Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att injicera cricket ägg, en teknik som fungerar som en grundläggande metod i många experiment i cricket, inklusive, men inte begränsat till, RNA-interferens och genomisk manipulation.
Abstract
Att förändra gen funktionen i en utvecklande organism är central för olika typer av experiment. Medan oerhört kraftfulla genetiska verktyg har utvecklats i traditionella modellsystem, är det svårt att manipulera gener eller Messenger-RNA (mRNA) i de flesta andra organismer. Samtidigt förlitar sig evolutionära och komparativa metoder på en utforskning av genfunktion hos många olika arter, vilket nödvändiggör utveckling och anpassning av tekniker för att manipulera uttryck utanför för närvarande genetiskt tractable Arter. Detta protokoll beskriver en metod för att injicera reagenser i cricket ägg att analysen effekterna av en viss manipulation på embryonal eller larv utveckling. Anvisningar för hur man samlar in och injicerar ägg med avfasade nålar beskrivs. Denna relativt enkla teknik är flexibel och potentiellt anpassningsbar till andra insekter. Man kan samla och injicera dussintals ägg i ett enda experiment, och överlevnaden för buffert-bara injektioner förbättra med praktik och kan vara så hög som 80%. Denna teknik kommer att stödja flera typer av experimentella metoder, inklusive injektion av farmakologiska medel, in vitro-utjämnade mRNA att uttrycka gener av intresse, dubbelsträngad RNA (dsRNA) för att uppnå RNA-interferens, användning av klustrade regelbundet korta palindromiska repetitioner (CRISPR) i samförstånd med CRISPR-associerat protein 9 (Cas9) reagenser för genomisk modifiering, och överföras element för att generera övergående eller stabila transgena linjer.
Introduction
Förmågan att modifiera arvsmassan eller påverka genuttrycket i organismer är grunden för utformningen av många typer av experiment som testar funktionell kausalitet. Det är också kritiskt för det komparativa och evolutionärt relevanta arbetet att teknikerna för genomisk och icke-genomisk modifiering finns tillgängliga i organismer utanför traditionella genetiska laboratorie modeller (t. ex. mus Musculus, Danio rerio, Drosophila melanogasteroch Caenorhabditis elegans). Oavsett om det är viljan att förstå organismers mångfald1 eller en anslutning till Krogh princip, att för varje biologisk fråga finns en organism som är bäst lämpad för sin lösning2,3, förmågan att ändra genom eller inflytande genuttrycket är viktigt för modern experimentell design.
Cricket gryllus bimaculatus är ett framväxande modellsystem. Används för det senaste århundradet i neuroethology experiment4, de senaste två decennierna har bevittnat ett ökat experimentellt intresse för cricket, särskilt inriktad på utvecklingen och utvecklingen av denna organism5. Cricket är en hemimetabolous insekt som grenar basalt till väl studerade holometabolous insekter, såsom D. melanogaster och Tribolium Auktor6. På grund av sin användbara position på den evolutionära träd, forskare är intresserade av att ställa moderna, sofistikerade experimentella frågor i denna insekt, vilket har lett till ett växande intresse för att anpassa molekylära verktyg för användning i G. bimaculatus.
Injektioner av molekylära reagenser till Cricket ägg kan användas för genomisk modifiering experiment samt icke-genomisk manipulationer av genuttryck i embryon. Till exempel transgena G. bimaculatus redovisade egfp-infogningar har skapats med hjälp av transposase piggybac7,8. Utredare har framgångsrikt skapat knockout G. bimaculatus med zink-Fingernukleaser (ZFNs) och transkription Activator-liknande (tal) Effektornukleaser (talens) för att införa dubbelsträngade raster i specifika genomiska regioner9. Även om ZFNs och TALENs tillåter platsspecifik inriktning hos djur bortom de fyra stora modell systemen, har dessa reagenser snabbt överträffats av CRISPR/Cas9-systemet, vilket är enklare att använda, effektivare och mycket flexibelt10. CRISPR har använts i G. bimaculatus för att producera Knock-Out11 samt Knock-in-linjer12,13 utöver genomisk modifiering kan dsRNA injiceras i ägg för att slå ner mRNA-uttrycket i utvecklingen embryon, vilket gör det möjligt för utredarna att förstå de specifika Avskriftens roll under hela utvecklingen14,15. Några begränsade Detaljer om hur man injicerar cricket ägg har publicerats tidigare12.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att injicera tidiga G. bimaculatus -ägg. Detta protokoll är effektivt och lätt att anpassa till olika laboratorie inställningar, injektions material, och möjligen till andra insekter. Även om ytterligare Detaljer för utformning och genomförande av genomiska modifikationer och knockdown experiment har publicerats på andra ställen12,13, kommer dessa metoder i slutändan att förlita sig på det insprutnings protokoll som beskrivs här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hardware Setup och beredning av material
Anmärkning: Vänligen se tabell 1 och tabell över material för beredning av lösningar, reagens och utrustningsdetaljer.
