Summary
Burada kriket yumurtaları enjekte etmek için bir protokol salıyoruz, kriketteki birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere.
Abstract
Gelişmekte olan bir organizmada gen işlevini değiştirmek farklı deney türlerinin merkezinde yer alıyor. Geleneksel model sistemlerinde son derece güçlü genetik araçlar geliştirilmiş olmakla birlikte, diğer organizmalarda genleri veya haberci RNA'yı (mRNA) işlemek zordur. Aynı zamanda, evrimsel ve karşılaştırmalı yaklaşımlar birçok farklı türde gen fonksiyonunun araştırılmasına dayanıyor, bu da şu anda genetik olarak kontrol edilebilir olan dış ifadeyi manipüle etme tekniklerinin geliştirilmesini ve uyarlanmasına ihtiyaç diliyor. Tür. Bu protokol, belirli bir manipülasyonun embriyonik veya larva gelişimi üzerindeki etkilerini tetkiklemek için kriket yumurtalarına reaktif enjekte etme yöntemini tanımlar. Yontucu iğnelerle yumurtaların nasıl toplanıp enjekte edilene ilgili talimatlar açıklanmıştır. Bu nispeten basit teknik esnek tir ve diğer böceklere karşı potansiyel olarak uyarlanabilir. Tek bir deneyde düzinelerce yumurta toplayıp enjekte edilebilen bir kişi, tampon aparatların sağkalım oranları pratikte iyileşir ve %80'e kadar çıkabilir. Bu teknik, farmakolojik ajanların enjeksiyonu, ilgi genlerini ifade etmek için in vitro kapaklı mRNA, RNA girişimini sağlamak için çift iplikli RNA (dsRNA), kümelenmiş düzenli olarak kullanımı gibi çeşitli deneysel yaklaşımları destekleyecektir. genomik modifikasyon için CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) reaktifleri ve geçici veya kararlı transgenik çizgiler oluşturmak için geçirilebilir elementler ile birlikte uzaya kısa palindromik tekrarlar (CRISPR).
Introduction
Organizmalarda genomu değiştirebilme veya gen ekspresyonunu etkileme yeteneği, fonksiyonel nedenselliği test eden birçok deney türünün tasarımının temelini oluşturur. Genomik ve genomik olmayan modifikasyon tekniklerinin geleneksel genetik laboratuvar hayvan model sistemleri dışındaki organizmalarda bulunması karşılaştırmalı ve evrimsel olarak ilgili çalışmalar için de önemlidir (örneğin, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, ve Caenorhabditis elegans). İster organizma çeşitliliğini anlamak için arzu1 veya Krogh ilkesine bir bağlılık, her biyolojik soru için en iyi çözüm 2 uygun bir organizma olduğunu,3, genomları değiştirmek için yeteneği ya da gen ekspresyonunun modern deneysel tasarımlar için gerekli olduğu etkidir.
Kriket Gryllus bimaculatus gelişmekte olan bir model sistemidir. Nöroethology deneylerde son yüzyılda kullanılan4, son yirmi yılda kriket artan bir deneysel ilgi tanık, özellikle bu organizmanın evrimi ve gelişimi üzerinde duruldu5. Kriket d. melanogaster ve Tribolyum castaneum6gibi iyi çalışılmış holometabolöz böcekler, bazal dalları hemimetabolous böcek. Evrim ağacı üzerindeki yararlı konumu nedeniyle, bilim adamları g. bimaculatuskullanımı için moleküler araçlar adapte artan bir ilgi yol açmıştır bu böcek, modern, sofistike deneysel sorular soran ilgileniyoruz.
Kriket yumurtalarına moleküler reaktif enjeksiyonları genomik modifikasyon deneyleri ve embriyolarda gen ekspresyonunun genomik olmayan manipülasyonları için kullanılabilir. Örneğin, transgenik G. eGFP eklemeleri taşıyan bimaculatus transposaz piggyBac7,8kullanılarak oluşturulmuştur. Araştırmacılar başarıyla çinko-parmak nükleazlar kullanarak nakavt G. bimaculatus yarattık (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatör benzeri (TAL) efektör nükleazlar (TALENs) belirli genomik bölgelerde çift iplikli tatili tanıtmak için9. ZFN'ler ve TALEN'ler büyük dört model sistemlerinin ötesindeki hayvanlarda siteye özgü hedeflemeye izin vermesine rağmen, bu reaktifler kullanımı daha kolay, daha verimli ve son derece esnek10olan CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hızlı bir şekilde aşılmıştır. CRISPR, G. bimaculatus'ta nakavt11 ve knock-in hatları üretmek için kullanılmıştır12,13 Genomik modifikasyona ek olarak, dsRNA gelişmekte olan mRNA ekspresyonunu yıkmak için yumurtalara enjekte edilebilir embriyolar, araştırmacılar geliştirme 14 ,15boyuncabelirli transkript rolünü anlamak için izin . Kriket yumurtaları enjekte etmek için bazı sınırlı ayrıntılar daha önce12yayınlanmıştır .
