Summary
Her præsenterer vi en protokol til at injicere cricket æg, en teknik, der tjener som en fundamentale metode i mange eksperimenter i cricket, herunder, men ikke begrænset til, RNA-interferens og genommanipulation.
Abstract
Ændring af genfunktion i en udvikler organisme er afgørende for forskellige former for eksperimenter. Mens uhyre kraftfulde genetiske værktøjer er blevet udviklet i traditionelle modelsystemer, er det vanskeligt at manipulere gener eller Messenger RNA (mRNA) i de fleste andre organismer. Samtidig er evolutionære og komparative tilgange afhængige af en udforskning af genfunktion i mange forskellige arter, hvilket nødvendiggør udvikling og tilpasning af teknikker til manipulation af udtryk uden for nuværende genetisk Tractable Arter. Denne protokol beskriver en metode til injektion af reagenser i cricket æg til analyse af virkningerne af en given manipulation på embryonale eller larve udvikling. Instruktioner til, hvordan man samler og injicerer æg med affasede nåle, er beskrevet. Denne relativt ligetil teknik er fleksibel og potentielt tilpasningsdygtig til andre insekter. Man kan samle og injicere snesevis af æg i et enkelt eksperiment, og overlevelsesrater for buffer-only injektioner forbedres med praksis og kan være så højt som 80%. Denne teknik vil understøtte flere typer af eksperimentelle tilgange, herunder injektion af farmakologiske midler, in vitro-udjævnet mRNA at udtrykke gener af interesse, dobbelt-strandede RNA (dsRNA) for at opnå RNA-interferens, brug af grupperet regelmæssigt hinanden korte palindromiske gentagelser (crispr) i koncert med crispr-associerede protein 9 (Cas9) reagenser til genomisk modifikation, og overføres elementer til at generere forbigående eller stabile transgene linjer.
Introduction
Evnen til at ændre genomet eller påvirke genekspression i organismer er grundlaget for udformningen af mange typer eksperimenter, der tester funktionel kausalitet. Det er også afgørende for det komparative og evolutionært relevante arbejde, at genomiske og ikke-genomiske modifikations teknikker er tilgængelige i organismer uden for traditionelle genetiske laboratoriesystemer for dyremodeller (f. eks. mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans). Uanset om det er ønsket om at forstå organisme mangfoldighed1 eller ens tilslutning til Kroghs princip, at der for hvert biologisk spørgsmål er en organisme bedst egnet til sin løsning2,3, evnentil at ændre genomer eller indflydelse genekspression er afgørende for moderne eksperimentelle designs.
Cricket Gryllus bimaculatus er et spirende model system. Anvendes til det sidste århundrede i Neuro eksperimenter4, de sidste to årtier har været vidne til en øget eksperimentel interesse i cricket, især fokuseret på udviklingen og udviklingen af denne organisme5. Cricket er et hemimetabolous insekt, der grene basale til godt studeret holometabolous insekter, såsom D. melanogaster og tribolium castaneum6. På grund af sin nyttige position på det evolutionære træ, videnskabsfolk er interesseret i at spørge moderne, sofistikerede eksperimentelle spørgsmål i dette insekt, som har ført til en stigende interesse i at tilpasse molekylære værktøjer til brug i G. bimaculatus.
Injektioner af molekylære reagenser i cricket æg kan anvendes til genommodificering eksperimenter samt ikke-genomisk manipulationer af genekspression i embryoner. For eksempel, transgene G. bimaculatus transporterer egfp indsættelser er blevet oprettet ved hjælp af transposase piggybac7,8. Efterforskerne har med succes skabt knockout G. bimaculatus ved hjælp af zink finger-nukleaser (zfns) og transkriptionsaktivator-lignende (tal) Effector Nucleaser (talens) for at indføre dobbelt strandede pauser i specifikke genomområder9. Selvom ZFNs og TALENs tillader websteds specifik målretning i dyr ud over de fire store modelsystemer, er disse reagenser hurtigt blevet overgået af CRISPR/Cas9-systemet, som er enklere at bruge, mere effektivt og yderst fleksibelt10. Crispr har været anvendt i G. bimaculatus til at producere knock-out11 samt Knock-in linjer12,13 foruden genomisk modifikation kan dsRNA injiceres i æg for at vælte mRNA-ekspression i udviklings embryoer, så efterforskerne kan forstå rollen for specifikke udskrifter gennem udvikling14,15. Nogle begrænsede detaljer om, hvordan man injicere cricket æg er blevet offentliggjort tidligere12.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til indsprøjtning af tidlige G. bimaculatus -æg. Denne protokol er effektiv og let at tilpasse til forskellige laboratorie indstillinger, injektion materialer, og eventuelt til andre insekter. Mens yderligere detaljer for at designe og gennemføre genomændringer og Knockdown eksperimenter er blevet offentliggjort andetsteds12,13, vil disse tilgange i sidste ende afhænge af injektion protokol detaljeret her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hardware opsætning og klargøring af materialer
Bemærk: Se tabel 1 og tabel over materialer til fremstilling af opløsninger, reagens og udstyrsdetaljer.
