Summary
Ici, nous présentons un protocole pour injecter des œufs de cricket, une technique qui sert de méthode fondamentale dans de nombreuses expériences dans le cricket, y compris, mais sans s'y limiter, l'interférence de l'ARN et la manipulation génomique.
Abstract
La modification de la fonction génique dans un organisme en développement est au cœur de différents types d'expériences. Bien que des outils génétiques extrêmement puissants aient été développés dans les systèmes modèles traditionnels, il est difficile de manipuler des gènes ou de l'ARN messager (ARNM) dans la plupart des autres organismes. Dans le même temps, les approches évolutives et comparatives reposent sur une exploration de la fonction génique chez de nombreuses espèces différentes, nécessitant le développement et l'adaptation de techniques de manipulation de l'expression en dehors de la situation actuellement génétiquement traitable. espèce. Ce protocole décrit une méthode d'injection de réactifs dans les œufs de cricket pour évaluer les effets d'une manipulation donnée sur le développement embryonnaire ou larvaire. Des instructions sur la façon de recueillir et d'injecter des œufs avec des aiguilles bevées sont décrites. Cette technique relativement simple est flexible et potentiellement adaptable à d'autres insectes. On peut recueillir et injecter des dizaines d'œufs en une seule expérience, et les taux de survie pour les injections de tampon seulement s'améliorent avec la pratique et peuvent être aussi élevés que 80%. Cette technique soutiendra plusieurs types d'approches expérimentales, y compris l'injection d'agents pharmacologiques, l'ARNm plafonné in vitro pour exprimer des gènes d'intérêt, l'ARN à double brin (dsRNA) pour obtenir des interférences d'ARN, l'utilisation de grappes régulièrement répétitions palindromic courtes interspatiales (CRISPR) de concert avec des réactifs de protéines 9 (Cas9) associés au CRISPR (Cas9) pour la modification génomique, et des éléments transposables pour générer des lignes transgéniques transitoires ou stables.
Introduction
La capacité de modifier le génome ou d'influencer l'expression des gènes dans les organismes est à la base de la conception de nombreux types d'expériences testant la causalité fonctionnelle. Il est également essentiel pour les travaux comparatifs et évolutionnaires que les techniques de modification génomique et non génomique soient disponibles dans les organismes en dehors des systèmes traditionnels de modèle animal de laboratoire génétique (par exemple, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, et Caenorhabditis elegans). Qu'il s'agisse du désir de comprendre la diversité organistique1 ou de l'adhésion au principe de Krogh, que pour chaque question biologique il existe un organisme le mieux adapté à sa solution2,3, la capacité de modifier les génomes ou l'influence de l'expression de gène est essentielle pour des conceptions expérimentales modernes.
Le cricket Gryllus bimaculatus est un système modèle émergent. Utilisé pour le siècle dernier dans les expériences de neuroéthologie4, les deux dernières décennies ont été témoins d'un intérêt expérimental accru pour le cricket, en particulier axé sur l'évolution et le développement de cet organisme5. Le cricket est un insecte hémimétabolous qui se ramifie basally à des insectes holometabolous bien étudiés, tels que D. melanogaster et Tribolium castaneum6. En raison de sa position utile sur l'arbre évolutif, les scientifiques sont intéressés à poser des questions expérimentales modernes et sophistiquées dans cet insecte, ce qui a conduit à un intérêt croissant dans l'adaptation des outils moléculaires pour l'utilisation dans G. bimaculatus.
Les injections de réactifs moléculaires dans les œufs de cricket peuvent être utilisées pour des expériences de modification génomique ainsi que des manipulations non génomiques de l'expression génique chez les embryons. Par exemple, transgénique G. bimaculatus portant des insertions eGFP ont été créés à l'aide de la transposase piggyBac7,8. Les chercheurs ont réussi à créer des nucléases knock-out G. bimaculatus à l'aide de nucléases de zinc-doigt (ZNN) et d'activateurs de transcription (TAL) nucléases effecteurs (TALENs) pour introduire des pauses à double brin dans des régions génomiques spécifiques9. Bien que les ZFN et les TALEN permettent un ciblage spécifique au site chez les animaux au-delà des quatre grands systèmes modèles, ces réactifs ont rapidement été dépassés par le système CRISPR/Cas9, qui est plus simple à utiliser, plus efficace et très flexible10. CRISPR a été utilisé dans G. bimaculatus pour produire knock-out11 ainsi que knock-in lignes12,13 En plus de la modification génomique, dsRNA peut être injecté dans les œufs pour renverser l'expression de l'ARNm en développement embryons, permettant aux chercheurs de comprendre le rôle de transcriptions spécifiques tout au long du développement14,15. Quelques détails limités sur la façon d'injecter des œufs de cricket ont été publiés précédemment12.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour injecter les oeufs tôt de G. bimaculatus. Ce protocole est efficace et facilement adaptable à divers milieux de laboratoire, matériaux d'injection, et peut-être à d'autres insectes. Bien que des détails supplémentaires pour la conception et la mise en œuvre de modifications génomiques et d'expériences de renversement ont été publiés ailleurs12,13, ces approches finiront par s'appuyer sur le protocole d'injection détaillé ici.