Burada, erken G. bimaculatus yumurta enjekte etmek için ayrıntılı bir protokol açıklar. Bu protokol çeşitli laboratuvar ayarlarına, enjeksiyon malzemelerine ve muhtemelen diğer böceklere etkili ve kolayca uyarlanabilir. Genomik modifikasyon ve nakavt deneylerinin tasarlanması ve uygulanması için ek ayrıntılar başka bir yerde yayınlanmış olsa da12,13, Bu yaklaşımlar sonuçta burada ayrıntılı enjeksiyon protokolü ne bağlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Donanım Kurulumu ve Malzemelerin Hazırlanması
NOT: Çözüm, reaktif ve ekipman ayrıntılarının hazırlanması için tablo 1 ve Malzeme Tablosu'na bakın.
- Yumurtaları görmek ve enjeksiyon iğnesini yönlendirmek için bir kesme mikroskobu ayarlayın. (Şekil 1A floresan ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu gösterir.) Floresan yeteneği avantajlıdır ancak gerekli değildir.
- Enjeksiyon iğnesini yerine getirmek için 3 eksenli bir mikromanipülatör yerleştirin (Şekil 1A).
- Küçük miktarlarda malzeme enjekte etmek için bir mikroenjektör ve bir iğne tutucu ayarlayın (Şekil1A). İsteğe bağlı olarak şekilde gösterilmez bir ayak pedalı kullanın.
- 3D yazıcı veya lazer oymacı ile istenilen desenin tersini yazdırarak yumurtalar için kuyular (Şekil1C)oluşturmak için bir damga tasarlayın ve oluşturun.
NOT: Gösterilen 3D baskılı numune pulu 4,5 cm x 5 cm, 128 cm, 3 cm x 1 cm x 1 mm çıkıntılı olup, ayrı kuyular oluşturmak için. Özelleştirilebilir kalıplar çeşitli yapmak için nasıl ayrıntılarbaşka bir yerde 16 yayınlanmıştır. - 10x Enjeksiyon Tampon, HEPES tamponlu salin (HBS) ve Tetrametiloiddamine Dextran boya stok çözeltisi hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
- Enjekte edilecek deneysel çözümler hazırlayın, örneğin dsRNA, CRISPR/Cas912,transpozable elemanlar, in vitro kapaklı mRNA7,8, farmakolojik ajanlar17, ZFN'ler veya TALENS9.
- Değerlendirme için iğne tutmak için kullanılacak cam slayt, 1 mm veya öylesine üzerinde bir platform oluşturmak için bir cam mikroskop slayt standart laboratuvar bandı birkaç katmanları üzerinde çift sopa bant yerleştirin.
- Hava sirkülasyonu için örgü kaplı bir açıklığa sahip bir kapak ile yaklaşık 40 cm x 60 cm boyutunda bir kriket konteynerhazırlayın.
- Yiyecek, su ve barınak malzemeleri ekleyin.
- Birkaç düzine sağlıklı erkek ve kadın yetişkin kriket ekleyin. Kanatların varlığı ile yetişkin kriket tanımlayın.
NOT: Hayal sonrası yaşaralığı yumurta verimini artırabilir. Bir deney için yeterli yumurta toplamak edebilmek için kriket yoğunluğu nispeten yüksek olmalıdır, ama yamyamlık oluşur o kadar kalabalık değil. Örneğin, yaklaşık iki düzine sağlıklı kriket, kabaca eşit erkek kadın oranı ile, yukarıda belirtilen boyutta bir kapta bir ila iki saat döneminde yaklaşık 200 yumurta toplamak için yeterli olmalıdır. Kriketler oda sıcaklığında tutulabilir, ancak kriketler sıcak (23.5-26 °C), nemli (%40 - %60 bağıl nem) kuvözde muhafaza edilirse gelişme ve davranış en uygun uyrabilir.
2. Enjeksiyon için İğne yapma
- Filamentli Borosilikat Cam Kılcal damarları kullanın (boyut ayrıntıları için Malzemeler Tablosu'na bakın). Çekme iğnelerini aynı gün veya enjeksiyonlar tamamlanmadan birkaç gün önce hazırlayın.
- Çekmeceye kılcal bir cam yerleştirin, camın filamentin üzerine ortalayın ve camı yerinde sabitlemek için tonlamaları sıkın.
- Çekmece sıcaklığını cam rampa sıcaklığının (-5 °C ila +10 °C) yakınına ayarlayın.
- Küçük bir açıklıkla uzun bir konik çekmek için tek adımlı, yüksek ısı protokolünü kullanın, ancak uçların kapalı erimesini önleyin.
NOT: Örneğin, bir kutu filamenti ile donatılmış Malzeme Tablosunda ayrıntılı mikropipet çekmecesini kullanırken, rampa sıcaklığı 478 olan cam için aşağıdaki parametreleri kullanın: Isı 478; Çekme 45; Vel 75; Del 120. Şekil 2B'de gösterilen şekilile iğne üretmek için en uygun koşullar her kullanıcı tarafından ampirik olarak belirlenmelidir. - Enjeksiyonlar için hazırlık için bevel iğne ipuçları.
- Beveler'in (Şekil2A)dönen öğütücü düzlemini damlama suyuyla ıslayın. Ters ozmoz (RO) veya dietilasyonokarbonat (DEPC) ile işlenmiş distile su kullanın.
- Çekilen iğneyi beveler'e yerleştirin ve 20° açıya dönün.
- İğneyi sadece taşlama düzlemine değene kadar indirin ve 2-3 dk.
- Bir cam mikroskop slayt yapıştırılmış olan çift sopa bant üzerine yaslı iğne yerleştirerek bevel değerlendirin.
- İğneyi tutan kaydırağı kamera ve görüntü edinme yazılımıyla donatılmış bileşik bir mikroskobun sahnesine yerleştirin.