- Indstil et dissekere mikroskop for at se æg og guide injektions nålen. (Figur 1a viser et dissekterende mikroskop, der er udstyret med fluorescens). Fluorescens evne er fordelagtig, men ikke nødvendig.
- Placer en 3-akset micromanipulator for at manøvrere injektions nålen på plads (figur 1a).
- Indstil en mikroinjektor med slanger og en kanyle holder til at injicere små mængder materiale (figur 1a). Eventuelt bruge en fodpedal, som ikke er vist i figuren.
- Design og skabe et stempel til at skabe brønde til æg (figur 1c) ved at udskrive den inverse af det ønskede mønster, enten med en 3D-printer eller en laser gravør.
Bemærk: Det viste 3D-prøve stempel er 4,5 cm x 5 cm med 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm fremspring til at skabe individuelle brønde. Detaljer om hvordan man laver en række tilpasselig forme er blevet offentliggjort andetsteds16. - Forbered 10x injektions buffer, HEPES Buffered saltvand (HBS), og en stamopløsning af Tetramethylrhodamine dextran farvestof og opbevares ved 4 °C.
- Forbered eksperimentelle opløsninger, der skal injiceres, såsom dsRNA, crispr/Cas912, overføres elementer, in vitro-udjævnet mRNA7,8, farmakologiske agenser17, zfns, eller talens9.
- Placer dobbelt-stick tape på flere lag af standard Lab tape på et glas mikroskop slide for at skabe en platform 1 mm eller deromkring over glasset slide, som vil blive brugt til at holde nåle til vurdering.
- Forbered en cricket container ca. 40 cm x 60 cm i størrelse med et låg, der besidder en mesh-dækket åbning til luftcirkulation.
- Tilsæt mad, vand og ly materialer.
- Tilføj flere dusin raske mandlige og kvindelige voksne fårekyllinger. Identificer voksne cricket ved tilstedeværelsen af vinger.
Bemærk: En række post-imaginal aldre kan øge ægudbyttet. Tætheden af fårekyllinger bør være relativt høj for at kunne indsamle nok æg til et eksperiment, men ikke så overfyldt, at kannibalisme opstår. For eksempel, ca to dusin sunde fårekyllinger, med en nogenlunde lige mand til kvinde forhold, i en container af den størrelse, der er nævnt ovenfor bør være tilstrækkelig til at indsamle omkring 200 æg i en en til to h periode. Fårekyllinger kan opbevares ved stuetemperatur, men udvikling og adfærd vil være optimal, hvis fårekyllinger vedligeholdes i en varm (23,5-26 °C), fugtigt (40-60% relativ luftfugtighed) inkubator.
2. fremstilling af nåle til injektion
- Brug Borosilikat glas kapillærer med filament (Se tabellen over materialer for størrelses detaljer). Forbered træk nåle på samme dag, eller op til et par dage før injektioner er afsluttet.
- Placer et kapillar glas i pulleren, centrer glasset på glødetråden, og stram knopper for at fastgøre glasset på plads.
- Indstil pullertemperaturen i nærheden af glas rampen Temp (-5 °C til + 10 °C).
- Brug en enkelt-trins, høj-varme protokol til at trække en lang koner med en lille åbning, men undgå at smelte enderne lukket.
Bemærk: For eksempel, når du bruger mikropipette aftrækker beskrevet i tabellen over materialer udstyret med en boks filament, skal du bruge følgende parametre for glas med en rampe temperatur på 478: varme 478; Træk 45; Vel 75; Del 120. Optimale betingelser for fremstilling af en nål med den i figur 2b viste form skal bestemmes empirisk af hver enkelt bruger. - Spidser med facet nåle som forberedelse til injektionerne.
- Våd den roterende slibemaskine plan af beveler (figur 2a) med dryp vand. Brug enten omvendt osmose (RO) eller diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlet destilleret vand.
- Placer den trak nål i skrå og drej til en 20 ° vinkel.
- Sænk nålen, indtil den bare rører slibe planet og facet i 2 til 3 min.
- Vurder facet ved at placere skrå nålen på dobbelt-stick tape, der er blevet klæbet til et glas mikroskop slide.
