Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול להזריק ביצי קריקט, טכניקה המשמשת כשיטה היסוד בניסויים רבים בקריקט, כולל, אך לא מוגבל, הפרעה RNA ומניפולציה גנומית.
Abstract
שינוי תפקוד הגנים באורגניזם מתפתח הוא מרכזי סוגים שונים של ניסויים. בעוד כלים גנטיים מאוד חזק פותחו במערכות מודל מסורתיות, קשה לתמרן גנים או שליח RNA (mRNA) ברוב האורגניזמים האחרים. במקביל, גישות אבולוציונית והשוואתית להסתמך על חקר של תפקוד גנטי במינים שונים רבים, המחייב פיתוח והסתגלות של טכניקות לתמרן הבעה מחוץ כרגע מעוקב גנטי ינים. פרוטוקול זה מתאר שיטה להזרקת ריאגנטים לתוך ביצי קריקט כדי לעבד את ההשפעות של מניפולציה נתונה על התפתחות עובריים או זחל. הוראות כיצד לאסוף ולהזריק ביצים עם מחטים משופע מתוארים. הטכניקה הפשוטה יחסית היא גמישה ועשויה להיות מתכווננת לחרקים אחרים. אפשר לאסוף ולהזריק עשרות ביצים בניסוי אחד, ושיעורי ההישרדות לזריקות מאגר בלבד לשפר עם התרגול יכול להיות גבוה כמו 80%. טכניקה זו תתמוך מספר סוגים של גישות ניסיוני כולל הזרקה של סוכני תרופתי, ב-mRNA מתורבת לבטא גנים של עניין, כפול תקוע RNA (dsRNA) כדי להשיג הפרעות RNA, השימוש באשכולות באופן סדיר במרווחים קצר palindromic חוזר (CRISPR) בקונצרט עם CRISPR הקשורים חלבון 9 (Cas9) ריאגנטים עבור שינוי גנומית, ורכיבים טרנספראבל כדי ליצור קווי טרנסגניים ארעי או יציב.
Introduction
היכולת לשנות את הגנום או השפעה הביטוי הגן באורגניזמים הוא הבסיס לעיצוב של סוגים רבים של ניסויים בדיקת סיבתיות תפקודית. הוא גם קריטי לעבודה השוואתית ואבולוציונית הרלוונטית שטכניקות שינוי גנומית ושאינן גנוגנות יהיו זמינות באורגניזמים מחוץ למערכות מודל גנטיות מסורתיות בעלי חיים מעבדה (למשל, Mus מוסקולוס, דניו ראריו, דרוזופילה מלאנוגסטר, ואלבורחבאבדיטיס. בין אם מדובר ברצון להבין את הגיוון האורגאיאלי1 או את הדבקות בעיקרון של krogh, כי עבור כל שאלה ביולוגית יש אורגניזם המתאים ביותר לפתרון2,3, היכולת לשנות גנום או השפיע על ביטוי הגנים חיוני לעיצובים ניסיוניים מודרניים.
הצרצר הקריקט הוא מערכת מודל המתעוררים. במהלך המאה האחרונה בניסויים נוירואתולוגיה4, שני העשורים האחרונים היו עדים לעניין ניסיוני מוגבר בקריקט, התמקד בעיקר באבולוציה ובהתפתחות של האורגניזם הזה5. הצרצר הוא חרק מיני המסתעף בholometabolous לחרקים בעלי לימודים היטב, כגון ד. מלאנוגסטר וטריבוליום6. בשל עמדתה השימושית על העץ האבולוציוני, מדענים מעוניינים לשאול שאלות נסיוניות מודרניות ומתוחכמות בחרק זה, אשר הוביל לעניין הולך וגובר בהתאמת כלים מולקולריים לשימוש ב -G. בימרו.