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Protocol
1. Configuration et préparation de matériel
REMARQUE: Veuillez consulter le tableau 1 et le tableau des matériaux pour la préparation des solutions, du réactif et des détails de l'équipement.
- Installez un microscope disséquant afin de voir les œufs et de guider l'aiguille d'injection. (La figure 1A montre un microscope disséquant équipé de fluorescence.) La capacité de fluorescence est avantageuse mais pas nécessaire.
- Placez un micromanipulateur à 3 axes pour manœuvrer l'aiguille d'injection en place (figure 1A).
- Mettre en place un micro-injecteur avec tube et un porte-aiguille pour injecter de petites quantités de matière (Figure 1A). Utiliser en option une pédale de pied qui n'est pas indiquée dans la figure.
- Concevez et créez un timbre pour créer des puits pour les œufs (Figure 1C) en imprimant l'inverse du motif désiré, soit avec une imprimante 3D ou un graveur laser.
REMARQUE: Le timbre d'échantillon imprimé en 3D est de 4,5 cm x 5 cm avec 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm de saillie pour la création de puits individuels. Détails sur la façon de faire une variété de moules personnalisables ont été publiés ailleurs16. - Préparer 10x Tampon d'injection, saline tamponnée HEPES (HBS), et une solution de stock de tetramethylrhodamine Dextran colorant et stocker à 4 oC.
- Préparer des solutions expérimentales à injecter, telles que dsRNA, CRISPR/Cas912, éléments transposables, ARNm plafonné in vitro7,8, agents pharmacologiques17, ZFNs, ou TALENS9.
- Placez du ruban adhésif à double bâton sur plusieurs couches de ruban de laboratoire standard sur une lame de microscope en verre afin de créer une plate-forme d'environ 1 mm au-dessus de la glissière en verre, qui sera utilisée pour retenir les aiguilles pour l'évaluation.
- Préparer un contenant de grillage d'environ 40 cm x 60 cm de taille avec un couvercle possédant une ouverture recouverte de maille pour la circulation de l'air.
- Ajouter de la nourriture, de l'eau et des matériaux d'hébergement.
- Ajoutez plusieurs douzaines de grillons adultes mâles et femelles en bonne santé. Identifiez le cricket adulte par la présence d'ailes.
REMARQUE: Une gamme d'âges post-imaginaires peut augmenter les rendements des œufs. La densité des grillons devrait être relativement élevée afin d'être en mesure de recueillir suffisamment d'œufs pour une expérience, mais pas si encombré que le cannibalisme se produit. Par exemple, environ deux douzaines de grillons sains, avec un rapport mâle/femelle à peu près égal, dans un contenant de la taille indiquée ci-dessus devraient être suffisants pour recueillir environ 200 œufs dans une période de un à deux h. Les grillons peuvent être maintenus à température ambiante, mais le développement et le comportement seront optimaux si les grillons sont maintenus dans un incubateur chaud (23,5 à 26 oC), humide (40 à 60 % d'humidité relative).
2. Fabrication d'aiguilles pour l'injection
- Utilisez des capillaires en verre Borosilicate avec filament (voir le tableau des matériaux pour plus de détails de taille). Préparer les aiguilles de traction le même jour, ou jusqu'à quelques jours avant que les injections soient terminées.
- Placez un verre capillaire dans le tire-laur, centrez le verre sur le filament, et serrez les boutons pour fixer le verre en place.
- Définir la température du tire-lasseur près de la température de la rampe de verre (-5 oC à 10 oC).
- Utilisez un protocole à une étape et à haute chaleur pour tirer un long cône avec une petite ouverture, mais éviter de faire fondre les extrémités fermées.
REMARQUE: Par exemple, lorsque vous utilisez le tire-micropipette détaillé dans le tableau des matériaux équipé d'un filament de boîte, utilisez les paramètres suivants pour le verre avec une température de rampe de 478 : Chaleur 478; Tirez 45; Vel 75; Del 120. Les conditions optimales pour la production d'une aiguille avec la forme indiquée dans la figure 2B doivent être déterminées empiriquement par chaque utilisateur. - Conseils d'aiguille de bevel en préparation pour les injections.
- Mouillez le plan de broyeur tournant du beveler (Figure 2A) avec de l'eau qui coule. Utilisez soit l'osmose inverse (RO) soit l'eau distillée traitée par diethylpyrocarbonate (DEPC).
- Placer l'aiguille tirée dans le beveler et tourner à un angle de 20 degrés.
- Baisser l'aiguille jusqu'à ce qu'elle touche juste le plan de meulage et le bevel pendant 2 à 3 min.
- Évaluez le bevel en plaçant l'aiguille bevée sur du ruban adhésif double qui a été collé à une lame de microscope en verre.