- 20x hedefi kullanarak iğne ucunun görüntüsünü elde edin.
- İğnenin iç lümen çapını ölçmek için görüntüleme yazılımını kullanın (Şekil 2C). En uygun boyut 10 μm + 2 μm'dir.
- 8 μm'nin altında ve 12 μm'nin üzerinde bir açıklığı olan iğneleri atın.
- Tozlu önlemek için bir kapak ile bir kapta iğneleri saklayın. Uçları kırmayı önlemek için iğneleri kabın altındakilere yükseltmek için balmumu veya benzeri bir malzeme şeridi kullanın (Şekil2D).
3. Yumurta Toplama ve Hazırlama
- Yumurta toplamaya çalışmadan önce bir gecede veya en az 8-10 saat boyunca herhangi bir nemli yumurtlama malzemesi (su şişeleri, yumurta yemekleri) kriket yoksun tarafından yatırılabilen yumurta sayısını maksimize.
NOT: Dişiler spermi dahili olarak depolama yeteneğine sahip olduğundan, dikkatli bir şekilde zamanlanmış döllenme deneysel olarak gerekli yse, farklı bir zamanlanmış işlem gerekebilir18. - Suda % 1 agarose 40 mL olun ve 10 cm petri kabına dökün.
- Katılaşmadan önce agarose yüzeyine bir yumurta kuyusu damgası yerleştirin.
- Pulu çıkarın, bir kez agarose katılaşmış, kuyuları ortaya çıkarmak için (Şekil 1C).
- % 1 Penisilin / Streptomisin içeren HBS ile agarose iyi plaka doldurun.
- Kapağı yemeğin üzerine yerleştirin, parafilm'e sarın ve 4 °C'de saklayın.
NOT: Yemekler 4 °C'de birkaç gün saklanabilir ancak yoğuşmayı önlemek için kullanılmadan önce oda sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır. - 35 mm'lik petri kabını beyaz oyun alanı kumuyla doldurarak yumurtlamak için kriketlerin yumurta toplama kabı nı yapın (Şekil1B).
NOT: Malzeme Tablosunda belirtilen kum uygun tane büyüklüğündedir. Kum taneleri çok büyükse, kum yumurtalara zarar verir. - Yaklaşık 18 cm x 18 cm olacak şekilde kesilmiş kağıt havlu bir kare ile yumurta çanak kapak ve kum ile çanak üstüne yerleştirin. Bu kağıt havlu sayesinde musluk suyu ile dolu çanak kapağı.
- Petri kabını yatırın ve fazla suyu çıkarmak için üstçe hafifçe sıkın.
- Çanak altında kağıt havlu kare köşelerini tuck ve yerinde kağıt havlu kapağı tutmaya yardımcı olacak ters kapak, yumurta çanak yerleştirin.
- Kriket kutusuna yumurta çanak yerleştirin ve yetişkin kadın bir ila iki saat için ovipozit yumurta sağlar.
NOT: Burada nispeten kısa bir süre tüm yumurta enjeksiyon sırasında gelişme aşamasında benzer olmasını sağlar. Hücreselleşmeden önce enjeksiyon önemliyse, enjeksiyonlar19yumurtlama nın 14 saat içinde yapılmalıdır. - Bu arada, agarose çanak (adım 3.6) enjeksiyon için yumurta tutmak için hazırlık oda sıcaklığına ısınmak için izin verin.
- Kriket kutusundan taze döşenmiş yumurtalar içeren yumurta toplama yemeğini çıkarın ve kağıt havlu kapağını çıkarın. En az 500 mL kapasiteli bir kabın üzerine 0,5-1 mm gözenek boyutunda bir süzgeç yerleştirin (Şekil1B).
- Yumurta yumurtlayan yemeğin (kum ve yumurta) içeriğini, süzgeçteki yumurta tanelerinin süzgeçten suya düşmesine izin veren ve süzgeç yumurtalarını süzgeç sepetinde bırakarak hafifçe akan musluk suyunun içine durulayın.
- Ro su ile bir kap doldurun ve bir tepsiye yerleştirin. Süzgeci kabın üzerine ters çevirin ve yumurtaları suya çıkarmak için çanağa dokunun. Yumurtalar kabın dibine batar.
- Yaklaşık 3 mm çapında bir açıklık yapmak için bir P1000 pipet ucumak makasla kesin. Bir P1000 pipettor bu ucu yerleştirin ve mümkün olduğunca az su aktararak, agarose yumurta kalıp çanak için konteyner yumurta aktarmak için kullanabilirsiniz.
- HBS artı% 1 Penisilin / Streptomisin dolu agarose kuyularda yumurta hizalamak için plastik cımbız kullanın. Her yumurta bir kuyunun dibine batar. Enjekte etmeye hazır olana kadar petri kabı kapağı ile kaplayın.
4. Mikroenjektör hazırlayın
- Mikroenjektörü basınçlı hava veya gaz kaynağına takın (bu protokol basınçlı hava veya N2kullanılarak optimize edilmiştir).
NOT: Taşınabilir bir hava tankı kullanıyorsanız, en az 75 psi doldurun. Tank enjeksiyonlar boyunca hava basıncını kaybeder ve yeniden doldurulması gerekebilir; enjeksiyonlar 40psi altında zor olur. - Mikroenjektörü aç. Enjeksiyon süresini 0.17 s'ye, basıncı 10-15 psi'ye ayarlayın.