זריקות של ריאגנטים מולקולרי לתוך ביצי קריקט יכול לשמש ניסויים שינוי גנומית, כמו גם מניפולציות שאינן גנומית של הביטוי גנים העוברים. לדוגמה, הטרנסגניים G. בימרו על נושאים הוספות egfp נוצרו באמצעות הטרנספססה 7,8. החוקרים יצרו בהצלחה את הנוקאאוט G. בימרו שימוש בנוקלאוסים לאצבעות אבץ (ZFNs) ותמלול activator-כמו (טל) (talens) כדי להחדיר כפול תקוע הפסקות באזורים גנומית ספציפיים9. למרות ZFNs ו TALENs לאפשר פילוח ספציפי לאתר בעלי חיים מעבר מערכות ארבע מודל גדול, אלה ריאגנטים במהירות העלתה על ידי CRISPR/Cas9 system, אשר פשוט לשימוש, יעיל יותר, וגמיש מאוד10. Crispr שימש ב -G. בימרו כדי לייצר נוק אאוט11 , כמו גם להקיש על קווים12,13 בנוסף שינוי גנומית, dsrna ניתן להזריק ביצים כדי להפיל ביטוי mrna בפיתוח עוברים, המאפשרים לחוקרים להבין את התפקיד של תעתיקים ספציפיים במהלך פיתוח14,15. כמה פרטים מוגבלים על איך להזריק ביצי קריקט פורסמו בעבר12.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להזרקת ביצים מוקדמות. פרוטוקול זה יעיל וניתן בקלות להתאמה להגדרות מעבדה שונות, חומרי הזרקה, ואולי חרקים אחרים. בעוד פרטים נוספים עבור עיצוב ויישום של שינוי גנומית וניסויים בהוצאת מפורסמים פורסמו במקומות אחרים12,13, גישות אלה בסופו של דבר להסתמך על פרוטוקול ההזרקה מפורט כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקנת חומרה והכנת חומרים
הערה: נא לעיין בטבלה 1 ובטבלת חומרים להכנת פתרונות, מגיב ופרטי ציוד.
- הגדר מיקרוסקופ מבתר כדי לראות ביצים ולהנחות את מחט ההזרקה. (איור 1A מראה מיקרוסקופ מבתר המצויד בזריחה). יכולת הקרינה הפלואורסצנטית היא יתרון אבל לא הכרחי.
- הצב מיקרומטר בן 3 צירים כדי לתמרן את מחט ההזרקה למקומה (איור 1A).
- הגדר מיקרומזרק עם אבובים ומחזיק מחט כדי להזריק כמויות קטנות של חומר (איור 1A). ניתן להשתמש בדוושה לרגל שאינה מוצגת באיור.
- לעצב וליצור חותמת כדי ליצור בארות עבור ביצים (איור 1C) על-ידי הדפסת ההופכי של התבנית הרצויה, עם מדפסת תלת-ממדית או חרט לייזר.
הערה: החותמת לדוגמה תלת-ממדית המוצגת היא 4.5 ס"מ x 5 ס"מ עם 128, 3 ס"מ x 1 ס"מ x 1 בליטות ליצירת בארות בודדות. פרטים על אופן הפיכת מגוון תבניות להתאמה אישית פורסמו במקום אחר16. - הכנת מאגר הזרקת 10x, מתמיסת מלח באגירה (HBS), ופתרון מניות של צבע הטטרמתירומדאן דקטרן וחנות ב -4 ° c.
- להכין פתרונות ניסיוניים להיות מוזרק, כגון dsrna, crispr/Cas912, מרכיבי טרנספלבל, ב מבחנה מחוץ לתחום7,8, סוכנים פרמקולוגיים17, zfns, או talens9.
- מניחים קלטת כפולה על מספר שכבות של קלטת מעבדה סטנדרטית על שקופית מיקרוסקופ זכוכית על מנת ליצור פלטפורמה 1 מ"מ או כך מעל שקופית הזכוכית, אשר ישמש להחזקת מחטים להערכה.
- הכן מיכל קריקט כ 40 ס מ x 60 ס"מ בגודל עם מכסה בעל פתח מכוסה רשת עבור זרימת האוויר.
- מוסיפים חומרים למזון, מים ומחסה.
- להוסיף כמה עשרות צרצרים בריאים זכר ונקבה בוגרים. זהה קריקט למבוגרים על ידי נוכחות של כנפיים.
הערה: מגוון של הגילאים שלאחר imaginal להגביר את תשואות הביצית. צפיפות הצרצרים צריכה להיות גבוהה יחסית כדי להיות מסוגלת לאסוף מספיק ביצים לניסוי, אבל לא כל כך צפוף שקניבליזם מתרחש. לדוגמה, כשני תריסרים של צרצרים בריאים, עם זכר שווה בערך ליחס נשי, במיכל של הגודל המצוין לעיל צריך להיות מספיק כדי לאסוף על 200 ביצים אחת עד שתיים בתקופה. ניתן לשמור על צרצרים בטמפרטורת החדר, אבל הפיתוח וההתנהגות יהיו מיטביים אם הצרצרים יישמרו בחום (23.5-26 ° c), לחות (40-60%) מאינקובטור.
2. הכנת מחטים להזרקה
- השתמש בנימים זכוכית בורוסיליקט עם פילמנט (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטי הגודל). הכן את מחטי המשיכה באותו יום, או עד מספר ימים לפני השלמת הזריקות.