- Placer diaset holder nålen på scenen af et sammensat mikroskop udstyret med et kamera og billed erhvervelse software.
- Erhverve et billede af nålens spids ved hjælp af en 20x mål.
- Brug billedbehandlings softwaren til at måle den indvendige lumen diameter af nålen bare proksimalt til den skrå åbning (figur 2c). Den optimale størrelse er 10 μm + 2 μm.
- Kassér nåle, der har en åbning under 8 μm og over 12 μm.
- Opbevar nålene i en beholder med låg for at undgå at blive støvede. Brug en stribe voks eller lignende materiale til at løfte nålene fra bunden af beholderen for at undgå at bryde spidserne (figur 2D).
3. opsamling og tilberedning af æg
- Maksimer antallet af æg lagt ved at fratage fårekyllinger af enhver fugtig æglæggende materiale (vand hætteglas, æggeretter) natten over eller i mindst 8 – 10 h før du forsøger at indsamle æg.
Bemærk: Da hunnerne har evnen til internt at opbevare sperm, en anderledes timet procedure kan være nødvendigt, hvis omhyggeligt timet befrugtning er eksperimentelt afgørende18. - Der fremkommer 40 mL 1% agopstået i vand og hældes i en 10 cm petriskål.
- Placer et æg-brønd stempel på overfladen af agopstået, før det størkner.
- Fjern stemplet, når den agopstået er solidificeret, for at afsløre brøndene (figur 1c).
- Fyld agrose brønd pladen med HBS indeholdende 1% penicillin/streptomycin.
- Anbring låget på skålen, Pak det i parafilm, og opbevar det ved 4 °C.
Bemærk: Retterne kan opbevares i et par dage ved 4 °C, men skal opvarmes til stuetemperatur før brug for at undgå kondens. - Lav en æg kollektion skål for fårekyllinger til at lægge æg i ved at fylde en 35 mm petriskål med hvid legeplads sand (figur 1b).
Bemærk: Det sand, der er specificeret i tabellen over materialer , er af passende kornstørrelse. Hvis sandkornene er for store, vil sandet beskadige æggene. - Dæk ægge skålen med et kvadrat af papirhåndklæde skåret til at være ca. 18 cm x 18 cm, og Placer på toppen af skålen med sand. Gennem denne papir håndklæde dække den fyldte fad med vand fra hanen.
- VIP Petri skålen og klem forsigtigt toppen for at fjerne overskydende vand.
- Tag hjørnerne af papirhåndklæde pladsen under skålen og Placer ægge skålen i det omvendte låg, hvilket vil hjælpe med at holde papirhåndklæde dækslet på plads.
- Placer ægge skålen i cricket bin og lad de voksne hunner til oviposit æg for en til to h.
Bemærk: Den relativt korte tid her sikrer, at alle æggene vil være ens i udviklingsfasen på tidspunktet for injektionen. Hvis injektion før cellularisering er vigtigt, injektioner skal ske inden 14 h af æglægning19. - I mellemtiden tillader agopstået skålen (fra trin 3,6) at varme til rumtemperaturen som forberedelse til at holde æg til injektion.
- Fjern æg indsamling parabol, nu indeholder frisk lagt æg, fra cricket bin, og fjern papirhåndklæde dækslet. Anbring en si med en porestørrelse på 0,5 – 1 mm over et bægerglas med en kapacitet på mindst 500 mL (figur 1b).
- Skyl indholdet af æglægnings skålen (sand og æg) ind i straineren under forsigtigt rindende ledningsvand, så sandkornene falder gennem strainermasken i vandet i bægerglasset nedenfor, men forlader cricket æggene i si kurven.
- Fyld en beholder med RO vand og anbring den i en bakke. Vend straineren over beholderen og Tap den mod skålen for at skille æggene i vandet. Æggene vil synke til bunden af beholderen.
- Skær spidsen af en P1000-pipettespids med en saks for at lave en åbning på ca. 3 mm i diameter. Placer dette tip på en P1000 pipette og bruge det til at overføre æggene fra beholderen til den agrose Egg skimmel skål, overførsel så lidt vand som muligt.
- Brug plastik pincet til at line op æg i agopstået brønde fyldt med HBS plus 1% penicillin/streptomycin. Hvert æg vil synke til bunden af en individuel brønd. Låget med Petri skålen, indtil det er klar til injektion.
4. klargøring af Mikroinjektoren
- Fastgør mikroinjektoren til en trykluft-eller gaskilde (denne protokol er optimeret ved hjælp af enten trykluft eller N2).