- Ställ in en dissekera Mikroskop för att se ägg och vägleda injektionsnålen. (Figur 1a visar ett dissekera Mikroskop utrustat med fluorescens.) Fluorescensförmågan är fördelaktig men inte nödvändig.
- Placera en mikromanipulator med 3 axlar för att manövrera injektionsnålen på plats (figur 1a).
- Ställ in en mikroinjektor med slang och en nålhållare för att injicera små mängder material (figur 1a). Du kan också använda en fotpedal som inte visas i figuren.
- Designa och skapa en stämpel för att skapa brunnar för ägg (figur 1c) genom att skriva ut inversen av det önskade mönstret, antingen med en 3D-skrivare eller en laser gravör.
Anmärkning: Den 3D-tryckta provstämpeln som visas är 4,5 cm x 5 cm med 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm utskjutande delar för att skapa enskilda brunnar. Detaljer om hur man gör en mängd anpassningsbara formar har publicerats på andra ställen16. - Förbered 10X injektion buffert, HEPES buffrad saltlösning (HBS), och en stamlösning av Tetramethylrhodamine dextran Dye och förvara vid 4 ° c.
- Förbered experimentella lösningar som ska injiceras, såsom dsRNA, CRISPR/Cas912, överföras element, in vitro-utjämnade mRNA7,8, farmakologiska medel17, zfns, eller talens9.
- Placera dubbel-stick tejp på flera lager av standard Lab tejp på ett glas Mikroskop bild för att skapa en plattform 1 mm eller så ovanför glas bilden, som kommer att användas för att hålla nålar för bedömningen.
- Förbered en cricket container ca 40 cm x 60 cm i storlek med ett lock som har en mesh-täckt öppning för luftcirkulation.
- Tillsätt mat, vatten och skyddande material.
- Lägg till flera dussin friska manliga och kvinnliga vuxna syrsor. Identifiera vuxen cricket av närvaron av vingar.
Anmärkning: En rad post-imaginal åldrar kan öka ägg avkastningen. Tätheten av syrsor bör vara relativt hög för att kunna samla tillräckligt med ägg för ett experiment, men inte så trångt att kannibalism uppstår. Till exempel, ungefär två dussin friska syrsor, med en ungefär lika manliga till kvinnliga förhållandet, i en behållare av den storlek som anges ovan bör vara tillräckligt för att samla in om 200 ägg i en en till två h period. Syrsor kan hållas vid rumstemperatur, men utveckling och beteende kommer att vara optimalt om syrsor upprätthålls i en varm (23,5-26 ° c), fuktig (40-60% relativ fuktighet) inkubator.
2. göra injektionsnålar för injektion
- Använd borosilikatglas kapillärer med glödtråden (se tabellen av material för storleks Detaljer). Förbered dragnålar på samma dag, eller upp till några dagar innan injektioner är klar.
- Placera ett kapillärglas i avdragare, centrera glaset på glödtråden, och dra åt rattarna för att säkra glaset på plats.
- Ställ in avdragare temperaturen nära glas rampens Temp (-5 ° c till + 10 ° c).
- Använd ett enstegs, hög värme protokoll för att dra en lång Kona med en liten öppning men Undvik att smälta ändarna stängda.
Anmärkning: Till exempel, vid användning av micropipett avdragare som beskrivs i tabellen av material som är försedda med en låda glödtråden, Använd följande parametrar för glas med en ramptemperatur på 478: värme 478; Drag 45; Vel 75; Del 120. Optimala förhållanden för att framställa en nål med formen som visas i figur 2b bör bestämmas empiriskt av varje användare. - Avfasnings nål tips som förberedelse för injektionerna.
- Blöt den snurrande kvarnen planet av maskin (figur 2A) med droppande vatten. Använd antingen omvänd osmos (RO) eller diethylpyrokarbonat (DEPC)-behandlat destillerat vatten.
- Placera den dragna nålen i maskin och vrid till en 20 ° vinkel.
- Sänk nålen tills den bara vidrör slipplanet och avfasning i 2 till 3 min.