- מניחים זכוכית קפילר בתוך השמשה, מרכז את הזכוכית על החוט, ומהדקים את הידיות כדי לאבטח את הזכוכית במקומה.
- הגדר את טמפרטורת הפולר ליד שיפוע הזכוכית (-5 ° צ' עד 10 ° c).
- להשתמש בצעד אחד, החום גבוהה פרוטוקול למשוך להתחדד ארוך עם פתח קטן, אבל להימנע התכה את הקצוות סגורים.
הערה: לדוגמה, בעת שימוש בפולר המיקרופיפטה המפורט בטבלת החומרים המצוידים בפילמנט, השתמשו בפרמטרים הבאים לזכוכית עם טמפרטורת כבש של 478: חום 478; משוך 45; וול 75; . דל 120 תנאים אופטימליים להפקת מחט עם הצורה המוצגת באיור 2B יש לקבוע מדעית על ידי כל משתמש. - משופע טיפים מחט לקראת הזריקות.
- הרטב את המישור המסתובב מטחנת הבשר (איור 2 א) במים נוטפים. השתמש או אוסמוזה הפוכה (RO) או diethylpyrocarbonate (DEPC) מטופלים מים מזוקקים.
- מניחים את המחט משכה לתוך הבילר ולהפוך זווית 20 °.
- הנמך את המחט עד שהוא רק נוגע המישור שיוף משופע עבור 2 כדי 3 דקות.
- העריכו את השיקוע על ידי הצבת המחט משופע על קלטת פעמיים מקל כי כבר דבקה לשקופית זכוכית מיקרוסקופ.
- מניחים את השקופית מחזיקה את המחט על הבמה של מיקרוסקופ מורכב מצויד במצלמה ותוכנה לרכישת תמונה.
- לרכוש תמונה של תיאור המחט באמצעות מטרה 20x.
- השתמש בתוכנת הדמיה כדי למדוד את קוטר לומן הפנים של המחט רק האבויה לפתיחה משופע (איור 2C). הגודל האופטימלי הוא 10 יקרומטר + 2 יקרומטר.
- להשליך מחטים כי יש פתיחה מתחת 8 יקרומטר ומעלה 12 יקרומטר.
- לאחסן את המחטים במיכל עם מכסה כדי למנוע מקבל מאובק. השתמש רצועה של שעווה או חומר דומה כדי להעלות את המחטים מהחלק התחתון של המיכל כדי למנוע שבירת הטיפים (איור 2D).
3. אוסף ביצים והכנה
- למקסם את מספר הביצים הונחו על ידי שלילת הצרצרים של כל חומר הנחת לח (מבחנות מים, מנות ביצה) לילה או לפחות 8-10 h לפני ניסיון לאסוף ביצים.
הערה: מאז הנשים יש את היכולת לאחסן באופן פנימי זרע, הליך בעיתוי שונה עשוי להיות הכרחי אם הפריה מתוזמן בקפידה הוא ניסויים חיוניים18. - הפוך 40 mL של 1% agarose במים ויוצקים לצלחת בגודל 10 ס מ.
- הניחו חותמת ביצה על פני השטח של הצמח לפני שהוא מתגבש.
- הסר את החותמת, ברגע שהצמח מתחזק, כדי לחשוף את הבארות (איור 1C).
- מלאו את הצלחת הטובה ביותר עם HBS המכיל 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
- מניחים את המכסה על המנה, עוטפים בפראפilm ומאחסנים ב -4 ° c.
הערה: ניתן לאחסן מנות במשך מספר ימים ב -4 ° c, אך יש לחמם את טמפרטורת החדר לפני השימוש כדי להימנע מעיבוי. - להכין צלחת אוסף ביצים עבור צרצרים להטיל ביצים על ידי מילוי צלחת פטרי 35 מ"מ עם חול לבן מגרש משחקים (איור 1B).
הערה: החול המצוין בטבלת החומרים הוא בגודל הדגן המתאים. , אם גרגרי החול גדולים מדי. החול יפגע בביצים - מכסים את הצלחת ביצה עם ריבוע של נייר מגבת לחתוך להיות כ 18 ס"מ x 18 ס"מ, ומניחים על החלק העליון של התבשיל עם חול. באמצעות מגבת נייר זו מכסים את המנה המלאה עם מי ברז.
- להטות את צלחת פטרי ולסחוט בעדינות את החלק העליון כדי להסיר את המים העודפים.
- לקפל את הפינות של ריבוע מגבת נייר מתחת לצלחת ומניחים את הצלחת ביצה במכסה הפוך, אשר יסייעו לשמור על מגבת נייר לכסות במקום.