Bemærk: Hvis du bruger en bærbar lufttank, skal du fylde mindst 75 PSI. Tanken vil miste lufttrykket gennem hele indsprøjtningerne og kan være nødvendigt at genpåfyldes; injektioner bliver svært under 40psi. - Tænd for mikroinjektoren. Indstil Indsprøjtnings tiden til 0,17 s og trykket til 10 – 15 PSI.
Bemærk: Det nøjagtige tryk, der er behov for, vil afhænge af åbningen af nålen og skal bestemmes empirisk for hver runde af injektion og/eller ny nål anvendes. - Sørg for, at mikroinjektorens BALANCE knap drejes til 0 (typisk helt mod uret), og at mikroinjektoren er under tryk og i injektions tilstand.
5. injektioner
- Filtrer omkring 500 μL 10x injektions buffer ved hjælp af en 1 mL sprøjte og et 0,45 μm sprøjte filter.
- Bland Indsprøjtnings reagenser (de følgende detaljer er til injektion af dsRNA tilberedt som beskrevet i12).
Bemærk: Det kan være tilrådeligt at designe og udføre flere kontroller, især når man først er ved at lære denne teknik. Poking æg uden indsprøjtning, indsprøjtning buffer + farvestof alene, eller indsprøjtning buffer + farvestof + en kontrol reagens (såsom eGFP dsRNA) er alle gode tests af, hvordan forstyrrende forskellige elementer i injektion protokol kan være. Se figur 3 for overlevelsesevnen for en række forskellige kontroller. - Start med en 4 mL dsRNA-alikvot.
- Tilsæt 0,5 mL af den filtrerede 10x injektions buffer til dsRNA alikvot.
- Tilsæt 0,5 mL 50 mg/mL tetramethyl rhodamin dextran Dye stamopløsning. Hvis du arbejder på en dissekere område uden fluorescens, brug phenol rødt i stedet.
- Opbevar alle materialer på is i varigheden af injektions perioden.
- Læg injektionsopløsningen i en injektionsnål med 20 mL læsse spidser og et P10-pipet.
- Træk en 1,5 mL injektionsvæske op, og sæt læsse spidsen ind i den brede ende af injektions nålen.
- Skub opløsningen ud så langt ned i nålen som muligt, og Eliminer luftbobler ved at svirpe forsigtigt; Pas på ikke at bryde nålen.
- Placer skålen af æg under dissekere mikroskop og vælg en lav forstørrelse på omkring 10x (1x forstørrelse set gennem 10x Eye mål).
- Sæt kanylen ind i injektions huset og stram den.
Bemærk: Pas på, at nålen er korrekt og solidt indsat i huset. For at gøre dette, trække den brede ende af nålen tilbage ud af metalhus, bringe silicium slangen i huset med det. Juster silikone slangen, så glas enden af nålen stikker lige ud over silicium. Hvis dette ikke er gjort, kan silicium slangen blive klemt mellem glasset og metalhus, blokerer enden af nålen. - Indsæt forsigtigt injektions huset med en påsat nål i micromanipulatoren. Vær opmærksom på den skarpe ende af nålen og vær forsigtig, at det ikke er stødt ind i overflader og brudt.
- Mens du kigger på både æggene og nålen gennem mikroskopet, skal du flytte nålen nær æggene i øverste venstre hjørne af parabol gitteret.
- Sænk nålen, indtil spidsen kommer ind i HBS plus 1% penicillin/streptomycin Buffered opløsning i skålen.
- Centrer nålen i synsfeltet og flytte ægge skålen, så nålen er et par mm tættere på kanten af skålen end æggene.
- Må ikke hindre visningen af gitteret af æg med nålen.
- Sæt mikroskopet til filteret passende for Rhodamine, så det er muligt at observere fluorescens i nålen og fokusere på spidsen af nålen.
- På mikroinjektoren skal du langsomt dreje på BALANCE knappen med uret, indtil injektionsopløsningen begynder at lække ud af nålen ind i affjedrings opløsningen. Balance nummeret på skærmen på mikroinjektoren vil begynde at stige, selvom den numeriske værdi ikke er vigtig. Drej derefter knappen tilbage mod uret lidt, lige indtil farvestoffet holder op med at lække ud af nålen.
Bemærk: Det er vigtigt at indstille denne balance, hver gang der anvendes en ny nål. Uden at vægten er indstillet korrekt, vil mikroinjektoren fortsætte med at injicere i nogen tid efter injektionen udløses. Det er endda muligt, at et enkelt tryk på injektionsknappen med en ubalanceret nål vil resultere i udvisning af hele indholdet af den belastede nål. - Med nålen centreret i synsfeltet, flytte ægge skålen, så nålen er rettet mod ægget, der skal injiceres først. Det anbefales, at injektioner starter i et hjørne af gitteret af arrangerede æg, for eksempel det øverste venstre hjørne.