NOT: İhtiyaç duyulan tam basınç iğnenin açılmasına bağlıdır ve kullanılan her enjeksiyon ve/veya yeni iğne için ampirik olarak belirlenmelidir. - Mikroenjektörün BALANCE topuzlarının 0'a (genellikle saat yönünün tersine) döndürülmesini ve mikroenjektörün basınçlı ve enjeksiyon modunda olduğundan emin olun.
5. Enjeksiyonlar
- 1 mL şırınga ve 0,45 m şırınga filtresi kullanarak yaklaşık 500 μL 10x Enjeksiyon Tamponu filtreleyin.
- Mix enjeksiyon reaktifleri (takip eden ayrıntılar 12'de açıklandığışekilde hazırlanan dsRNA enjeksiyonu içindir).
NOT: Özellikle bu tekniği ilk kez öğrenen biri olduğunda, çeşitli kontroller tasarlamak ve gerçekleştirmek tavsiye edilebilir. Enjekte etmeden yumurta ları dürtmek, tampon + boya enjekte etmek veya tampon + boya + bir kontrol reaktifi (eGFP dsRNA gibi) enjekte etmek enjeksiyon protokolünün çeşitli unsurlarının ne kadar yıkıcı olabileceğinin iyi testleridir. Bir dizi farklı denetimin hayatta kalma kabiliyeti için Şekil 3'e bakın. - 4 mL dsRNA aliquot ile başlayın.
- DSRNA aliquot'a filtrelenmiş 10x Enjeksiyon Tamponunun 0,5 mL'sini ekleyin.
- 0,5 mL 50 mg/mL Tetrametil rhodamine Dextran boya çözeltisi ekleyin. Floresan olmadan bir diseksiyon kapsamı üzerinde çalışıyorsanız, bunun yerine Phenol Red kullanın.
- Enjeksiyon süresi boyunca tüm malzemeleri buzda saklayın.
- Enjeksiyon çözeltisini 20 mL yükleme uçları ve p10 pipet kullanarak enjeksiyon iğnesine yükleyin.
- 1,5 mL enjeksiyon çözeltisi çekin ve yükleme ucunu enjeksiyon iğnesinin geniş ucuna yerleştirin.
- Çözeltiyi mümkün olduğunca iğnenin içine doğru fırlatın ve hafifçe hareket ederek hava kabarcıklarını ortadan kaldırın; iğne kırmak için dikkatli olun.
- Diseksiyon mikroskobu altında yumurta çanak yerleştirin ve yaklaşık 10x (10x göz hedefleri ile görüntülenen 1x büyütme) düşük büyütme seçin.
- İğneyi enjeksiyon gövdesine takın ve sıkın.
NOT: İğnenin gövdeye düzgün ve sağlam bir şekilde sokulduklarına dikkat edin. Bunu yapmak için, iğnenin geniş ucunu metal gövdeden geri çekin ve silikon boruyu gövdeye getirin. Silikon boruyu, iğnenin cam ucunun silikonun hemen ötesine çıkıntısı olacak şekilde ayarlayın. Bu yapılmazsa, silikon boru cam ve metal gövde arasında sıkışmış alabilirsiniz, iğne ucunu bloke. - Enjeksiyon gövdesini mikromanipülatöre bağlı bir iğneyle dikkatlice takın. İğnenin keskin ucuna dikkat edin ve yüzeylere çarpmadığı ve kırılmadığı konusunda dikkatli olun.
- Hem yumurtaya hem de iğneye mikroskoptan bakarken, iğneyi çanak ızgaranın sol üst köşesindeki yumurtaların yanına taşıyın.
- Ucu HBS artı% 1 Penisilin / Streptomisin kabızlık tamponlu çözelti girene kadar iğne düşürün.
- İğneyi görüş alanında ortalayın ve yumurta kabını hareket ettirin, böylece iğne yemeğin kenarına yumurtalardan birkaç mm daha yakın dır.
- İğne ile yumurta ızgarasının görünümünü engellemeyin.
- Mikroskobu Rhodamine'e uygun filtreye ayarlayın, böylece iğnedeki floresangözlemi gözlemleyin ve iğnenin ucuna odaklanın.
- Mikroenjektörde, enjeksiyon çözeltisi iğneden süspansiyon çözeltisine sızmaya başlayana kadar BALANCE topuzlarını saat yönünde yavaşça çevirin. Sayısal değer önemli olmasa da, mikroenjektörün ekranındaki bakiye numarası artmaya başlar. Daha sonra, boya iğneden dışarı sızan durana kadar düğmeyi saat yönünün tersine çevirin.
NOT: Her yeni iğne kullanıldığında bu dengeyi ayarlamak çok önemlidir. Denge uygun şekilde ayarlanamayınca, mikroenjektör enjeksiyon tetiklendikten sonra bir süre daha enjekte etmeye devam edecektir. İğne düğmesinin dengesiz bir iğneyle tek bir basması, yüklenen iğnenin tüm içeriğinin atılmasıile sonuçlanması na bile mümkündür. - İğne görüş alanında ortalanmış ile, iğne ilk enjekte edilecek yumurta hedefleniyor böylece yumurta çanak hareket ettirin. Enjeksiyonların düzenlenmiş yumurta ızgarasının bir köşesinde başlaması tavsiye edilir, örneğin sol üst köşede.