- Placez la glissière tenant l'aiguille sur la scène d'un microscope composé équipé d'une caméra et d'un logiciel d'acquisition d'images.
- Acquérir une image de la pointe de l'aiguille à l'aide d'un objectif 20x.
- Utilisez le logiciel d'imagerie pour mesurer le diamètre de lumen intérieur de l'aiguille juste proximale à l'ouverture beveled (Figure 2C). La taille optimale est de 10 m et 2 m.
- Jeter les aiguilles dont l'ouverture est inférieure à 8 m et au-dessus de 12 m.
- Conserver les aiguilles dans un contenant avec un couvercle pour éviter d'être poussiéreux. Utilisez une bande de cire ou un matériau similaire pour élever les aiguilles du fond du récipient afin d'éviter de briser les pointes (Figure 2D).
3. Collecte et préparation d'oeufs
- Maximisez le nombre d'œufs pondus en privant les grillons de tout matériau de ponte humide (flacons d'eau, plats d'œufs) pendant la nuit ou pendant au moins 8 à 10 h avant de tenter de ramasser les œufs.
REMARQUE: Puisque les femelles ont la capacité de stocker le sperme intérieurement, une procédure chronométrée différemment peut être nécessaire si la fertilisation soigneusement chronométrée est expérimentalement essentielle18. - Faire 40 ml d'agarose de 1 % dans l'eau et verser dans un plat de pétri de 10 cm.
- Placer un timbre d'œuf sur la surface de l'agarose avant qu'il ne se solidifie.
- Retirez le timbre, une fois l'agarose solidifié, pour révéler les puits (figure 1C).
- Remplissez la plaque de puits d'agarose avec HBS contenant 1% de pénicilline/Streptomycine.
- Placer le couvercle sur le plat, l'envelopper dans le parafilm et le conserver à 4 oC.
REMARQUE: Les plats peuvent être conservés pendant quelques jours à 4 oC, mais doivent être réchauffés à température ambiante avant d'être utilisés pour éviter la condensation. - Faire un plat de collecte d'œufs pour les grillons pour pondre les œufs en remplissant un plat de 35 mm de pétri avec du sable blanc de terrain de jeu (Figure 1B).
REMARQUE: Le sable spécifié dans le Tableau des matériaux est de la taille appropriée du grain. Si les grains de sable sont trop gros, le sable endommagera les œufs. - Couvrir le plat d'œufs d'un carré de papier essuie-tout coupé d'environ 18 cm x 18 cm, et placer sur le dessus du plat avec du sable. Grâce à cette serviette en papier couvrir le plat rempli avec de l'eau du robinet.
- Inclinez le plat de pétri et pressez doucement le dessus pour enlever l'excès d'eau.
- Placez les coins du carré de serviette en papier sous le plat et placez le plat d'oeufs dans le couvercle inversé, qui aidera à maintenir le couvercle de serviette en papier en place.
- Placer le plat d'œufs dans le bac de cricket et permettre aux femelles adultes d'oviposit oeufs pendant un à deux h.
REMARQUE: Le temps relativement court ici assure que tous les œufs seront similaires au stade de développement au moment de l'injection. Si l'injection avant la cellularisation est importante, les injections devraient se produire dans les 14 h de la ponte19. - Pendant ce temps, laisser le plat d'agarose (à partir de l'étape 3.6) réchauffer à la température ambiante en préparation pour la tenue des œufs pour l'injection.
- Retirer le plat de collecte des œufs, qui contient maintenant des œufs fraîchement pondus, du bac de cricket et retirer le couvercle de papier essuie-tout. Placer une passoire d'une taille de pores de 0,5 à 1 mm sur un bécher d'une capacité d'au moins 500 ml (figure 1B).
- Rincer le contenu du plat de pont (sable et œufs) dans la passoire sous l'eau du robinet en cours d'exécution doucement laisser les grains de sable tomber à travers le maillage de passoire dans l'eau dans le bécher ci-dessous, mais en laissant les œufs de cricket dans le panier de passoire.
- Remplissez un récipient d'eau RO et placez-le dans un plateau. Inverser la passoire sur le récipient et la taper contre le plat pour déloger les œufs dans l'eau. Les œufs s'enfonceront au fond du récipient.
- Couper la pointe d'une pointe de pipette P1000 avec des ciseaux pour faire une ouverture d'environ 3 mm de diamètre. Placez cette pointe sur un pipettor P1000 et utilisez-la pour transférer les œufs du récipient au plat de moule d'oeuf d'agarose, transférant le moins d'eau possible.
- Utilisez une pince à épiler en plastique pour aligner les œufs dans les puits d'agarose remplis de HBS plus 1% de pénicilline/streptomycine. Chaque œuf coulera au fond d'un puits individuel. Couvrir du couvercle du couvercle de la boîte à pétrijusqu'à ce qu'il soit prêt à l'injecter.
4. Préparer le micro-injecteur
- Fixez le micro-injecteur à une source d'air comprimé ou de gaz (ce protocole a été optimisé à l'aide d'air comprimé ou de N2).