- Juster forstørrelsen til omkring 50x; ved denne forstørrelse vil et enkelt æg fylde det meste af synsfeltet.
- Brug både micromanipulator og ens hånd på ægge skålen til at flytte nålen på plads til injektionen.
- Før nålen ved hjælp af micromanipulatoren og Indsæt spidsen af nålen i det første æg, der skal injiceres.
- Indsæt nålen ved 20 – 30% æglængde fra den bageste (blunter) ende af ægget (figur 1E), vinkelret på den lange akse af ægget.
- Injicer opløsningen enten med Indsprøjtnings fodpedalen eller injektionsknappen på mikroinjektoren. En lille bolt af fluorescerende materiale inde i ægget vil indikere en vellykket injektion (figur 1d).
Bemærk: Det er ikke ualmindeligt, at nogle æggeblomme skal skubbes ud af ægget under injektion (figur 1f), og det betyder ikke nødvendigvis, at det injicerede æg vil være inviable. - Træk nålen tilbage fra ægget. Hvis ægget utilsigtet løftes ud af sin brønd ved retraktion af nålen, bruge små pincet til at skubbe ægget tilbage i sin brønd, mens trække nålen.
- Hvis nålen træsko under injektionen, fjerne nålen fra ægget og, holde nålen nedsænket i HBS plus 1% penicillin/streptomycin opløsning dækker æggene, klar den tilstoppede nål ved hjælp af enten klar funktion eller ved at skubbe indsprøjtningen Knappen.
- Fortsæt med at bruge den samme nål, Gentag Indsprøjtnings proceduren for så mange æg som muligt. I første, dette kan være kun omkring 20 eller 30 æg, men vil stige til over 100 med praksis.
- Hvis nålen bliver tilstoppet og ikke kan ryddes, skal du kassere nålen, fylde en ny nål og begynde forfra (dvs. vende tilbage til trin 5,7).
- Opbevar skålen af injicerede æg i en varm inkubator (23,5 – 26 °C), der er lidt fugtigt (for at minimere fordampningen), indtil embryonerne har nået det ønskede udviklingsstadie for analysen.
- Mindst hver 24 h, fjerne æg, der ikke længere er levedygtige (figur 3a, B), og erstatte suspensionen opløsning med friske HBS plus 1% penicillin/streptomycin.
- To til tre dage efter injektionen overføres æggene med blid pipettering eller med plastik tang til papirhåndklæder fugtet med HBS plus 1% penicillin/streptomycin i en glaseret petriskål for at fortsætte udviklingen i den varme, fugtige inkubator.
- Overvåge æggene og fjerne æg, der ikke længere er levedygtige hver dag (figur 3a, B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fårekyllinger let lægge æg i det fugtige materiale, og giver passende materiale, såsom fugtigt sand eller snavs, inducerer dem til at lægge et stort antal æg. Dette er især effektivt, hvis fårekyllinger først berøves æglægnings materiale i 8 – 10 timer. æg, der er lagt i rent sand, kan let adskilles, opsamles (figur 1b) og anbringes i specialdesignede ægbrønde til injektion (figur 1c). En dissekere mikroskop, en mikroinjektor, og en micromanipulator (figur 1a) kan anvendes til at injicere individuelle æg med en række forskellige materialer (figur 1d). Æggene injiceres i nærheden af den bageste ende, i et punkt ca. 20 – 30% langs den forreste bageste akse (figur 1E). Det kan være svært at skelne den mere spidde forreste ende fra den mere sløvede bageste ende, da disse forskelle ofte er subtile (figur 1E). Rullende et æg fra side til side ofte hjælper med at afsløre, hvilken ende er der. Efter fjernelse af kanylen, æggeblomme er undertiden skubbet ud (figur 1f), selv om dette ikke synes at kompromittere sundheden for det udviklende embryon indeni.
Et af de mest kritiske trin i denne protokol er forberedelsen af affasede nåle. Efter at have trukket lange, slanke nåle skal de være Affaset til en 20 ° vinkel og har en åbnings diameter på 10μm (± 2 μm). Hvis diameteren er for stor, vil injektionsopløsningen lække ud af nålen, og disse nåle vil skabe store huller i æg, faldende overlevelsesrater. Smallere nåle øger overlevelsesevne, men hvis de er for smalle, de har tendens til at tilstoppe let, hvilket gør injektioner langsom og frustrerende. Med en nål diameter på 10 μm ± 2 μm er det muligt at injicere op mod 100 æg med en enkelt nål uden at have nålen tilstoppe.