- מניחים את הצלחת ביצה לתוך סל הקריקט ולאפשר לנקבות מבוגרים כדי ההטלה ביצים עבור אחד עד שניים h.
הערה: הזמן הקצר יחסית כאן מבטיח שכל הביצים יהיו דומות בשלב ההתפתחות בזמן ההזרקה. אם הזרקה לפני צלוליטיס חשוב, זריקות צריך להתרחש בתוך 14 h של ביצה הנחת19. - בינתיים, לאפשר את הצלחת agarose (משלב 3.6) כדי לחמם את טמפרטורת החדר כהכנה להחזקת ביצים להזרקה.
- להסיר את הצלחת אוסף הביצים, עכשיו מכיל ביצים הניח טרי, מן הצרצר, ולהסיר את המכסה מגבת נייר. מניחים מסננת עם גודל נקבובית של 0.5 – 1 מ"מ מעל גביע של לפחות 500 mL קיבולת (איור 1B).
- לשטוף את התוכן של הצלחת הטלת ביצה (חול וביצים) לתוך מסננת תחת ריצה בעדינות מים ברז לתת דגנים חול ליפול דרך רשת מסננת לתוך המים בגביע למטה אבל עוזב את ביצי קריקט בסל מסננת.
- ממלאים מכולה עם מים RO ומניחים אותו במגש. היפוך מסננת מעל המיכל ולהקיש אותו נגד הצלחת להוציא את הביצים לתוך המים. . הביצים ישקעו לתחתית המיכל
- חותכים את הקצה מקצה P1000 פיפטה עם מספריים כדי ליצור פתח בקוטר של 3 מ"מ בקירוב. מניחים את הקצה על P1000 פיאור ומשתמשים בו כדי להעביר את הביצים מהמכולה לצלחת העובש המועלה, העברת מים קטנים ככל האפשר.
- השימוש מלקחיים פלסטיק כדי לסדר את הביצים בארות agarose מלא עם HBS פלוס 1% פניצילין/סטרפטומיצין. כל ביצה ישקע לתחתית הבאר האישית. כיסוי עם מכסה צלחת פטרי עד מוכן להזריק.
4. הכן את המיקרומזרק
- הצמד את המיקרו מזרק לאוויר דחוס או מקור גז (פרוטוקול זה היה מיטבי באמצעות אוויר דחוס או N2).
הערה: אם משתמשים במיכל אוויר נייד, מלאו לפחות 75 psi. הטנק יאבד את הלחץ האווירי לאורך הזריקות וייתכן שיהיה צורך ממולא; זריקות להיות קשה מתחת 40psi. - . תדליק את המיקרומזרק הגדר את זמן ההזרקה 0.17 s ואת הלחץ על 10-15 psi.
הערה: הלחץ המדויק הדרוש יהיה תלוי בפתיחת המחט ויש לקבוע מדעית עבור כל סיבוב של זריקה ו/או מחט חדשה בשימוש. - ודא כי כפתור איזון של המיקרו מזרק מפנה 0 (בדרך כלל לחלוטין נגד כיוון השעון) וכי מיקרו מזרק הוא בלחץ ובמצב הזרקה.
5. זריקות
- מסנן על 500 μl של מאגר הזרקת 10x באמצעות מזרק 1 mL ומסנן מזרק 0.45 יקרומטר.
- מערבבים הזרקה ריאגנטים (הפרטים המפורטים להלן עבור ההזרקה של dsRNA הכין כמתואר12).
הערה: ייתכן שיהיה מומלץ לעצב ולבצע מספר פקדים, במיוחד כאשר אדם לומד תחילה טכניקה זו. לדקור ביצים ללא הזרקה, הזרקת מאגר + צבע בלבד, או הזרקת מאגר + צבע + שליטה מגיב (כגון eGFP dsRNA) הם כל בדיקות טובות של איך משבש רכיבים שונים של פרוטוקול ההזרקה עשוי להיות. ראה איור 3 עבור ההישרדות של מספר פקדים שונים. - התחל באמצעות 4 מ"ל dsRNA.
- הוסף 0.5 mL של מאגר הזרקת 10x המסונן ל-dsRNA aliquot.
- הוסף 0.5 mL של 50 mg/mL הטטרמתיל מלאי הצבע דקטרן הפתרון. אם עובדים על היקף מבתר ללא הזריחה, השתמשו באדום פנול.
- לשמור את כל החומרים על הקרח למשך תקופת ההזרקה.
- טען את פתרון ההזרקה לתוך מחט הזרקה באמצעות 20 מ"ל טעינת טיפים ו p10 pipet.