- Bedöm avfasningen genom att placera den avfasade nålen på dubbel-stick tejp som har anslutit sig till ett glas Mikroskop bild.
- Placera bilden som håller nålen på scenen i ett sammansatt Mikroskop utrustad med en kamera och bild förvärvs programvara.
- Få en bild av nålspetsen med ett 20x mål.
- Använd bildhanteringsprogrammet för att mäta inre lumen diameter av nålen bara proximalt till avfasade öppningen (figur 2C). Den optimala storleken är 10 μm + 2 μm.
- Kassera nålar som har en öppning under 8 μm och över 12 μm.
- Förvara nålarna i en behållare med lock för att undvika att bli dammiga. Använd en remsa av vax eller liknande material för att höja nålarna från botten av behållaren för att förhindra att bryta spetsarna (figur 2D).
3. insamling och beredning av ägg
- Maximera antalet ägg som genom att beröva syrsor av något fuktigt läggnings material (vattenflaskor, äggrätter) över natten eller för minst 8 – 10 h innan du försöker samla ägg.
Anmärkning: Eftersom honor har förmågan att internt lagra spermier, en annorlunda tidsinställd förfarande kan vara nödvändigt om noggrant tidsstyrd befruktning är experimentellt viktigt18. - Gör 40 mL av 1% Agreste i vatten och häll i en 10 cm petriskål.
- Placera ett ägg-väl stämpel på ytan av aguppstod innan den stelnar.
- Ta bort stämpeln, när aguppstod är stelnat, att avslöja brunnarna (figur 1c).
- Fyll i Agam väl plattan med HBS som innehåller 1% penicillin/streptomycin.
- Placera locket på skålen, wrap i parafilm och förvara vid 4 ° c.
Anmärkning: Rätter kan förvaras i ett par dagar vid 4 ° c men bör värmas upp till rumstemperatur före användning för att undvika kondens. - Gör en ägg samling skålen för syrsor att lägga ägg i genom att fylla en 35 mm petriskål med vit lekplats sand (figur 1b).
Anmärkning: Sanden som specificeras i bordlägga av material , är av anslå Korn storleksanpassar. Om sand kornen är för stora, kommer sanden skada äggen. - Täck ägg skålen med en kvadrat med pappershandduk skuren vara cirka 18 cm x 18 cm, och placera på toppen av skålen med sand. Genom denna pappershandduk täcka den fyllda skålen med kranvatten.
- Luta petriskål och pressa försiktigt toppen för att ta bort överflödigt vatten.
- Tuck hörnen på papperet handduk torget under skålen och placera ägg skålen i det inverterade locket, vilket kommer att hjälpa till att hålla pappershandduk locket på plats.
- Placera ägg skålen i cricket bin och tillåta vuxna honor att oviposit ägg för en till två h.
Anmärkning: Den relativt korta tid här ser till att alla ägg kommer att vara liknande i utvecklingsstadiet vid tidpunkten för injektionen. Om injektion innan cellularisering är viktigt, injektioner bör inträffa inom 14 h äggläggning19. - Under tiden, låt aguppstod skålen (från steg 3,6) för att värma till rumstemperatur som förberedelse för att hålla ägg för injektion.
- Ta bort ägg samling skålen, nu innehåller nylagda ägg, från cricket bin, och ta bort pappershandduk locket. Placera en sil med en porstorlek på 0,5 – 1 mm över en bägare med en kapacitet på minst 500 mL (figur 1b).
- Skölj innehållet i ägg läggnings skålen (sand och ägg) i SIL under försiktigt rinnande kranvatten låta sand korn falla genom SIL mesh i vattnet i bägaren nedan men lämnar cricket ägg i SIL korg...
- Fyll en behållare med RO-vatten och placera den i ett magasin. Vänd på SIL över behållaren och knacka den mot skålen för att få bort äggen i vattnet. Äggen kommer att sjunka till botten av behållaren.
- Skär spetsen av en P1000 pipettspets med sax för att göra en öppning ca 3 mm i diameter. Placera detta tips på en P1000 multikanalspipettor och använda den för att överföra äggen från behållaren till aguppstod ägg mögel skålen, överföra så lite vatten som möjligt.
- Använd plast pincett för att rada upp ägg i aguppstod brunnar fyllda med HBS plus 1% penicillin/streptomycin. Varje ägg kommer att sjunka till botten av en individuell brunn. Täck med petriskål tills du är redo att injicera.