- Büyütmeyi yaklaşık 50x'e ayarlayın; bu büyütmede, tek bir yumurta görüş alanının çoğunu dolduracaktır.
- İğneyi enjeksiyon için pozisyona sokmak için hem mikromanipülörü hem de elini yumurta kabında kullanın.
- Mikromanipülatör kullanarak iğneyi ilerletin ve iğnenin ucunu enjekte edilecek ilk yumurtaya takın.
- İğneyi yumurtanın arka (künt) ucundan %20-30 yumurta uzunluğunda (Şekil1E)yumurtanın uzun eksenine dik olarak yerleştirin.
- Enjeksiyon ayak pedalı veya mikroenjektör üzerindeki enjeksiyon düğmesi ile çözelti enjekte edin. Yumurtanın içindeki küçük bir floresan madde bolusu başarılı bir enjeksiyona işaret eder (Şekil 1D).
NOT: Enjeksiyon sırasında yumurtadan bir miktar sarısı atılması nadir değildir (Şekil1F),ve bu mutlaka enjekte edilen yumurtanın canlı olacağını göstermez. - İğneyi yumurtadan geri çek. Yumurta, iğnenin geri çekilmesi üzerine istemeden kuyusundan çıkarılırsa, iğneyi geri çekerken yumurtayı kuyuya geri itmek için küçük forsepsler kullanın.
- İğne enjeksiyon sırasında iğne tıkanırsa, iğneyi yumurtadan çıkarın ve iğneyi HBS artı yumurtaları kaplayan %1 Penisilin/Streptomisin çözeltisine batırın, tıkanmış iğneyi Clear işlevini kullanarak veya enjekte ederek temizleyin Düğme.
- Aynı iğneyi kullanmaya devam ederek, mümkün olduğunca çok yumurta için enjeksiyon işlemini tekrarlayın. İlk başta, bu sadece yaklaşık 20 veya 30 yumurta olabilir ama uygulama ile 100 üzerinde artacaktır.
- İğne tıkanır ve temizlenemiyorsa, iğneyi atın, yeni bir iğne doldurun ve yeniden başlayın (örn. adım 5.7'ye dönün).
- Enjekte edilen yumurtaların yemeğini, embriyolar analiz için istenilen gelişim aşamasına ulaşıncaya kadar hafif nemli (buharlaşmayı en aza indirmek için) sıcak bir kuluçka makinesinde (23,5-26 °C) saklayın.
- En az her 24 saat, artık uygun olmayan yumurtaları çıkarın (Şekil3A,B), ve süspansiyon çözeltisini taze HBS artı %1 Penisilin/Streptomisin ile değiştirin.
- Enjeksiyondan 2-3 gün sonra, yumurtaları nazik pipetleme veya plastik prömiyerlerle HBS artı %1 Penisilin/Streptomisin ile nemlendirilmiş kağıt havlulara aktararak ılık, nemli kuluçka makinesinde gelişmeye devam edin.
- Yumurtaları izleyin ve artık her gün uygun olmayan yumurtaları çıkarın (Şekil3A,B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kriket kolayca nemli malzeme içinde yumurta yatıyordu ve nemli kum veya kir gibi yeterli malzeme sağlayan, onları yumurta çok sayıda koymak için neden olur. Bu özellikle kriketlerin ilk olarak 8-10 saat boyunca yumurtlama materyalinden yoksun bırakılması durumunda etkilidir. Bir diseksiyon mikroskobu, bir mikroenjektör ve bir mikromanipülatör (Şekil1A)çeşitli malzemeler (Şekil1D)ile bireysel yumurta enjekte etmek için kullanılabilir. Yumurtalar arka uca yakın bir yerde, ön-posterior eksen boyunca yaklaşık %20-30 oranında enjekte edilir (Şekil1E). Bu farklılıklar genellikle ince olduğundan, daha sivri ön ucunu daha körelmiş arka uçtan ayırt etmek zor olabilir (Şekil 1E). Bir yumurtayı yan yana yuvarlamak genellikle hangi ucun hangisi olduğunu ortaya çıkarır. Enjeksiyon iğnesi çıkarıldıktan sonra, yumurta sarısı bazen çıkarılır (Şekil1F),Bu içinde gelişmekte olan embriyo sağlığını tehlikeye görünmüyor olsa.
Bu protokoldeki en kritik adımlardan biri yontucu iğnelerin hazırlanmasıdır. Uzun, ince iğneler çekildikten sonra 20° açıya doğru yönlendirilmeli ve 10μm (± 2 μm) açıklık çapına sahip olmalıdır. Çapı çok büyükse, enjeksiyon çözeltisi iğneden dışarı sızar ve bu iğneler yumurtalarda büyük delikler oluşturarak sağkalım oranlarını düşürür. Dar iğneler hayatta kalma yeteneğini artırır, ancak çok dar sayıldıkları takdirde kolayca tıkanırlar, bu da enjeksiyonları yavaşlatır ve sinir bozucu hale getirir. İğne çapı 10 μm ± 2 μm olan iğne tıkamadan tek bir iğne ile 100 yumurtadan fazla enjekte etmek mümkündür.