- לצייר את הפתרון הזרקת 1.5 mL ולהכניס את קצה הטעינה לתוך הקצה הרחב של המחט הזריקה.
- הוצא פתרון עד למטה לתוך המחט ככל האפשר ולחסל בועות אוויר על ידי מצליף בעדינות; להיזהר לא לשבור את המחט.
- הניחו את קערת הביצים תחת מיקרוסקופ מבתר ובחרו הגדלה נמוכה של כ-10x (הגדלת 1x שהוצגה באמצעות יעדי עיניים 10x).
- הכניסו את המחט לתוך מגורי ההזרקה והדקו.
הערה: שמור על המחט מוכנס היטב ובחוזקה לתוך הדיור. כדי לעשות זאת, למשוך את הקצה הרחב של המחט בחזרה מתוך הדיור מתכת, להביא את אבובים סיליקון בדיור עם זה. כוונן את צינורות הסיליקון כך שקצה הזכוכית של המחט בולט רק מעבר לסיליקון. אם זה לא נעשה, אבובים סיליקון עלול לקבל צבט בין הזכוכית הדיור מתכת, חסימת סוף המחט. - הכנס בזהירות את מגורי ההזרקה עם מחט מוצמדת לתוך המיקרומניפולציה. שים לב לקצה החד של המחט והיזהר שהוא לא נתקל במשטחים ושבורים.
- בזמן התבוננות הן את הביצים ואת המחט דרך המיקרוסקופ, להזיז את המחט ליד הביצים בפינה השמאלית העליונה של רשת הכלים.
- הנמך את המחט עד שהקצה נכנס ל-HBS בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין פתרון באגירה במנה.
- מרכז את המחט בתחום הראייה ולהעביר את הצלחת ביצה כך המחט היא כמה מ"מ קרוב יותר לקצה של התבשיל מאשר הביצים.
- אל לחסום את ההשקפה של רשת של ביצים עם המחט.
- הגדר את המיקרוסקופ למסנן המתאים לרומדיין כך שניתן להתבונן בקרינה הפלואורסצנטית ולהתמקד בקצה המחט.
- על מיקרומזרק, לאט להפוך את הידית איזון בכיוון השעון עד הפתרון ההזרקה מתחיל לדלוף מתוך המחט לתוך הפתרון ההשעיה. מספר המאזן על המסך של המיקרו מזרק יתחיל לגדול, אם כי הערך המספרי אינו חשוב. לאחר מכן, סובב את הידית אחורה מעט כנגד כיוון השעון רק עד שהצבע יפסיק לדלוף מתוך המחט.
הערה: זה קריטי לקבוע את האיזון הזה בכל פעם מחט חדשה משמש. ללא איזון מוגדר כראוי, מיקרו מזרק ימשיך להזריק זמן מה לאחר ההזרקה מופעלת. זה אפילו אפשרי כי דחיפה אחת של לחצן ההזרקה עם מחט בלתי מאוזנת תגרום לגירוש של התוכן כולו של המחט שנטענה. - עם המחט ממורכז בשדה הראייה, להזיז את הצלחת ביצה כך המחט מיועדת הביצה להיות מוזרק ראשון. מומלץ כי זריקות להתחיל בפינה אחת של הרשת של ביצים מסודרות, למשל, בפינה השמאלית העליונה.
- כוונן את ההגדלה ל-50x; בהגדלה זו, ביצה אחת תמלא את רוב תחום התצוגה.
- השתמש בשני המיקרומניפולציה וביד אחת על צלחת הביצה כדי להעביר את המחט למקומו בזריקה.
- הקדם את המחט בעזרת המיקרומניפולציה והכנס את קצה המחט לביצה הראשונה שהוזרק.
- הכנס את המחט על 20-30% אורך הביצה מן האחורי (המורק) של הביצה (איור 1E), בניצב לציר הארוך של הביצה.
- הכנס פתרון גם עם דוושת כף הרגל הזריקה או כפתור ההזרקה על מיקרו מזרק. מנת משכל קטנה של חומר פלורסנט בתוך הביצה תציין זריקה מוצלחת (איור 1D).
הערה: זה לא נדיר עבור חלמון מסוימים להיות נפלט מן הביצה במהלך ההזרקה (איור 1F), וזה לא בהכרח מציין כי ביצה מוזרק יהיה בלתי קיימא. - . למשוך את המחט מהביצה אם הביצה היא הוסר בשוגג מתוך היטב עם נסיגה של המחט, להשתמש מלקחיים קטנים כדי לדחוף את הביצה בחזרה לתוך הטוב שלה תוך כדי לבטל את המחט.