4. Förbered Mikroinjektorn
- Anslut mikroinjektorn till en trycklufts-eller gas källa (detta protokoll har optimerats med antingen tryckluft eller N2).
Anmärkning: Om du använder en portabel luft tank, fyll till minst 75 psi. Tanken kommer att förlora lufttrycket under hela injektionerna och kan behöva återfyllas; injektioner blir svårt under 40psi. - Slå på mikroinjektorn. Ställ in injektionstiden till 0,17 s och trycket till 10 – 15 psi.
Anmärkning: Det exakta trycket som behövs kommer att bero på öppnandet av nålen och måste bestämmas empiriskt för varje omgång av injektion och/eller ny nål som används. - Se till att BALANSERINGS ratten på mikroinjektorn vriden till 0 (normalt helt motsols) och att mikroinjektorn är trycksatt och i injektions läge.
5. injektioner
- Filtrera ca 500 μL av 10X injektion buffert med en 1 mL spruta och ett 0,45 μm spruta filter.
- Blanda injektionsreagenser (detaljerna som följer är för injektion av dsRNA som bereds enligt beskrivningen i12).
Anmärkning: Det kan vara lämpligt att designa och utföra flera kontroller, särskilt när man först lär sig denna teknik. Peta ägg utan att injicera, injicera buffert + färgämne ensam, eller injicera buffert + Dye + en kontrollreagens (såsom eGFP dsRNA) är alla bra tester av hur störande olika delar av injektion protokollet kan vara. Se figur 3 för överlevnadsförmågan hos ett antal olika kontroller. - Börja med en 4 mL dsRNA-alikvot.
- Tillsätt 0,5 mL av den filtrerade 10X injektions bufferten till dsRNA-alikvot.
- Tillsätt 0,5 mL 50 mg/mL Tetrametylrhodamine dextran Dye stamlösning. Om du arbetar på en dissekera område utan fluorescens, Använd Phenol Red istället.
- Förvara allt material på isen under hela injektionstiden.
- Fyll på injektionslösningen i en injektionsnål med hjälp av 20 mL laddnings spetsar och en P10 pipet.
- Dra upp en 1,5 mL injektionslösning och sätt in laddnings spetsen i den breda änden av injektionsnålen.
- Mata ut lösningen så långt ner i nålen som möjligt och eliminera luftbubblor genom att snärta försiktigt; var noga med att inte bryta nålen.
- Placera skålen med ägg under dissekera Mikroskop och välj en låg förstoring på runt 10X (1x förstoring ses genom 10X öga mål).
- Stick in injektionsnålen i injektions höljet och dra åt.
Anmärkning: Var försiktig så att nålen är ordentligt och ordentligt isatt i höljet. För att göra detta, dra den breda änden av nålen tillbaka ut ur metallhölje, föra kisel slangen i huset med den. Justera silikonslangen så att glaset änden av nålen sticker ut strax bortom kisel. Om detta inte görs, kan kisel slangen få klämde mellan glaset och metallhölje, blockerar änden av nålen. - Sätt försiktigt in injektions höljet med en fastsatt nål i mikromanipulatorn. Var medveten om den vassa änden av nålen och vara noga med att det inte är stötte på ytor och trasiga.
- Medan du tittar på både ägg och nålen genom mikroskopet, flytta nålen nära äggen i det övre vänstra hörnet av skålen nätet.
- Sänk nålen tills spetsen kommer in i HBS plus 1% penicillin/streptomycin buffrad lösning i skålen.
- Centrera nålen i synfält och flytta ägg skålen så att nålen är några mm närmare kanten av skålen än äggen.
- Blockera inte bilden av nätet av ägg med nålen.
- Ställ in mikroskopet på filtret lämpligt för Rhodamine så det är möjligt att observera fluorescensen i nålen och fokusera på spetsen av nålen.
- På mikroinjektorn vrider du långsamt balans ratten medurs tills injektionslösningen börjar läcka ut ur injektionsnålen i upphängnings lösningen. Balans numret på skärmen på mikroinjektorn kommer att börja öka, även om det numeriska värdet är inte viktigt. Vrid sedan ratten bakåt moturs något bara tills färgen slutar läcka ut ur nålen.
Anmärkning: Det är viktigt att ställa in denna balans varje gång en ny nål används. Utan balansen inställd på rätt sätt, kommer mikroinjektorn fortsätta att injicera under en tid efter injektionen utlöses. Det är även möjligt att ett enda tryck på injektionsknappen med en obalanserad nål kommer att resultera i utvisning av hela innehållet i den laddade nålen. - Med nålen centrerad i synfältet, flytta ägg skålen så att nålen är inriktad på ägget som ska injiceras först. Det rekommenderas att injektioner startar i ett hörn av rutnätet av arrangerade ägg, till exempel, det övre vänstra hörnet.