REMARQUE: Si vous utilisez un réservoir d'air portatif, remplissez à au moins 75 psi. Le réservoir perdra la pression d'air tout au long des injections et peut avoir besoin d'être rempli; les injections deviennent difficiles en dessous de 40psi. - Allumez le micro-injecteur. Fixez le temps d'injection à 0,17 s et la pression à 10 à 15 psi.
REMARQUE: La pression exacte nécessaire dépendra de l'ouverture de l'aiguille et doit être déterminée empiriquement pour chaque cycle d'injection et/ou nouvelle aiguille utilisée. - Assurez-vous que le bouton BALANCE du micro-injecteur est tourné vers 0 (généralement entièrement dans le sens inverse des aiguilles d'une montre) et que le micro-injecteur est pressurisé et en mode injection.
5. Injections
- Filtrer environ 500 l de tampon d'injection 10x à l'aide d'une seringue de 1 ml et d'un filtre à seringues de 0,45 m.
- Mélanger les réactifs par injection (les détails qui suivent sont pour l'injection de dsRNA préparé comme décrit dans12).
REMARQUE: Il peut être conseillé de concevoir et d'effectuer plusieurs contrôles, surtout quand on apprend d'abord cette technique. Poking oeufs sans injection, l'injection tampon - colorant seul, ou l'injection tampon - colorant - un réactif de contrôle (comme eGFP dsRNA) sont tous de bons tests de la façon dont perturbateur divers éléments du protocole d'injection pourrait être. Voir La figure 3 pour la survie d'un certain nombre de contrôles différents. - Commencez par un dsRNA aliquot de 4 ml.
- Ajouter 0,5 ml du tampon d'injection 10x filtré à l'aliquot dsRNA.
- Ajouter 0,5 mL de 50 mg/mL de rhodathyle tétramé Thyréthyle solution de stock de colorant Dextran. Si vous travaillez sur une portée de dissection sans fluorescence, utilisez Phenol Red à la place.
- Gardez tous les matériaux sur la glace pendant toute la durée de la période d'injection.
- Chargez la solution d'injection dans une aiguille d'injection à l'aide de pointes de chargement de 20 ml et d'un tuyauterie p10.
- Élaborez une solution d'injection de 1,5 ml et insérez la pointe de chargement dans l'extrémité large de l'aiguille d'injection.
- Éjectez la solution aussi loin que possible dans l'aiguille et éliminez les bulles d'air en clignotant doucement; veillez à ne pas casser l'aiguille.
- Placez le plat d'œufs sous le microscope disséquant et sélectionnez un grossissement faible d'environ 10x (1x grossissement vu à travers les objectifs 10x oeil).
- Insérez l'aiguille dans le boîtier d'injection et serrez-la.
REMARQUE: Veillez à ce que l'aiguille soit correctement et fermement insérée dans le boîtier. Pour ce faire, tirez l'extrémité large de l'aiguille de retour de la habitation en métal, apportant le tube de silicium dans le boîtier avec elle. Ajustez le tube de silicium de sorte que l'extrémité en verre de l'aiguille dépasse juste au-delà du silicium. Si ce n'est pas fait, le tube de silicium peut être pincé entre le verre et le boîtier en métal, bloquant l'extrémité de l'aiguille. - Insérez soigneusement le boîtier d'injection avec une aiguille attachée dans le micromanipulateur. Soyez conscient de l'extrémité pointue de l'aiguille et faites attention qu'elle n'est pas heurtée dans les surfaces et cassée.
- Tout en regardant à la fois les œufs et l'aiguille à travers le microscope, déplacer l'aiguille près des œufs dans le coin supérieur gauche de la grille de plat.
- Abaissez l'aiguille jusqu'à ce que la pointe pénètre dans le HBS plus 1% Pénicilline / Streptomycine solution tamponnée dans le plat.
- Centrez l'aiguille dans le champ de vision et déplacez le plat d'œufs de sorte que l'aiguille soit quelques mm plus près du bord du plat que les œufs.
- Ne pas obstruer la vue de la grille d'œufs avec l'aiguille.
- Mettre le microscope au filtre approprié pour la rhodamine afin qu'il soit possible d'observer la fluorescence dans l'aiguille et de se concentrer sur la pointe de l'aiguille.
- Sur le micro-injecteur, tournez lentement le bouton BALANCE dans le sens des aiguilles d'une montre jusqu'à ce que la solution d'injection commence à s'échapper de l'aiguille dans la solution de suspension. Le nombre de solde sur l'écran du micro-injecteur va commencer à augmenter, bien que la valeur numérique n'est pas important. Ensuite, retournez le bouton dans le sens inverse des aiguilles d'une montre légèrement juste jusqu'à ce que le colorant cesse de fuir hors de l'aiguille.