- אם המחט הקבלה במהלך ההזרקה, להסיר את המחט מן הביצה, שמירה על המחט מתחת לפני השטח HBS פלוס 1% פניצילין/סטרפטומיצין פתרון המכסה את הביצים, לנקות את המחט סתומים באמצעות הפונקציה ברורה או על ידי דחיפת ההכנסה חצן.
- המשך להשתמש באותה מחט, חזור על הליך ההזרקה עבור ביצים רבות ככל האפשר. בהתחלה, זה יכול להיות רק 20 או 30 ביצים, אבל יגדל על 100 עם התרגול.
- אם המחט הופך סתומים ולא ניתן לנקות, להשליך את המחט, למלא מחט חדשה ולהתחיל שוב (כלומר, לחזור לשלב 5.7).
- לאחסן את המנה של ביצים מוזרקים בחממה חמה (23.5 – 26 ° c) כי הוא לח מעט (כדי למזער את האידוי) עד העוברים הגיעו לשלב הרצוי של פיתוח לניתוח.
- לפחות כל 24 שעות, להסיר ביצים כי הם כבר לא קיימא (איור 3A, B), ולהחליף את הפתרון ההשעיה עם hbs טריים ועוד 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
- שניים עד שלושה ימים לאחר ההזרקה, להעביר את הביצים על ידי ליטוף עדין או עם מלקחיים פלסטיק כדי מגבות נייר הלחלח עם HBS פלוס 1% פניצילין/סטרפטומיצין בצלחת פטרי להמשך להמשיך פיתוח בחממה חם ולח.
- לעקוב אחר הביצים, ולהסיר ביצים שאינן קיימא יותר כל יום (איור 3 א, ב).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצרצרים מניחים בקלות ביצים בחומר הלח, ומספקים חומר מתאים, כגון חול לח או עפר, הגורם להם להטיל מספר גדול של ביצים. זה יעיל במיוחד אם הצרצרים מונעים הראשון של חומר הנחת ביצה עבור 8-10 h. ביצים הונחו בחול נקי ניתן להפריד בקלות, נאסף (איור 1B) והניח לתוך מותאם אישית מעוצב ביצים בארות עבור הזרקה (איור 1b). ניתן להשתמש במיקרוסקופ מבתר, במיקרומזרק, ובמיקרומניפולציה (איור 1A) להזרקת ביצים בודדות עם מגוון חומרים (איור 1a). ביצים מוזרקים ליד הקצה האחורי, בנקודה של כ -20 – 30% לאורך הציר האחורי הקדמי (איור 1E). הבחנה את הקצה הקדמי המחודד יותר מן הקצה האחורי יותר בוטה יכול להיות קשה, כמו הבדלים אלה הם לעתים קרובות עדין (איור 1E). מתגלגל ביצה מצד לצד לעתים קרובות עוזר לגלות איזה סוף הוא אשר. לאחר הסרת מחט ההזרקה, חלמון לפעמים ביצה נפלט (איור 1F), אם כי זה לא נראה להתפשר על הבריאות של העובר המתפתח בתוך.
אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הוא הכנת מחטים משופעים. לאחר משיכת ארוך, דק מחטים הם חייבים להיות משופע לזווית 20 ° ויש להם קוטר הפתיחה של 10μm (± 2 μm). אם הקוטר גדול מדי, פתרון ההזרקה יהיה דליפה מתוך המחט, ומחטים אלה תיצור חורים גדולים בביצים, ירידה שיעורי ההישרדות. מחטים צר להגדיל את ההישרדות, אבל אם הם צרים מדי, הם נוטים לסתום בקלות, מה שהופך זריקות איטי ומתסכל. עם קוטר מחט של 10 יקרומטר ± 2 יקרומטר, ניתן להזריק כלפי מעלה של 100 ביצים עם מחט אחת מבלי להדביק את המחט.
מחטים יכול להיות משופע עם מיקרו מטחנת או משופעות (איור 2A). אלה חלקים של ציוד ניתן להשיג עם מיקרוסקופ מחובר, או אחד יכול להוסיף היקף מבתר על דוכן עצמאי עבור מודלים שאינם כוללים את המיקרוסקופ. מיקרומטר קטן מחזיק את המחט, אשר ניתן להטות את הזווית הרצויה והוריד את פני השטח של מישור שיוף מסתובב, אשר הרטיב עם מים נוטפים. דוגמה של משכו, אבל מחט בלתי משופע ניתן לראות באיור 2B, ו מחט עם משופעת 20 ° מוצג באיור 2b. מחטים חייב להיות מאוחסן בבטחה כדי למנוע נזק להישמר נקי (איור 2D).