- Justera förstoringen till ca 50x; vid denna förstoring, ett enda ägg kommer att fylla de flesta av synfältet.
- Använd både micromanipulator och en hand på ägg skålen för att flytta nålen i läge för injektionen.
- Förskjut nålen med mikromanipulatorn och stick in spetsen på nålen i det första ägget som ska injiceras.
- För in nålen vid 20 – 30% ägg längd från den bakre (blunter) änden av ägget (figur 1e), vinkelrät mot den långa axeln av ägget.
- Injicera lösningen antingen med injektion fotpedalen eller injektionsknappen på mikroinjektorn. En liten bolus av fluorescerande material inne i ägget kommer att indikera en lyckad injektion (figur 1d).
Anmärkning: Det är inte ovanligt att vissa äggula matas ut från ägget under injektion (figur 1f), och detta inte nödvändigtvis tyder på att det injicerade ägget kommer att vara inviable. - Dra tillbaka nålen från ägget. Om ägget oavsiktligt lyfts ut ur sin brunn vid indragning av nålen, använda små tång för att driva ägget tillbaka i sin brunn medan tillbakadragning nålen.
- Om nålen träskor under injektionen, ta bort nålen från ägget och, hålla nålen nedsänkt i HBS plus 1% penicillin/streptomycin lösning som täcker äggen, rensa den igensatta nålen med antingen den tydliga funktionen eller genom att trycka på injicera Knappen.
- Fortsätt att använda samma nål, upprepa injektionsproceduren för så många ägg som möjligt. Till en början kan detta vara endast cirka 20 eller 30 ägg men kommer att öka till över 100 med praktik.
- Om nålen blir igensatt och inte kan rensas, kassera nålen, Fyll på en ny nål och börja igen (dvs återgå till steg 5,7).
- Förvara skålen med injicerade ägg i en varm inkubator (23,5-26 ° c) som är något fuktigt (för att minimera avdunstning) tills embryona har nått önskat utvecklingsstadium för analysen.
- Minst var 24 h, ta bort ägg som inte längre är livskraftiga (figur 3a, B), och ersätta suspensionen lösningen med färska HBS plus 1% penicillin/streptomycin.
- Två till tre dagar efter injektion, överför äggen genom skonsam pipettering eller med plast tång till pappershanddukar fuktad med HBS plus 1% penicillin/streptomycin i en lockded petriskål för att fortsätta utvecklingen i den varma, fuktiga inkubator.
- Övervaka äggen och ta bort ägg som inte längre är livskraftiga varje dag (figur 3a, B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syrsor lätt lägga ägg i fuktigt material, och ger tillräckligt med material, såsom fuktig sand eller smuts, inducerar dem att lägga ett stort antal ägg. Detta är särskilt effektivt om syrsor först berövas ägg läggnings material för 8 – 10 h. ägg som läggs i ren sand kan lätt separeras, samlas in (figur 1b) och placeras i skräddarsydda ägg brunnar för injektion (figur 1c). Ett dissekerande Mikroskop, en mikroinjektor och en micromanipulator (figur 1a) kan användas för att injicera enskilda ägg med en mängd olika material (figur 1d). Ägg injiceras nära den bakre änden, vid en punkt cirka 20 – 30% längs främre-bakre axeln (figur 1e). Att skilja den mer spetsiga främre änden från mer avtrustade bakre änden kan vara svårt, eftersom dessa skillnader är ofta subtila (figur 1e). Rullande ett ägg från sida till sida ofta hjälper till att avslöja vilken ände är vilken. Efter avlägsnande av injektionsnålen, är äggula ibland matas ut (figur 1f), även om detta inte verkar äventyra hälsan hos det växande embryot inuti.
Ett av de mest kritiska stegen i detta protokoll är beredningen av avfasade nålar. Efter att ha dragit långa, smala nålar måste de vara avfasade till en 20 ° vinkel och ha en öppningsdiameter på 10μm (± 2 μm). Om diametern är för stor, injektionslösningen kommer att läcka ut ur nålen, och dessa nålar kommer att skapa stora hål i ägg, minskar överlevnadstalen. Smalare nålar ökar överlevnadsförmågan, men om de är för smala, de tenderar att täppa lätt, vilket gör injektioner långsamma och frustrerande. Med en nål diameter på 10 μm ± 2 μm, är det möjligt att injicera upp till 100 ägg med en enda nål utan att ha nålen täppa.