İğneler bir mikro öğütücü veya beveller (Şekil2A)ile kaplandırılabilir. Bu ekipman parçaları bir mikroskop bağlı ile elde edilebilir, ya da bir mikroskop içermeyen modeller için bağımsız bir stand üzerinde bir diseksiyon kapsamı ekleyebilirsiniz. Küçük bir mikromanipülatör, istenilen açıya yatırılabilen ve damlama suyuyla nemlendirilen dönen bir öğütme düzleminin yüzeyine indirilebilen iğneyi tutar. Şekil2B'de çekilen ancak yaslanmamış iğneörneği Şekil 2B'de görülebilir ve Şekil 2C'de20° yayı olan bir iğne gösterilmiştir. İğneler daha sonra zarar görmesini önlemek ve temiz tutulmak için güvenli bir şekilde saklanmalıdır (Şekil2D).
Mikroenjektörüzerinde dengeyi ve enjeksiyon basıncını uygun şekilde ayarlamak, aynı iğneyle enjekte edilen her yumurtaya benzer miktarda malzeme enjekte edilmesine olanak sağlayacaktır. Farklı çapa sahip bir iğneye doğru değiştirildiğinde enjeksiyon ve denge basınçlarının optimizasyonu gerekecektir. Bu optimizasyon enjeksiyon darbeleri tutarlılığını maksimize edecektir.
Hayatta kalma oranı bu deneylerin başarısını değerlendirmek için önemli bir parametredir. Ölü yumurtaların çoğu görme ile kolayca şu şekilde tanımlanabilir: yumurtanın içindeki sarısı ve embriyonik doku düzensiz bir şekilde kümelenmeye başlar (Şekil 3A) ve sonunda sarısının çoğu yumurtanın bir tarafına geçer (Şekil 3B). 4-6 gün sonra değerlendirildiğinde (evre 8-15'e eşdeğer)19,enjekte edilmemiş yumurtaların %85'inden fazlası hayatta kalırken, deneysel reaktiflerle enjekte edilen yumurtaların genellikle daha düşük bir sağkalım oranı vardı (Şekil3C). İğne delinmesi, boya ve tampon un piyasaya sürülmesi veya araç veya dsRNA'nın varlığı da dahil olmak üzere enjeksiyonun tüm yönlerini kontrol etmek, deneysel manipülasyon girişiminin gerçek etkilerini anlamak için gereklidir (Şekil 3C). Deneysel manipülasyona bağlı olarak, daha yüksek bir öldürücülük düzeyi beklenebilir ve manipülasyonun öldürücü olmayan etkilerini değerlendirmek için denemenin zamanlamasını veya enjeksiyonun zamanlamasını değiştirmeleri gerekebilir.
Enjeksiyonun phenotipik sonuçlarını değerlendirme şekli, enjekte edilene bağlıdır. Örneğin, belirli mRNA knockdowns bir sonucu olarak henotik değişiklikler brüt anatomi düzeyinde belirgin olabilir. Örneğin, zeste (E(z)) geni normalde Ultrabithorax (Ubx) dahil olmak üzere Hox genlerini bastırır. E(z) için dsRNA enjekte etmek E(z) fonksiyonunu devirır ve Ubx bastırmayı serbest bırakır ve ektopik Ubx ekspresyonu ile sonuçlanır. Bu ventral uzantıları beş çift dönüşümüne yol açar (anten, maksilla, labium, T1 ve T2 bacak) T3 bacak benzeri uzantıları içine, Bu segmentlerde Ubx derepression nedeniyle20. İkinci bir örnekte, bir transgenin başarılı bir şekilde eklenmesini tsaymak için GFP ifadesini kullanmak mümkündür. Örneğin, g. bimaculatus Actin organizatörü kontrolü altında bir eGFP etiketli Histon 2B genini kodlayan bir cDNA, piggyBac transposase kullanılarak kriket genomuna yerleştirildiğinde, her çekirdeği görselleştirmek mümkün hale geldi. eGFP etiketli His2B proteinini heyecanlandırmak için floresan kullanarak yumurtada (Şekil 4C,D). Bu durumda, zaman içinde çekirdeklerin hareketini izlemek mümkün oldu7.
| Çözümün Adı | Bileşen | Yorumlar / Açıklama |
| 10x Enjeksiyon Tampon Çözeltisi | 1 L H2O eklemek: 0.8 g NaCl, 0.09 g Na2HPO4, 0.04 g KH2PO4, 2.98 g KCl | Stoku 4 °C'de saklayın. Kullanılmadan hemen önce 0,45 μm şırınga filtreile donatılmış 1 mL şırınga ile küçük bir miktar filtre uygulayın. Yaklaşık 500 μL Enjeksiyon Çözeltisi filtrelemek için gerektiği gibi tekrarlayın. Deneme süresince filtrelenmiş Enjeksiyon Çözeltisini buzüzerinde saklayın. |
| HEPES tamponlu tuzlu | 1 L H2O, eklemek: 8,77 g NaCl, 5.2 g HEPES, | pH ile 7.0 arasında dır ve 4 °C'de saklayabilirsiniz. |
| Tetrametil Rhodamine Dextran (10.000 MW) boya stok çözeltisi | Thermofisher'dan rhodamine boya | Bu boya genellikle bir lyophilized toz olarak satılmaktadır. Bu durumda, su ile 50 mg / mL bir stok çözeltisi makyaj. Herhangi bir çözünmez parçacıkları kaldırmak için 5 dakika için 12.000 x g santrifüj. Merkezleme den sonra supernatant toplayın, tüpün altındaki herhangi bir partikül madde kaçınarak, aliquot ve -20 °C'de donma. Kullanılan stok aliquots 4 °C'de bir ila iki hafta tutulabilir. Aliquots'u birden çok kez donduran aktankaçının. Boya nedeniyle iğneler tıkanıyorsa, boya Whatman #2 filtre kağıdından da filtrelenebilir. |
Tablo 1: Çözüm tarifleri ve notlar.