הגדרת האיזון ואת הלחץ ההזרקה כראוי על מיקרו מזרק צריך לאפשר אחד להזריק כמות דומה של חומר לתוך כל ביצה הוזרק עם מחט זהה. אופטימיזציה של הזרקה ולחצים איזון יהיה צורך כאשר לשנות את המחט עם קוטר שונה. אופטימיזציה זו יהיה למקסם את העקביות של פולסים הזרקה.
שיעור ההישרדות הוא אחד הפרמטרים החשובים להערכת ההצלחה של ניסויים אלה. ביצים מתים ביותר יכול בקלות להיות מזוהה על ידי ראייה כדלקמן: החלמון ורקמות עובריים בתוך הביצה מתחילים להיות בלתי אחיד (איור 3A) ובסופו של דבר רוב החלמון יועברו לצד אחד של הביצה (איור 3a). כאשר הוערך לאחר 4 – 6 ימים (שווה ערך לשלבים 8 – 15)19, גדול מ 85% של ביצים שלא הוזרק שרדו ואילו ביצים הוזרק עם ריאגנטים ניסיוני בדרך כלל היה שיעור ההישרדות הנמוך (איור 3c). שליטה על כל ההיבטים של ההזרקה עצמה, כולל ניקוב המחט, המבוא של צבע ומאגר, או נוכחות של רכב או dsRNA, נדרש על מנת להבין את ההשפעות האמיתיות של מניפולציה ניסיוני ניסיון (איור 3C). בהתאם למניפולציה הניסיונית, ניתן לצפות לרמה גבוהה יותר של השפעה, וייתכן שיהיה צורך לשנות את התזמון של הטיפול או את תזמון ההזרקה כדי להעריך את ההשפעות הלא-קטלניות של המניפולציה.
הדרך בה מעריך את תוצאות ההזרקה. תלויה במה שהוזרק לדוגמה, שינויים פנוטיאריים כתוצאה מהחיקויים מסוימים של mRNA עשוי להיות ברור ברמת האנטומיה הגולמית. לדוגמה, משפר הגנים של zeste (E (z)) מדכא בדרך כלל את הגנים של Hox כולל ultrהחזה (Ubx). הזרקת dsRNA עבור e (z) דופק את הפונקציה e (z) ומשחרר Ubx דיכוי, וכתוצאה מכך Ubx ביטוי חוץ רחמי. זה מוביל את הטרנספורמציה של חמישה זוגות של התוספת הגאלית (אנטנה, maxilla, labium, T1 ו-T2 הרגל) לתוך התוספות כמו הרגליים T3, בשל הUbx במקטעים אלה20. בדוגמה השניה, ניתן להשתמש בביטוי GFP לצורך שינוי ההכנסה המוצלחת של העברה מוצלחת. למשל, כאשר cDNA קידוד של eGFP מתויג Histone 2b גן תחת השליטה של G. בימרו actin היזם הוכנס לתוך הגנום קריקט באמצעות הטרנספש השני, זה נעשה אפשרי להמחיש כל גרעין בביצה באמצעות הזריחה כדי להלהיב את eGFP-מתויג His2B חלבון (איור 4C, D). במקרה זה, ניתן היה לנטר את תנועת הגרעינים לאורך זמן7.
| שם הפתרון | רכיבים | הערות/תיאור |
| פתרון מאגר הזרקת 10x | ב 1 L H2O להוסיף: 0.8 g הנאל, 0.09 g Na2hpo4, 0.04 g KH2פו4, 2.98 g kcl | מלאי חנויות ב -4 ° c. לסנן כמות קטנה מיד לפני השימוש עם מזרק 1 mL מצויד במסנן 0.45 יקרומטר מזרק. חזור על כנדרש כדי לסנן כ 500 μL של פתרון הזרקה. להמשיך לסנן פתרון הזרקה על קרח במשך הניסוי. |
| היכל תמיסת מלח באגירה | ב 1 L H2O, להוסיף: 8.77 g הנאגל, 5.2 g hepes, | pH עד 7.0 ולאחסן ב 4 ° c. |
| טמטמתיל רודאמיין (10,000 MW) פתרון מניות צבען | צבע רומדן מתרמופישר | הצבע הזה נמכר לעתים קרובות. כאבקה לינובית במקרה זה, ליצור פתרון מניות של 50 mg/mL עם מים. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דקות כדי להסיר חלקיקים לא מסיסים. לאסוף את supernatant לאחר צנטריפוגה, הימנעות כל חומר חלקיקי בתחתית הצינור, סדרת מחלקים ו להקפיא ב-20 ° c. ניתן לשמור על מניות בשימוש ב -4 ° c במשך אחד עד שבועיים. הימנע הקפאת-הפשרה מספר פעמים. אם מחטים הם סתימת בשל הצבע, ניתן לסנן את הצבע גם דרך נייר #2 הסינון של Whatman. |
טבלה 1: מתכוני פתרונות ופתקים.