REMARQUE: Il est essentiel de définir cet équilibre chaque fois qu'une nouvelle aiguille est utilisée. Sans l'équilibre réglé de manière appropriée, le micro-injecteur continuera à s'injecter pendant un certain temps après le déclenchement de l'injection. Il est même possible qu'une seule pression du bouton d'injection avec une aiguille déséquilibrée entraîne l'expulsion de tout le contenu de l'aiguille chargée. - Avec l'aiguille centrée dans le champ de vision, déplacer le plat d'oeufs de sorte que l'aiguille est dirigée vers l'œuf à injecter en premier. Il est recommandé que les injections commencent dans un coin de la grille d'œufs disposés, par exemple, le coin supérieur gauche.
- Ajuster le grossissement à environ 50x; à ce grossissement, un seul oeuf remplira la majeure partie du champ de vision.
- Utilisez à la fois le micromanipulateur et la main sur le plat d'œufs pour déplacer l'aiguille en position pour l'injection.
- Avancez l'aiguille à l'aide du micromanipulateur et insérez la pointe de l'aiguille dans le premier œuf à injecter.
- Insérer l'aiguille à une longueur d'œuf de 20 à 30 % à partir de l'extrémité postérieure (blunter) de l'œuf (Figure 1E), perpendiculaire à l'axe long de l'œuf.
- Injecter la solution soit avec la pédale d'injection ou le bouton d'injection sur le micro-injecteur. Un petit bolus de matière fluorescente à l'intérieur de l'œuf indiquera une injection réussie (Figure 1D).
REMARQUE: Il n'est pas rare qu'un jaune soit éjecté de l'œuf pendant l'injection (Figure 1F), ce qui n'indique pas nécessairement que l'œuf injecté sera inviable. - Retirez l'aiguille de l'œuf. Si l'œuf est soulevé involontairement hors de son puits après la rétraction de l'aiguille, utilisez de petits forceps pour pousser l'œuf dans son puits tout en rétractant l'aiguille.
- Si l'aiguille obstrue pendant l'injection, retirer l'aiguille de l'œuf et, en gardant l'aiguille immergée dans le HBS plus 1% de pénicilline/streptomycine solution couvrant les œufs, effacer l'aiguille obstruée en utilisant soit la fonction Clear ou en poussant l'injection bouton.
- En continuant d'utiliser la même aiguille, répétez la procédure d'injection pour autant d'œufs que possible. Au début, ce n'est peut-être qu'environ 20 ou 30 œufs, mais il passera à plus de 100 avec la pratique.
- Si l'aiguille est obstruée et ne peut pas être nettoyée, jetez l'aiguille, remplissez une nouvelle aiguille et recommencez (c.-à-d., retour à l'étape 5.7).
- Conserver le plat d'œufs injectés dans un incubateur chaud (23,5 à 26 oC) légèrement humide (pour minimiser l'évaporation) jusqu'à ce que les embryons aient atteint le stade de développement souhaité pour l'analyse.
- Au moins tous les 24 h, retirer les œufs qui ne sont plus viables (Figure 3A, B), et remplacer la solution de suspension par du SHB frais plus 1 % de pénicilline/streptomycine.
- Deux à trois jours après l'injection, transférez les œufs par pipetilisation douce ou avec des forceps en plastique dans des essuie-tout humidifiés avec du HBS plus 1% de pénicilline/Streptomycine dans un plat de pétri à couvercle pour continuer le développement dans l'incubateur chaud et humide.
- Surveiller les œufs et enlever les œufs qui ne sont plus viables chaque jour (Figure 3A, B).
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Representative Results
Les grillons pondent facilement des œufs dans le matériau humide, et fournir des matériaux adéquats, comme le sable humide ou la saleté, les incite à pondre un grand nombre d'œufs. Ceci est particulièrement efficace si les grillons sont d'abord privés de matériel de ponte pendant 8 à 10 h. Les œufs pondus dans du sable propre peuvent être facilement séparés, recueillis (figure 1B) et placés dans des puits d'œufs conçus sur mesure pour être injectés (Figure 1C). Un microscope disséquant, un micro-injecteur et un micromanipulateur (Figure 1A) peuvent être utilisés pour injecter des œufs individuels avec une variété de matériaux (Figure 1D). Les œufs sont injectés près de l'extrémité postérieure, à un point d'environ 20 à 30 % le long de l'axe antérieur-postérieur (figure1E). Il peut être difficile de distinguer l'extrémité antérieure plus pointue de l'extrémité postérieure plus émoussée, car ces différences sont souvent subtiles (Figure 1E). Rouler un œuf d'un côté à l'autre aide souvent à révéler quelle extrémité est qui. Après l'enlèvement de l'aiguille d'injection, le jaune d'œuf est parfois éjecté (Figure 1F), bien que cela ne semble pas compromettre la santé de l'embryon en développement à l'intérieur.