Injektionsnålar kan avfasas med en Micro Grinder eller maskinen (figur 2A). Dessa delar av utrustning kan erhållas med ett Mikroskop bifogas, eller man kan lägga till en dissekera omfattning på ett självständigt stativ för modeller som inte innehåller mikroskopet. En liten micromanipulator håller nålen, som kan lutas till önskad vinkel och sänkas till ytan av ett roterande slipplan, som fuktas med droppande vatten. Ett exempel på en dragen, men fogar nål kan ses i figur 2b, och en nål med en 20 ° avfasning visas i figur 2C. Injektionsnålar måste sedan förvaras säkert för att undvika skador och hållas rena (figur 2D).
Ställa in balansen och insprutningstrycket på lämpligt sätt på mikroinjektorn bör tillåta en att injicera en jämförbar mängd material i varje ägg injiceras med samma nål. Optimering av injektion och balans tryck kommer att krävas vid byte till en nål med en annan diameter. Denna optimering kommer att maximera konsistensen av injektion pulser.
Överlevnadsgraden är en viktig parameter för att bedöma framgången för dessa experiment. De flesta döda ägg kan lätt identifieras med sikte enligt följande: äggula och embryonala vävnaden i ägget börjar klumpa ojämnt (figur 3a) och så småningom de flesta äggula kommer att migrera till en sida av ägget (figur 3b). Vid bedömning efter 4 – 6 dagar (motsvarande stadier 8 – 15)19överlevde mer än 85% av de icke injicerade äggen medan ägg som injicerades med experimentella reagenser i allmänhet hade en lägre överlevnadsgrad (figur 3c). Kontroll för alla aspekter av själva injektionen, inklusive nålpunktering, införande av färg och buffert, eller förekomst av fordon eller dsRNA, krävs för att förstå de verkliga effekterna av försöket försök till manipulation (figur 3C). beroende på experimentell manipulation kan en högre grad av dödlighet förväntas, och man kan behöva ändra tidpunkten för analysen eller tidpunkten för injektionen för att bedöma eventuella icke-dödliga effekter av manipulationen.
Det sätt man bedömer fenotypiska resultat av injektion beror på vad som injicerades. Till exempel kan fenotypiska förändringar som ett resultat av specifika mRNA nedslagningar vara uppenbara på bruttonivå anatomi. Till exempel, den gen förstärkare av Zeste (E (z)) normalt undertrycker HOX gener inklusive ultrabithorax (UBX). Injicera dsRNA för e (z) knackar ner E (z) funktion och frigör UBX suppression, vilket resulterar i ektopisk UBX uttryck. Detta leder till omvandlingen av fem par ventrala bihang (antenn, maxilla, labium, T1 och T2 ben) i T3 benliknande bihang, på grund av derepression av UBX i dessa segment20. I ett andra exempel, är det möjligt att använda GFP uttryck för att assay en lyckad insättning av en Transgene. Till exempel, när en cDNA-kodning en eGFP-märkt Histone 2b -genen under kontroll av en G. bimaculatus Actin promotor sattes in i cricket genomet med hjälp av piggybac transposase, blev det möjligt att visualisera varje kärna i ägget med fluorescens att excitera eGFP-märkta His2B protein (figur 4c, D). I detta fall var det möjligt att övervaka förflyttning av kärnor över tid7.
| Lösningens namn | Komponenter | Kommentarer/Beskrivning |
| 10X lösning för injektion buffert | I 1 L H2O tillsätt: 0,8 g NaCl, 0,09 g na2hpo4, 0,04 g KH2Po4, 2,98 g KCL | Lagra lager vid 4 ° c. Filtrera en liten mängd omedelbart före användning med en 1 mL spruta försedd med ett spruta filter på 0,45 μm. Upprepa vid behov för att filtrera cirka 500 μL injektionslösning. Håll filtrerat injektionslösning på is under experimentets varaktighet. |
| HEPES buffrad saltlösning | I 1 L H2O, tillsätt: 8,77 g nacl, 5,2 g Hepes, | pH till 7,0 och förvara vid 4 ° c. |
| Tetrametyrodamin dextran (10 000 MW) Dye stamlösning | Rhodamine Dye från thermofisher | Detta färgämne säljs ofta som ett frystorkat pulver. I detta fall, utgör en stamlösning av 50 mg/mL med vatten. Centrifugera vid 12 000 x g i 5 minuter för att avlägsna eventuella olösliga partiklar. Samla upp supernatanten efter centrifugering och Undvik partiklar i botten av röret, alikvot och frys vid-20 ° c. Lager alikvoter som används kan förvaras vid 4 ° c i en till två veckor. Undvik frysning-upptinning alikvoter flera gånger. Om nålar är igensättning på grund av färgämne, kan färgen också filtreras genom Whatman #2 filterpapper. |
Tabell 1: lösnings recept och anteckningar.