Nåle kan være Affaset med en mikro-slibemaskine eller en affaseren (figur 2a). Disse stykker udstyr kan opnås med et mikroskop vedhæftet, eller man kunne tilføje en dissekere rækkevidde på en uafhængig stand for modeller, der ikke omfatter mikroskopet. En lille micromanipulator holder nålen, som kan vippes til den ønskede vinkel og sænkes til overfladen af en roterende slibe plan, som er fugtet med dryppende vand. Et eksempel på en trukket, men ubeveled nål kan ses i figur 2b, og en nål med en 20 ° facet er vist i figur 2c. Nåle skal derefter opbevares sikkert for at undgå beskadigelse og holdes rene (figur 2D).
Indstilling af balancen og indsprøjtningstrykket passende på mikroinjektoren bør gøre det muligt for en at injicere en sammenlignelig mængde materiale i hvert æg injiceres med samme nål. Optimering af injektion og balance tryk vil være nødvendigt, når du skifter til en nål med en anden diameter. Denne optimering vil maksimere konsistensen af Indsprøjtnings pulser.
Overlevelsesraten er en vigtig parameter for at vurdere succesen af disse eksperimenter. De fleste døde æg kan let identificeres ved synet som følger: æggeblomme og embryonale væv i ægget begynder at klumpe ujævnt (figur 3a) og i sidste ende det meste af æggeblomme vil migrere til den ene side af ægget (figur 3b). Når de blev vurderet efter 4 – 6 dage (svarende til trin 8 – 15)19, overlevet mere end 85% af ikke-injicerede æg, mens æg injiceret med eksperimentelle reagenser generelt havde en lavere overlevelsesrate (figur 3c). Kontrol for alle aspekter af selve injektionen, herunder kanyle punktering, indførelse af farvestof og buffer, eller tilstedeværelsen af køretøj eller dsRNA, er nødvendig for at forstå de sande virkninger af eksperimentel manipulation forsøgt (figur 3C). afhængigt af eksperimentel manipulation kan der forventes et højere niveau af dødelighed, og man kan være nødt til at ændre timingen af analysen eller tidspunktet for injektion for at vurdere eventuelle ikke-dødelige virkninger af manipulationen.
Den måde man vurderer de fænotypiske resultater af injektion afhænger af, hvad blev injiceret. For eksempel, fænotypiske ændringer som følge af specifikke mRNA knockdowns kan være indlysende på brutto anatomi niveau. For eksempel undertrykker genet Enhancer af zeste (E (z)) normalt Hox gener, herunder ultrabithorax (UBX). Injektion af dsRNA for e (z) slår e (z) -funktionen til og frigiver UBX -undertrykkelse, hvilket resulterer i ektopisk UBX -udtryk. Dette fører til omdannelsen af fem par ventrale vedhæng (antenne, maxilla, labium, T1 og T2 ben) i T3 ben-lignende vedhæng, på grund af derepression af UBX i disse segmenter20. I et andet eksempel er det muligt at bruge GFP-udtryk til at assay den vellykkede indsættelse af et transgen. For eksempel, når en cDNA kodning en eGFP-Tagged Histone 2b gen under kontrol af en G. bimaculatus actin Promoter blev indsat i cricket genom ved hjælp af piggybac transposase, det blev muligt at visualisere hver Nucleus i ægget ved hjælp af fluorescens at begejstre eGFP-Tagged His2B protein (figur 4c, D). I dette tilfælde var det muligt at overvåge bevægelsen af kerner over tid7.
| Navn på løsning | Komponenter | Kommentarer/beskrivelse |
| 10x injektions buffer, opløsning | I 1 L H2O add: 0,8 g NaCl, 0,09 g na2hpo4, 0,04 g KH2po4, 2,98 g KCl | Opbevares ved 4 °C. Filtrer en lille mængde umiddelbart før brug med en 1 mL sprøjte, der er udstyret med et 0,45 μm sprøjte filter. Gentag efter behov for at filtrere ca. 500 μL injektionsvæske. Opbevar den filtrerede injektionsvæske på isen i hele eksperimentets varighed. |
| HEPES Buffered saltvand | I 1 L H2O tilsættes: 8,77 g nacl, 5,2 g Hepes, | pH til 7,0 og opbevares ved 4 °C. |
| Tetramethyl Rhodamine dextran (10.000 MW) farvestof stamopløsning | Rhodamine farvestof fra termo Fisher | Dette farvestof sælges ofte som et lyofiliseret pulver. I dette tilfælde, udgør en stamopløsning på 50 mg/mL med vand. Centrifugeres ved 12.000 x g i 5 minutter for at fjerne uopløselige partikler. Supernatanten opsamles efter centrifugering, så eventuelle partikler i bunden af røret, alikvot og fryse ved-20 °C undgås. Aktie aliquoter i brug kan opbevares ved 4 °C i en til to uger. Undgå fryse optøning af aliquoter flere gange. Hvis nåle er tilstopning på grund af farve, kan farvestoffet også filtreres gennem Whatman #2 filtrerpapir. |
Tabel 1: løsnings opskrifter og-noter.