L'une des étapes les plus critiques de ce protocole est la préparation d'aiguilles vétusées. Après avoir tiré de longues aiguilles minces, elles doivent être vélées à un angle de 20 degrés et avoir un diamètre d'ouverture de 10 m (2 m). Si le diamètre est trop grand, la solution d'injection s'échappera de l'aiguille, et ces aiguilles créeront de grands trous dans les œufs, diminuant ainsi les taux de survie. Les aiguilles plus étroites augmentent la survie, mais si elles sont trop étroites, elles ont tendance à s'obstruer facilement, ce qui rend les injections lentes et frustrantes. D'un diamètre d'aiguille de 10 m et 2 m, il est possible d'injecter plus de 100 œufs avec une seule aiguille sans avoir l'engorgement de l'aiguille.
Les aiguilles peuvent être vétusées à l'''égard d'un micro broyeur ou d'un beveller (figure 2A). Ces pièces d'équipement peuvent être obtenues avec un microscope attaché, ou on pourrait ajouter une portée de dissection sur un support indépendant pour les modèles qui n'incluent pas le microscope. Un petit micromanipulateur tient l'aiguille, qui peut être inclinée à l'angle désiré et abaissée à la surface d'un plan de broyage rotatif, qui est humidifié avec de l'eau qui coule. Un exemple d'aiguille tirée, mais non beveled peut être vu dans la figure 2B, et une aiguille avec un bevel de 20 degrés est montrée dans la figure 2C. Les aiguilles doivent ensuite être entreposées en toute sécurité pour éviter les dommages et être propres (Figure 2D).
L'établissement de l'équilibre et de la pression d'injection de façon appropriée sur le micro-injecteur devrait permettre d'injecter une quantité comparable de matière dans chaque œuf injecté avec la même aiguille. L'optimisation des pressions d'injection et d'équilibre sera nécessaire lors du passage à une aiguille d'un diamètre différent. Cette optimisation maximisera la consistance des impulsions d'injection.
Le taux de survie est un paramètre important pour évaluer le succès de ces expériences. La plupart des œufs morts peuvent facilement être identifiés par la vue comme suit : le jaune et le tissu embryonnaire dans l'œuf commencent à s'agglutiner de façon inégale (Figure 3A) et finalement la plupart du jaune migrera vers un côté de l'œuf (Figure 3B). Lorsqu'ils ont été évalués après 4 à 6 jours (équivalent aux stades 8 à 15)19,plus de 85 % des œufs non injectés ont survécu tandis que les œufs injectés avec des réactifs expérimentaux avaient généralement un taux de survie plus faible (figure3C). Le contrôle de tous les aspects de l'injection elle-même, y compris la perforation de l'aiguille, l'introduction de colorant et de tampon, ou la présence d'un véhicule ou d'un ARN, est nécessaire afin de comprendre les véritables effets de la manipulation expérimentale tentée (Figure 3C). Selon la manipulation expérimentale, on peut s'attendre à un niveau plus élevé de létalité, et il peut être nécessaire de modifier le moment de l'examen ou le moment de l'injection afin d'évaluer les effets non létaux de la manipulation.
La façon dont on évalue les résultats phénotypiques de l'injection dépend de ce qui a été injecté. Par exemple, les changements phénotypiques à la suite de knockdowns spécifiques d'ARNm peuvent être évidents au niveau d'anatomie brute. Par exemple, le gène Enhancer of zeste (E(z)) supprime normalement les gènes Hox, y compris Ultrabithorax (Ubx). L'injection de dsRNA pour E(z) fait tomber la fonction E(z) et libère la suppression d'Ubx, résultant en l'expression ectopique d'Ubx. Cela conduit à la transformation de cinq paires d'appendices ventrales (antenne, maxillaire, labium, T1 et T2 jambe) en appendices T3 jambe-like, en raison de la dérépression de ubx dans ces segments20. Dans un deuxième exemple, il est possible d'utiliser l'expression GFP pour essayer l'insertion réussie d'un transgène. Par exemple, lorsqu'un cDNA codant un gène Histone 2B étiqueté eGFP sous le contrôle d'un promoteur de G. bimaculatus Actin a été inséré dans le génome du cricket à l'aide de la transposase piggyBac, il est devenu possible de visualiser chaque noyau dans l'œuf à l'aide de la fluorescence pour exciter la protéine His2B étiquetée eGFP (Figure 4C, D). Dans ce cas, il a été possible de surveiller le mouvement des noyaux au fil du temps7.
| Nom de la solution | Composants | Commentaires/Description |
| Solution tampon d'injection 10x | En 1 L H2O ajouter: 0.8 g NaCl, 0.09 g Na2HPO4, 0.04 g KH2PO4, 2.98 g KCl | Stock de stockage à 4 oC. Filtrer une petite quantité immédiatement avant utilisation avec une seringue de 1 ml équipée d'un filtre à seringues de 0,45 m. Répétez au besoin pour filtrer environ 500 l de solution d'injection. Gardez la solution d'injection filtrée sur la glace pendant toute la durée de l'expérience. |
| HEPES saline tamponnée | En 1 L H2O, ajouter : 8,77 g NaCl, 5,2 g HEPES, | pH à 7,0 et conserver à 4 oC. |
| Tetramethyl Rhodamine Dextran (10 000 MW) solution de stock de teinture | Teinture rhodamine de Thermofisher | Ce colorant est souvent vendu comme poudre lyophilisée. Dans ce cas, faire une solution de stock de 50 mg/mL avec de l'eau. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 5 min pour éliminer les particules insolubles. Recueillir le supernatant après centrifugation, en évitant toute matière particulaire au fond du tube, aliquot et congeler à -20 oC. Les aliquots en stock en usage peuvent être conservés à 4 oC pendant une à deux semaines. Évitez de geler les aliquots plusieurs fois. Si les aiguilles obstruent en raison de la teinture, le colorant peut également être filtré par Whatman #2 papier filtre. |
Tableau 1 : Recettes et notes de solution.