Figur 1: översikt över ägg insprutnings protokollet. A) entypisk uppsättning som kan användas för ägg injektioner. B) äggen separeras från sand via en sil. Cägg hålls för injektion i små brunnar som görs genom att placera en form i varm, flytande aguppstod. Dfluorescens i nålen och i fem injicerade ägg kan ses genom det fluorescerande dissekerande mikroskopet. E) ett ägg som inte injicerats. Den främre änden (något spetsiga; vänster) och bakre änden (mer trummade; höger) är distinguishable från varandra. Den region som lämpar sig bäst för injektion, nära den bakre änden, visas med fästet. F) ett ägg två dagar efter injektionen. Injektionsstället är synligt som en lätt missfärgning, och en liten mängd utvisad äggula är uppenbar (pil). Skalstreck = 1 mm (D); 0,5 mm (E och F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: injektionsnålar är avfasade med en Micro Grinder eller beveller. (A) ett exempel på en mikrokvarn med en cirkulär, snurrande slipyta fuktad med DROPPANDE ro-vatten (vatten droppar från sprutan som visas i bildens överkant). (B) innan avfasning, dragna nålar är långa och smala. (C) efter avfasning till 20 ° skapas en vass injektionsnål. Notera den inre lumen-diametern med 10 μm. (Röda Skale streck = 10 μm). (D) dragna, avfasade nålar kan förvaras i en petriskål med lock och hålls på plats med hjälp av dentalvax. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: injektioner kan minska överlevnads hastigheten. (A) döda och döende ägg är uppenbara vid visuell inspektion. (B) med tiden kommer materialet att migrera till ena sidan av ägget. C) jämförelse av överlevnadstalen fyra till sex dagar efter äggläggningen under en rad olika förhållanden, inklusive: icke injicerade ägg (n = 6-experiment). ägg punkteras med en 9 μm nål men oinjicerad (n = 2 experiment); ägg injiceras med buffert och färgämne (n = 13 experiment); ägg injiceras med buffert, färgämne, och plasmid vektor (n = 2 experiment); ägg injiceras med buffert, färgämne, och DMSO (n = 11 experiment); och ägg injiceras med buffert, färgämne, och kontroll dsRNA (n = 22 experiment). Den typ av kontroll dsRNA som används inkluderade dsRNA mot eGFP eller dsRed. Siffrorna vid basen av varje stapel notera det totala antalet överlevande ägg/totala ägg som används för varje villkor. Felstaplar representerar standardfel för medelvärdet. Skalstapel = 1 mm (A och B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bedömning av injektions resultat. (a-B) Injektion av förstärkare av Zeste (E (z)) dsRNA förändrar det normala uttrycket av UBX mRNA (vild typ som visas i (a) och leder till omvandlingen av antenner (en) och mouthparts (MX, lb) i benliknande bihang (B). (C-D) Injektion av tidiga ägg med den överföras elementet piggybac och histone2B-egfp producerar transgena embryon uttrycker GFP i alla kärnor. Lokalisering av kärnor kan observeras 8 h efter äggläggning (C) och 20 h efter äggläggning (D). Förkortningar: an = antenn; MX = maxilla; Lb = labium; T1-3 = bröstbenet 1 till 3; RNAi = RNA-störning; GB = G. bimaculatus; Act = aktin; H2B = Histone H2B; GFP = grönt fluorescerande protein. Skalstreck = 200 μm (A och B); 500 μm (E och F). Dessa experimentella resultat beskrevs ursprungligen någon annanstans7,20. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De två största utmaningarna med denna teknik är de relaterade frågorna om optimal nål storlek och överlevnadsförmåga. Även mindre nålar förbättra överlevnadsförmåga, nålar med smalare lumen har en högre grad av kapillärkrafter på jobbet, vilket gör det mer sannolikt att äggula kommer att flytta in i nålen orsakar det att täppa. I bästa fall, blockeringar kan rensas helt enkelt genom att injicera ett annat ägg eller genom att rensa nålen som beskrivs ovan. Man kan också försöka öka balansen trycket på mikroinjektorn tills äggulan skjuts ut ur nålen. Den andra stora utmaningen med denna teknik är överlevnadsförmåga. I våra händer, Överlevnadstalen för ägg injiceras med experimentella lösningar är vanligtvis mellan 40 och 80%. Överlevnaden kan vara så låg som 10% för dem som börjar lära sig denna teknik, men kommer att förbättras med praktik. Negativa kontroller, som beskrivits ovan, är viktiga för forskare att noggrant bedöma förändringar i överlevnad med praktik, med tanke på att införandet av olika material kan sänka överlevnaden (figur 3c).