Şekil 1: Yumurta enjeksiyon protokolüne genel bakış. (A) Yumurta enjeksiyonları için kullanılabilecek tipik bir kurulum. (B) Yumurtalar bir elek ile kumdan ayrılır. (C) Yumurta sıcak, sıvı agarose içine bir kalıp yerleştirerek yapılan küçük kuyularda enjeksiyon için tutulur. (D) İğnede ve enjekte edilen beş yumurtada floresan parçalama mikroskobu ile görülebilir. (E) Enjekte edilmemiş bir yumurta. Ön uç (hafifçe sivri; sol) ve arka uç (daha körelmiş; sağ) birbirinden ayırt edilebilir. Enjeksiyon için en uygun bölge, arka uca yakın, braket ile gösterilir. (F) Enjeksiyondan iki gün sonra yumurta. Enjeksiyon yeri hafif bir renk değişikliği olarak görülebilir ve az miktarda çıkarılan sarısı belirgindir (ok). Ölçek çubukları = 1 mm (D); 0,5 mm (E ve F). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İğneler mikro öğütücü veya beveller kullanılarak yaslanır. (A) Bir mikro öğütücü örneği dairesel, dönen taşlama yüzeyi damlama RO su ile nemlendirilmiş (görüntünün üst kısmında gösterilen şırınga dan su damlaları). (B) Dikilmeden önce çekilen iğneler uzun ve dardır. (C) 20°'ye indikten sonra keskin bir enjeksiyon iğnesi oluşturulur. İç lümenin 10 μm çapındaki çapına dikkat edin. (Kırmızı pul çubukları = 10 μm). (D) Çekilmiş, yontma iğneler bir petri kabında kapaklı olarak saklanabilir ve diş balmumu kullanılarak yerinde tutulabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Enjeksiyonlar sağkalım oranını azaltabilir. (A) Ölü ve ölmekte olan yumurtalar görsel inceleme de açıktır. (B) Zamanla, malzeme yumurtanın bir tarafına göç edecektir. (C) Yumurta yumurtlamadan 4-6 gün sonra çeşitli koşullar da dahil olmak üzere sağkalım oranlarının karşılaştırılması: enjekte edilmemiş yumurtalar (n = 6 deneyler); yumurtalar 9 μm iğne ile delinmiş ama enjekte edilmemiş (n = 2 deneyler); tampon ve boya enjekte edilen yumurtalar (n = 13 deneyler); tampon, boya ve plazmid vektörü enjekte edilen yumurtalar (n = 2 deneyler); tampon, boya ve DMSO enjekte edilen yumurtalar (n = 11 deneyler); ve tampon, boya ve kontrol dsRNA (n = 22 deneyler) enjekte yumurta. Kullanılan kontrol dsRNA türü eGFP veya dsRed karşı dsRNA dahil. Her çubuğun tabanındaki sayılar, her koşul için kullanılan hayatta kalan toplam yumurta / toplam yumurta sayısını not alar. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil ediyor. Ölçek çubuğu = 1 mm (A ve B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Enjeksiyon sonuçlarının değerlendirilmesi. (A-B) Zeste Arttırıcı (E(z)) dsRNA enjeksiyonu Ubx mRNA'nın normal ifadesini değiştirir ((A'da gösterilen yabani tip) ve antenlerin (AN) ve ağız parçalarının (Mx, Lb) bacak benzeri uzantırlara (B) dönüşümüne yol açar. (C-D) Transpozable element piggyBac ve histone2B-eGFP ile erken yumurta enjeksiyonu transgenik embriyolar tüm çekirdeklerde GFP ifade üretir. Çekirdeklerin yeri yumurtlamadan 8saat sonra (C ) ve yumurtlamadan 20 saat sonra (D) görülebilir. Kısaltmalar: An = Anten; Mx = maksilla; Lb = labium; T1-3 = torasik bacaklar 1-3; RNAi = RNA girişim; Gb = G. bimaculatus; Act = actin; H2B = Histone H2B; GFP = yeşil floresan protein. Ölçek çubukları = 200 μm (A ve B); 500 μm (E ve F). Bu deneysel sonuçlar aslındabaşka bir yerde 7,20açıklanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu teknikile iki ana zorluklar optimal iğne boyutu ve hayatta kalma ile ilgili konulardır. Küçük iğneler hayatta kalma yeteneğini artırmak rağmen, dar lümenile iğneler iş yerinde kılcal kuvvetler daha büyük bir dereceye sahip, hangi sarısı iğne içine hareket edecek daha olası dır tıkanmasına neden. En iyi durumda, tıkanıklıklar sadece başka bir yumurta enjekte ederek veya yukarıda açıklandığı gibi iğne temizleyerek temizlenebilir. Bir de yumurta sarısı iğne dışarı itilir kadar mikroenjektör üzerindeki denge basıncını artırmak için deneyebilirsiniz. Bu teknikle ilgili bir diğer büyük zorluk da hayatta kalmadır. Bizim elimizde, deneysel çözümler enjekte yumurta için sağkalım oranları genellikle% 40 ve 80 arasındadır. Sağkalım oranları bu tekniği öğrenmeye başlayanlar için % 10 gibi düşük olabilir ama uygulama ile artıracaktır. Negatif kontroller, yukarıda açıklandığı gibi, araştırmacıların çeşitli malzemelerin tanıtılmasının sağkalım oranlarını düşürebileceği göz önüne alındığında, uygulama ile sağkalım oranındaki değişiklikleri doğru bir şekilde değerlendirmek için önemlidir (Şekil3C).