Figure 1 : Aperçu du protocole d'injection d'œufs. (A) Une configuration typique qui peut être utilisée pour les injections d'ovules. (B) Les œufs sont séparés du sable par un tamis. (C) Les œufs sont maintenus pour injection dans de petits puits fabriqués en plaçant un moule dans l'agarose chaude et liquide. (D) La fluorescence dans l'aiguille et dans cinq œufs injectés peut être vu à travers le microscope fluorescent de dissection. (E) Un œuf non injecté. L'extrémité antérieure (légèrement pointue; gauche) et l'extrémité postérieure (plus émoussée ; droite) se distinguent les unes des autres. La région la plus adaptée à l'injection, près de l'extrémité postérieure, est montrée avec le support. (F) Un œuf deux jours après l'injection. Le site d'injection est visible comme une légère décoloration, et une petite quantité de jaune expulsé est évidente (flèche). Barres d'échelle de 1 mm (D); 0,5 mm (E et F). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les aiguilles sont vétusées à l'aide d'un micro broyeur ou d'un beveller. (A) Exemple d'un micro broyeur avec une surface de broyage circulaire et tournante humidifiée par l'eau coulante RO (gouttes d'eau de la seringue montrée dans le haut de l'image). (B) Avant le beveling, les aiguilles tirées sont longues et étroites. (C) Après le beveling à 20 degrés, une aiguille d'injection forte est créée. Notez les 10 m de diamètre du lumen intérieur. (Barres d'échelle rouge de 10 m). (D) Les aiguilles tirées et bevées peuvent être stockées dans un plat Petri avec un couvercle et maintenues en place à l'aide de cire dentaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Les injections peuvent diminuer le taux de survie. (A) Les œufs morts et mourants sont évidents lors de l'inspection visuelle. (B) Au fil du temps, le matériau migrera vers un côté de l'œuf. (C) Comparaison des taux de survie quatre à six jours après la ponte pour une variété de conditions, y compris : les œufs non injectés (n et 6 expériences); oeufs perforés avec une aiguille de 9 m mais non injectés (n et 2 expériences); oeufs injectés avec tampon et colorant (n 13 expériences); les œufs injectés avec un tampon, de la teinture et un vecteur plasmide (n et 2 expériences); les œufs injectés avec tampon, colorant et DMSO (n 11 expériences); et les œufs injectés avec tampon, colorant et contrôledrna (n ' 22 expériences). Le type de dsRNA de commande utilisé a inclus dsRNA contre eGFP ou dsRed. Les nombres à la base de chaque barre notent le nombre total d'œufs survivants / oeufs totaux utilisés pour chaque condition. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. Barre d'échelle de 1 mm (A et B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Évaluer les résultats de l'injection. (A-B) L'injection de L'Améliorateur de Zeste (E(z)) dsRNA modifie l'expression normale de l'ARNm Ubx (type sauvage montré dans (A) et conduit à la transformation des antennes (AN) et des parties buccales (Mx, Lb) en appendices en forme de jambe (B). (C-D) L'injection d'œufs précoces avec l'élément transposable piggyBac et histone2B-eGFP produit des embryons transgéniques exprimant le GFP dans tous les noyaux. L'emplacement des noyaux peut être observé 8 h après la ponte (C) et 20 h après la ponte (D). Abréviations: Un Antenna; Mx et maxillaire; Lb et labium; T1-3 - jambes thoraciques 1 à 3; L'ARNi et l'interférence de l'ARN; Gb et G. bimaculatus; Acte et actine; H2B et Histone H2B; GFP - protéine fluorescente verte. Barres d'échelle de 200 m (A et B); 500 m (E et F). Ces résultats expérimentaux ont été décrits à l'origine ailleurs7,20. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les deux principaux défis de cette technique sont les questions connexes de taille optimale des aiguilles et de la survie. Bien que les aiguilles plus petites améliorent la survie, les aiguilles avec des lumens plus étroits ont un plus grand degré de forces capillaires à l'œuvre, ce qui rend plus probable que le jaune se déplacera dans l'aiguille provoquant son obstruement. Dans le meilleur des cas, les blocages peuvent être éliminés simplement en injectant un autre œuf ou en dégageant l'aiguille comme décrit ci-dessus. On peut également essayer d'augmenter la pression d'équilibre sur le micro-injecteur jusqu'à ce que le jaune soit poussé hors de l'aiguille. L'autre grand défi avec cette technique est la survie. Dans nos mains, les taux de survie des œufs injectés avec des solutions expérimentales se sirent généralement entre 40 et 80 %. Les taux de survie peuvent être aussi bas que 10% pour ceux qui commencent à apprendre cette technique, mais s'améliorera avec la pratique. Les contrôles négatifs, comme décrit ci-dessus, sont importants pour les chercheurs afin d'évaluer avec précision les changements dans le taux de survie avec la pratique, étant donné que l'introduction de divers matériaux peut réduire les taux de survie (figure 3C).