Figur 1: protokol oversigt for æginjektion. A) en typisk opsætning, der kan anvendes til æginjektioner. B) æggene er adskilt fra sand via en sigte. C) æggene holdes til injektion i små brønde ved at placere en skimmelsvamp i varm, flydende agopstået. (D) Fluorescens i nålen og i fem injicerede æg kan ses gennem fluorescerende dissekere mikroskop. E) et ikke-injiceret æg. Den forreste ende (svagt pegede; venstre) og bageste ende (mere sløve; højre) adskiller sig fra hinanden. Den region, der er mest egnet til injektion, i nærheden af den bageste ende, vises med beslaget. F) et æg to dage efter injektionen. Injektionsstedet er synligt som en let misfarvning, og en lille mængde af udvist blomme er tydelig (pil). Skala stænger = 1 mm (D); 0,5 mm (E og F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: nåle er Affaset med en mikrokværn eller en beveller. A) et eksempel på en mikrokværn med en cirkulær, roterende slibe overflade, der er fugtet med vand DRYPPENDE ro-vand (vanddrypper fra den i toppen af billedet viste sprøjte). (B) før affasning, trækkes nåle er lange og smalle. C) efter beveling til 20 ° dannes en skarp injektionsnål. Bemærk den 10 μm diameter af det indvendige lumen. (Røde skala stænger = 10 μm). D) trækkes, affasede nåle kan opbevares i en Petri skål med låg og holdes på plads ved hjælp af dentalvoks. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: injektioner kan nedsætte overlevelsesraten. (A) døde og døende æg er indlysende ved visuel inspektion. (B) over tid, vil materialet migrere til den ene side af ægget. C) sammenligning af overlevelsesrater fire til seks dage efter æglægning for forskellige betingelser, herunder: ikke-injicerede æg (n = 6 eksperimenter); æg punkteret med en 9 μm nål, men uinjiceret (n = 2 eksperimenter); æg injiceret med buffer og farvestof (n = 13 eksperimenter); æg injiceres med buffer, farvestof, og plasmid vektor (n = 2 eksperimenter); æg injiceres med buffer, farvestof, og DMSO (n = 11 eksperimenter); og æg injiceres med buffer, farvestof, og kontrol dsRNA (n = 22 eksperimenter). Den type kontrol dsRNA, der anvendes, inkluderede dsRNA mod eGFP eller dsRed. Numrene i bunden af hver bjælke note det samlede antal overlevende æg/samlede æg, der anvendes til hver betingelse. Fejllinjer repræsenterer standardfejl af middelværdien. Skala bjælke = 1 mm (A og B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: vurdering af injektion resultater. (A-B) Injektion af Enhancer af Zeste (E (z)) dsRNA ændrer det normale udtryk for UBX mRNA (vildtype vist i (A) og fører til omdannelse af antennerne (an) og munddele (MX, lb) til ben-lignende vedhæng (B). (C-D) Injektion af tidlige æg med overføres element piggybac og histone2B-egfp producerer transgene embryoner, som udtrykker gfp i alle kerner. Placeringen af kerner kan observeres 8 h efter æglægning (C) og 20 h efter æglægning (D). Forkortelser: en = antenne; MX = maxilla; Lb = labium; T1-3 = thorax ben 1 til 3; RNAi = RNA-interferens; GB = G. bimaculatus; Act = actin; H2B = Histon H2B; GFP = grønt fluorescerende protein. Skala stænger = 200 μm (A og B); 500 μm (E og F). Disse eksperimentelle resultater blev oprindeligt beskrevet andetsteds7,20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De to vigtigste udfordringer med denne teknik er de relaterede spørgsmål af optimal nål størrelse og overlevelsesevne. Selv om mindre nåle forbedre overlevelsesevne, nåle med smallere lumen har en større grad af kapillar kræfter på arbejdspladsen, hvilket gør det mere sandsynligt, at æggeblomme vil bevæge sig ind i nålen forårsager det at tilstoppe. I bedste fald kan blokeringer ryddes ved blot at injicere et andet æg eller ved at rydde nålen som beskrevet ovenfor. Man kan også forsøge at øge balancen pres på mikroinjektoren, indtil æggeblomme skubbes ud af nålen. Den anden store udfordring med denne teknik er overlevelsesevne. I vores hænder, overlevelsesrater for æg injiceres med eksperimentelle opløsninger er typisk mellem 40 og 80%. Overlevelsesrater kan være så lavt som 10% for dem, der begynder at lære denne teknik, men vil forbedre med praksis. Negative kontroller, som beskrevet ovenfor, er vigtige for forskerne til nøjagtigt at vurdere ændringer i overlevelsesraten med praksis, da indførelsen af forskellige materialer kan sænke overlevelsesraten (figur 3c).