Enjeksiyonların zamanlaması her deneysel yaklaşım için de önemli bir husustur. Yaşlı yumurtaların enjekte etmesi genç yumurtalara göre daha zordur ve genel olarak, daha genç yumurtalara daha genç enjekte edilirken sağkalım oranları daha yüksektir. İğne ve enjekte edilen malzemenin daha sonraki aşamalarda piyasaya sürülmesi istenmeyen anatomik hasara yol açabilir. Ancak deneyimle iki ila üç günlük yumurta enjeksiyonu mümkündür. Bu aşamalarda yumurtanın sırt tarafını hedeflemek, ventral tarafta ilk formları embriyo, zarar önlemek için yardımcı olur. Arka uç hedefleme yumurta19,21bu sonuna yakın meydana gelen ilk nükleer bölünmeler ve mikrop bandı oluşumu, reaktif erişimi artırabilir. Genomu manipüle etmeye çalışmak, genom modifikasyonunun yaygın somatik veya germline iletimini sağlamak amacıyla, 19 yumurtlamadan yaklaşık 14 saat sonra başlayan hücreselleşmeden önce enjeksiyonlar yapılmalıdır. . MRNA düzeylerine dsRNA enjekte edilirse, enjeksiyonlar için zaman penceresi, gelişimde bir ilgi genini yıkmak için ne kadar erken bir süreye göre belirlenmelidir. RNAi etkileri büyük olasılıkla bir süre için son olsa da, dsRNA hangi bir fenotip herhangi bir değişiklik değerlendirmek için planlar zaman öncesinde tanıtılması gerekir. Enjeksiyon sırasında geçen süreyi ve embriyonik gelişimin ilerlemesini takip etmek, uygun evre yumurtaların enjekte edilmesini sağlamak için önemli olabilir. Hangi malzeme enjekte edilirse enjekte edilemesin, enjeksiyondan sonraki gelişimsel gecikmeler yaygındır, ancak gecikmenin derecesi enjektöre bağlı olarak değişebilir.
Burada sunulan protokol, nispeten pahalı ekipman parçaları bir dizi dayanır. Ancak, bazı veya bu öğelerin tümü kullanılmadan başarıyla yumurta enjekte etmek mümkün olmalıdır. Örneğin, piyasada çeşitli mikroenjektörler vardır ve bazıları MalzemeTablosu'nda önerilenden daha ucuz olabilir. Bu biraz pratik alacak olsa da, sadece uygun miktarda malzeme enjekte etmek için bir şırınga kullanmak da mümkündür. Pahalı bir mikromanipülatör yerine, bir iğne sabit tutmak ve yavaş, kontrollü ilerleme izin malzemeleri çeşitli kullanabilirsiniz, ve basit bir plastik tasarım diğerleri tarafından kullanılmıştır22. Aynı zamanda bir beveller kullanımıönlemek mümkün olabilir, bizim deneyim uygun beveling enjeksiyonların başarısı için büyük bir fark yaratabilir rağmen. İğneucunu en iyi kum kağıdıüzerinde elle sürükleyerek, bu işlemi mikroskop altında değerlendirerek çekilen bir iğneyi keskinleştirmek mümkün olabilir. Ne olursa olsun, keskinleştirilmiş iğneler enjeksiyonları daha kolay hale getirecek ve hayatta kalma yeteneğini artıracaktır.
Bu enjeksiyon tekniği esnektir ve çeşitli manipülasyonlar için kullanılabilir. Burada dsRNA ve piggyBac'a bağlı genomik modifikasyon deneyleri için sonuçlar gösterdik, ancak CRISPR/Cas veya diğer yaklaşımları bu teknikle kullanmak da mümkündür. Burada yer alan deneylerde ortaya çıkan fenotipler bariz ve değerlendirilmesi kolaydı. Bazı deneyler, deneysel manipülasyonun etkilerini görmek için immünohistokimya veya diğer görselleştirme araçlarının kullanılmasını gerektirebilir. Enjeksiyonlara alternatif bir alternatif elektroporasyon kullanımı, hangi in vivo hücre ve dokulara DNA veya diğer makromoleküllertanıtmak için kullanılabilir. Elektroporasyon, embriyoların belirli bölgeleri hedeflemek için zaten oluşturduğu eski kriket yumurtalarında kullanılabilir8, ancak deney gelişmekte olan tüm embriyonun hedeflenmesini gerektirdiğinde enjeksiyon daha yararlıdır. Bu enjeksiyon tekniği aynı zamanda yumurtalarda çeşitli farklı hemimetabolöz ve holometabolöz böceklerin kullanımı için kolayca uyarlanabilir olmalıdır, ideal anlamlı karşılaştırmalı çalışmalar üstlenme yeteneğini geliştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu projede bildirilen araştırmalar, P20GM10342 ile HH3 arasında yer alan Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) ve NSF ödül numarası IOS-1257217 tarafından desteklenmiştir. Cge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