Le moment des injections est également une considération importante pour chaque approche expérimentale. Les œufs plus âgés sont plus difficiles à injecter que les plus jeunes et, en général, les taux de survie sont plus élevés lorsqu'on injecte des œufs plus jeunes que plus âgés. L'introduction de l'aiguille et du matériel injecté à des stades ultérieurs peut entraîner des dommages anatomiques involontaires. Avec l'expérience, cependant, l'injection d'oeufs de deux à trois jours est possible. Cibler le côté dorsal de l'œuf à ces stades aide à éviter d'endommager l'embryon, qui se forme d'abord sur le côté ventral. Cibler l'extrémité postérieure peut augmenter l'accès de réactif aux premières divisions nucléaires et à la formation de bande de germe, qui se produisent près de cette extrémité de l'oeuf19,21. Si l'on tente de manipuler le génome, dans le but d'atteindre la transmission somatique ou germinale généralisée de la modification du génome, les injections doivent être effectuées avant la cellularisation, qui commence environ 14 h après la ponte19 . Si l'injection de dsARN à renverser les niveaux d'ARNm, la fenêtre de temps pour les injections doit être déterminée en fonction de la façon dont tôt dans le développement on souhaite faire tomber un gène d'intérêt. Bien que les effets de l'ARNi durent probablement un certain temps, l'ARNd doit être introduit à l'avance du moment où l'on prévoit d'évaluer tout changement dans le phénotype. Il peut être important de suivre le temps écoulé pendant l'injection et la progression du développement embryonnaire pour s'assurer que les œufs de stade appropriés sont injectés. Quel que soit le matériau injecté, les retards de développement après l'injection sont fréquents, bien que le degré de retard puisse varier selon l'injecteur.
Le protocole présenté ici repose sur un certain nombre de pièces d'équipement relativement coûteuses. Il devrait être possible, cependant, d'injecter des œufs avec succès sans l'utilisation de certains ou même tous ces éléments. Par exemple, il existe une variété de micro-injecteurs sur le marché, et certains peuvent être moins chers que celui suggéré dans le Tableau des matériaux. Il est également possible d'utiliser simplement une seringue pour injecter une quantité appropriée de matériel, bien que cela prendrait une certaine pratique. Au lieu d'un micromanipulateur coûteux, on pourrait employer une série de matériaux pour maintenir l'aiguille stable et permettre une avance lente et commandée, et une conception simple de plasticine a été employée par d'autres22. Il peut également être possible d'éviter l'utilisation d'un beveller, bien que dans notre expérience beveling approprié peut faire une énorme différence au succès des injections. Il peut être possible d'aiguiser une aiguille tirée en faisant glisser le bout de l'aiguille à la main sur le papier de sable le plus fin, en évaluant ce processus au microscope. Quoi qu'il en soit, les aiguilles aiguisées faciliteront les injections et amélioreront la survie.
Cette technique d'injection est flexible et peut être utilisée pour une variété de manipulations différentes. Ici, nous avons montré des résultats pour dsRNA et piggyBac-dépendant des expériences de modification génomique, mais il est également possible d'utiliser CRISPR/Cas ou d'autres approches avec cette technique. Dans les expériences incluses ici, les phénotypes qui en ont résulté étaient évidents et faciles à évaluer. Certaines expériences peuvent nécessiter l'utilisation d'immunohistochimie ou d'autres outils de visualisation afin de voir les effets de la manipulation expérimentale. Une alternative aux injections est l'utilisation de l'électroporation, qui peut être utilisée pour introduire de l'ADN ou d'autres macromolécules dans les cellules et les tissus in vivo. L'électroporation peut être utilisée dans les œufs de cricket plus anciens où des embryons se sont déjà formés afin de cibler des régions spécifiques8, mais l'injection est plus utile lorsque l'expérience exige que l'embryon en développement entier est ciblé. Cette technique d'injection devrait également être facilement adaptable pour une utilisation dans les œufs d'une variété de différents insectes hémimétabolous et holométabolous, améliorant idéalement la capacité d'entreprendre des études comparatives significatives.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les recherches rapportées dans le cadre de ce projet ont été soutenues par un prix de développement institutionnel (IDeA) de l'Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de subvention P20GM10342 à HH3, et par le numéro de prix de la NSF IOS-1257217 Cge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
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