Tidpunkten för injektioner är en viktig faktor för varje experimentell metod samt. Äldre ägg är svårare att injicera än yngre, och i allmänhet, överlevnad är högre vid injektion yngre snarare än äldre ägg. Införandet av nålen och injicerat material i senare stadier kan leda till oavsiktliga anatomiska skador. Med erfarenhet, dock, injektion av två-till tre dagar gamla ägg är möjligt. Rikta den dorsala sidan av ägget vid dessa stadier hjälper till att undvika att skada embryot, som först former på den ventrala sidan. Rikta den bakre änden kan öka reagensen tillgång till de första nukleära divisioner och bakterie band formation, som förekommer nära denna ände av ägget19,21. Om man försöker manipulera arvsmassan, i syfte att uppnå antingen utbredd somatisk eller köns cells överföring av arvsmassan modifiering, injektioner bör utföras före cellularisering, som startar cirka 14 h efter äggläggning19 . Om injicera dsRNA till knockdown mRNA nivåer, tidsfönstret för injektioner bör bestämmas baserat på hur tidigt i utvecklingen man vill riva en gen av intresse. Medan effekterna av RNAi sannolikt varar en tid, dsRNA måste införas i förväg av den tid då man planerar att bedöma eventuella förändringar i fenotyp. Att hålla koll på den tid som förflutit under injektionen och utvecklingen av embryonal utveckling kan vara viktigt för att säkerställa att rätt Stadium ägg injiceras. Oavsett vilket material som injiceras, försenad utveckling efter injektion är vanliga, även om graden av förseningen kan variera beroende på injektions medlet.
Det protokoll som presenteras här bygger på ett antal relativt dyra utrustningsdelar. Det bör dock vara möjligt att injicera ägg framgångsrikt utan att använda några eller till och med alla dessa objekt. Till exempel finns det en mängd mikroinjektorer på marknaden, och vissa kan vara billigare än den som föreslås i tabellen av material. Det är också möjligt att helt enkelt använda en spruta för att injicera en lämplig mängd material, även om detta skulle ta lite övning. Istället för en dyr micromanipulator, kan man använda en mängd olika material för att hålla nålen stadigt och tillåta en långsam, kontrollerad förskott, och en enkel modellera design har använts av andra22. Det kan också vara möjligt att undvika användning av en beveller, men i vår erfarenhet korrekt avfasning kan göra en enorm skillnad för framgång injektioner. Det kan vara möjligt att skärpa en dragen nål genom att dra spetsen av nålen för hand över de finaste sandpapper, bedöma denna process under ett mikroskop. Oavsett, vässade nålar kommer att göra injektioner lättare och förbättra överlevnadsförmåga.
Denna injektionsteknik är flexibel och kan användas för en mängd olika manipulationer. Här har vi visat resultat för dsRNA och piggyBac-beroende genomisk modifiering experiment, men det är också möjligt att använda CRISPR/CAS eller andra metoder med denna teknik. I de experiment som ingår här, resulterande fenotyper var uppenbara och lätt att bedöma. Vissa experiment kan kräva användning av immunohistokemi eller andra visualiseringsverktyg för att se effekterna av experimentell manipulation. Ett alternativ till injektioner är användningen av elektroporation, som kan användas för att introducera DNA eller andra makromolekyler i celler och vävnader in vivo. Elektroporation kan användas i äldre cricket ägg där embryon har redan bildats för att rikta specifika regioner8, men injektion är mer användbar när experimentet kräver att hela utveckla embryot är riktad. Denna injektion teknik bör också vara lätt att anpassa för användning i ägg från en mängd olika hemimetabolous och holometabolous insekter, helst förbättra förmågan att genomföra meningsfulla jämförande studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som rapporterats i detta projekt stöddes av en institutionell utveckling Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under Grant nummer P20GM10342 till HH3, och av NSF Award Number IOS-1257217 till CGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
