la puesta del huevo (C) y 20 h después de la puesta del huevo (D). Abreviaturas: Una antena; Mx á maxilar; Lb á laboratorio; T1-3 - Patas torácicas 1 a 3; ARN- Interferencia de ARN; Gb á G. bimaculatus; Acta- actina; H2B - Histone H2B; GFP - proteína fluorescente verde. Barras de escala a 200 m (A y B); 500 m (E y F). Estos resultados experimentales se describieron originalmente en otros lugares7,20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los dos principales desafíos con esta técnica son los problemas relacionados con el tamaño óptimo de la aguja y la supervivencia. Aunque las agujas más pequeñas mejoran la supervivencia, las agujas con lúmenes más estrechos tienen un mayor grado de fuerzacapilar en el trabajo, lo que hace que sea más probable que la yema se mueva en la aguja haciendo que se obstruya. En el mejor de los casos, los bloqueos se pueden eliminar simplemente inyectando otro huevo o limpiando la aguja como se describió anteriormente. También se puede intentar aumentar la presión de equilibrio sobre el microinyector hasta que la yema se expulse de la aguja. El otro gran desafío con esta técnica es la supervivencia. En nuestras manos, las tasas de supervivencia de los huevos inyectados con soluciones experimentales suelen estar entre el 40 y el 80%. Las tasas de supervivencia pueden ser tan bajas como 10% para aquellos que comienzan a aprender esta técnica, pero mejorarán con la práctica. Los controles negativos, como se ha descrito anteriormente, son importantes para que los investigadores evalúen con precisión los cambios en la tasa de supervivencia con la práctica, dado que la introducción de diversos materiales puede reducir las tasas de supervivencia (Figura3C).
El momento de las inyecciones es una consideración importante para cada enfoque experimental, así. Los óvulos más viejos son más difíciles de inyectar que los más jóvenes, y en general, las tasas de supervivencia son más altas cuando se inyectan más jóvenes en lugar de los huevos más viejos. La introducción de la aguja y el material inyectado en etapas posteriores puede conducir a daños anatómicos no intencionales. Con experiencia, sin embargo, la inyección de huevos de dos a tres días de edad es posible. Apuntar al lado dorsal del óvulo en estas etapas ayuda a evitar dañar el embrión, que primero se forma en el lado ventral. Apuntar al extremo posterior puede aumentar el acceso de los reactivos a las primeras divisiones nucleares y la formación de bandas germinales, que se producen cerca de este extremo del huevo19,21. Si se está intentando manipular el genoma, con el objetivo de lograr una transmisión somática o germinal generalizada de la modificación del genoma, se deben realizar inyecciones antes de la celularización, que comienza aproximadamente 14 h después de la puesta de óvulos19 . Si la inyección de dsRNA a los niveles de ARNm derribo, el plazo para las inyecciones debe determinarse en función de lo temprano en el desarrollo que uno desea derribar un gen de interés. Mientras que los efectos del ARNi probablemente duren algún tiempo, dsRNA necesita ser introducido antes de la hora en que uno planea evaluar cualquier cambio en el fenotipo. Llevar un registro del tiempo transcurrido durante la inyección y la progresión del desarrollo embrionario puede ser importante para asegurarse de que se inyectan los óvulos en estadio adecuados. Independientemente del material que se inyecte, los retrasos en el desarrollo después de la inyección son comunes, aunque el grado del retraso puede variar dependiendo del inyector.
El protocolo presentado aquí se basa en una serie de equipos relativamente caros. Sin embargo, debería ser posible inyectar huevos con éxito sin el uso de algunos o incluso todos estos artículos. Por ejemplo, hay una variedad de microinectores en el mercado, y algunos pueden ser menos costosos que el sugerido en la Tabla de Materiales. También es posible simplemente utilizar una jeringa para inyectar una cantidad adecuada de material, aunque esto tomaría alguna práctica. En lugar de un micromanipulador caro, uno podría utilizar una variedad de materiales para mantener la aguja estable y permitir un avance lento, controlado, y un diseño de plastilina simple ha sido utilizado por otros22. También puede ser posible evitar el uso de un beveller, aunque en nuestra experiencia biselado adecuado puede hacer una enorme diferencia para el éxito de las inyecciones. Puede ser posible afilar una aguja tirada arrastrando la punta de la aguja a mano a través del papel de arena más fino, evaluando este proceso bajo un microscopio. A pesar de todo, las agujas afiladas facilitarán las inyecciones y mejorarán la supervivencia.
Esta técnica de inyección es flexible y se puede utilizar para una variedad de diferentes manipulaciones. Aquí, hemos mostrado resultados para experimentos de modificación genómica dependientes de dsRNA y piggyBac, pero también es posible utilizar CRISPR/Cas u otros enfoques con esta técnica. En los experimentos incluidos aquí, los fenotipos resultantes eran obvios y fáciles de evaluar. Algunos experimentos pueden requerir el uso de inmunohistoquímica u otras herramientas de visualización con el fin de ver los efectos de la manipulación experimental. Una alternativa a las inyecciones es el uso de electroporación, que se puede utilizar para introducir ADN u otras macromoléculas en células y tejidos in vivo. La electroporación se puede utilizar en huevos de cricketmás antiguos donde ya se han formado embriones para apuntar a regiones específicas 8, pero la inyección es más útil cuando el experimento requiere que todo el embrión en desarrollo esté dirigido. Esta técnica de inyección también debe ser fácilmente adaptable para su uso en huevos de una variedad de diferentes insectos hemimetabolous y holometabolous, idealmente mejorando la capacidad de realizar estudios comparativos significativos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación reportada en este proyecto fue apoyada por un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención P20GM10342 a HH3, y por el número de premio NSF IOS-1257217 a Cge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