Timingen af injektioner er en vigtig overvejelse for hver eksperimentel tilgang samt. Ældre æg er vanskeligere at injicere end yngre, og i almindelighed, overlevelsesrater er højere, når indsprøjtning yngre snarere end ældre æg. Indførelsen af nålen og injiceret materiale på senere stadier kan føre til utilsigtede anatomiske skader. Med erfaring, dog, injektion af to-til tre-dages gamle æg er muligt. Målretning den dorsale side af ægget på disse stadier hjælper med at undgå at beskadige embryonet, som første danner på den ventrale side. Målretning den bageste ende kan øge reagens adgang til de første nukleare divisioner og kimband dannelse, der forekommer i nærheden af denne ende af ægget19,21. Hvis man forsøger at manipulere genomet, med det formål at opnå enten udbredt somatisk eller kimcelle transmission af genomændringen, injektioner bør udføres før cellularisering, som starter ca 14 h efter æglægning19 . Hvis indsprøjtning dsRNA til Knockdown mRNA niveauer, tidsvinduet for injektioner bør bestemmes baseret på, hvor tidligt i udviklingen man ønsker at slå ned et gen af interesse. Mens virkningerne af RNAi sandsynligvis sidste i nogen tid, dsRNA skal indføres på forhånd af det tidspunkt, hvor man planlægger at vurdere eventuelle ændringer i fænotype. Det kan være vigtigt at holde styr på den tid, der er forløbet under injektionen, og progressionen af fosterudviklingen for at sikre, at de rette stadier af æggene injiceres. Uanset hvilket materiale der injiceres, er udviklingsmæssige forsinkelser efter injektion almindelige, selv om graden af forsinkelsen kan variere afhængigt af injektionsvæske.
Den protokol, der præsenteres her, er baseret på en række relativt dyre stykker udstyr. Det bør dog være muligt at injicere æg med succes uden brug af nogle eller endog alle disse elementer. For eksempel er der en bred vifte af mikroinjektorer på markedet, og nogle kan være billigere end den foreslåede i tabellen over materialer. Det er også muligt blot at bruge en sprøjte til at injicere en passende mængde materiale, selv om dette ville tage nogle praksis. I stedet for en dyr micromanipulator, man kunne bruge en række forskellige materialer til at holde nålen stabil og tillade en langsom, kontrolleret forskud, og en simpel plasticine design er blevet brugt af andre22. Det kan også være muligt at undgå brugen af en beveller, men i vores erfaring korrekt affasning kan gøre en enorm forskel for succesen af injektioner. Det kan være muligt at skærpe en trukket nål ved at trække spidsen af nålen i hånden på tværs af den fineste sandpapir, vurdere denne proces under et mikroskop. Uanset, skærpet nåle vil gøre injektioner lettere og forbedre overlevelsesevne.
Denne injektion teknik er fleksibel og kan bruges til en række forskellige manipulationer. Her har vi vist resultater for dsRNA og piggyBac-afhængige genommodifikations eksperimenter, men det er også muligt at bruge CRISPR/CAS eller andre tilgange med denne teknik. I forsøgene inkluderet her, resulterende fænotyper var indlysende og let at vurdere. Nogle eksperimenter kan kræve brug af Immunhistokemi eller andre visualiseringsværktøjer for at se virkningerne af eksperimentel manipulation. Et alternativ til injektioner er brugen af elektro poration, som kan anvendes til at introducere DNA eller andre makromolekyler i celler og væv in vivo. Elektro poration kan anvendes i ældre cricket æg, hvor embryoner allerede er dannet for at målrette specifikke regioner8, men injektion er mere nyttigt, når forsøget kræver, at hele udviklings embryonet er målrettet. Denne injektion teknik bør også være let kan tilpasses til brug i æg fra en række forskellige hemimetabolous og holometabolous insekter, ideelt set forbedre evnen til at foretage meningsfulde sammenlignende undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i dette projekt blev støttet af en institutionel udvikling Award (idé) fra National Institute of General Medical Sciences af de nationale institutter for sundhed under Grant nummer P20GM10342 til HH3, og af NSF Award nummer IOS-1257217 til Cge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