איור 1: מבט כולל על פרוטוקול הזרקת ביצים. (א) מוגדר אופייני שניתן להשתמש בו עבור זריקות ביצים. (ב) ביצים מופרדות מחול באמצעות מסננת. (ג) ביצים מוחזקים להזרקה בבארות קטנות שנעשו על ידי הצבת עובש לתוך חם, נוזל נוזלי. (ד) ניאון במחט בחמש ביצים מוזרק ניתן לראות דרך מיקרוסקופ מבתר פלורסנט. (ה) ביצה לא מוזרק. הקצה הקדמי (מחודד מעט; משמאל) וקצה אחורי (מימין) הם להבדיל זה מזה. האזור המתאים ביותר להזרקה, ליד הקצה האחורי, מוצג עם הכן. (ו) ביצה יומיים לאחר ההזרקה. אתר ההזרקה גלוי כצבע שינוי קל, וכמות קטנה של חלמון מסולק ניכר (חץ). סרגל שורות = 1 מ"מ (ד); 0.5 מ"מ (E ו-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מחטים משופע באמצעות מטחנת מיקרו או משופעות. (א) דוגמא למטחנה מיקרו עם משטח עגול, שיוף מסתובב הנוטפים על ידי המים הזורמים בטפטוף (טיפות מים ממזרק המוצג בחלק העליון של התמונה). (ב) לפני ביחוזרים, מחטים משכו ארוכות וצרות. (ג) לאחר מסתובב 20 °, ממחט זריקה חדה נוצרת. שים לב בקוטר 10 יקרומטר של לומן הפנימי. (ברים בקנה מידה אדום = 10 μm). (ד) משכו, מחטים משופעים ניתן לאחסן בצלחת פטרי עם מכסה מוחזק במקום באמצעות שעווה שיניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זריקות יכול להקטין את שיעור ההישרדות. (א) ביצים מתות ומתות ברורות על בדיקה חזותית. (ב) עם הזמן, החומר יהיה להגר לצד אחד של הביצה. (ג) השוואת שיעורי ההישרדות ארבעה עד שישה ימים לאחר הנחת הביצה למגוון מצבים, כולל: ביצים שלא הזריקו (n = 6 ניסויים); ביצים מנוקב עם מחט 9 יקרומטר אבל uninjected (n = 2 ניסויים); ביצים מוזרק עם מאגר וצבען (n = 13 ניסויים); ביצים שהוחדרו עם מאגר, צבע, וקטור בינוני-פלסטי (n = 2 ניסויים); ביצים מוזרק עם מאגר, צבע, ו DMSO (n = 11 ניסויים); וביצים שהוחדרו עם מאגר, צבע, ושליטה dsRNA (n = 22 ניסויים). סוג הפקד dsRNA המשמש כלול dsRNA כנגד eGFP או dsRed. המספרים הנמצאים בבסיס כל אחד מאותם העמודות מספרים את המספר הכולל של ביצים ששרדו/סה כ ביצים המשמשות לכל תנאי. קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ (A ו-B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הערכת תוצאות ההזרקה. (א-ב) הזרקה של משפר Zeste (E (z)dsrna משנה את הביטוי הרגיל של Ubx mrna (פראי סוג המוצג (א) ומוביל לטרנספורמציה של אנטנות (ו) וחלקי הפה (Mx, Lb) לתוך תוספות כמו הרגל (ב). (C-D) הזרקה של ביצים מוקדמות עם אלמנט הטרנספלבל ו-histone2B-eGFP מייצרת עוברים טרנסגניים המבטא GFP בכל הגרעינים. מיקום גרעינים יכול להיות נצפתה 8 h לאחר הנחת ביצים (ג) ו 20 h לאחר הנחת ביצה (ד). קיצורים: a = אנטנה; Mx = maxilla; Lb = labium; T1-3 = רגלי החזה 1 עד 3; RNAi = הפרעות RNA; Gb = G. בימרו; לפעול = actin; H2B = Histone H2B; GFP = חלבון פלורסנט ירוק. קנה מידה של סרגלים = 200 יקרומטר (A ו-B); 500 יקרומטר (E ו-F). תוצאות נסיוניות אלה תוארו במקור במקומות אחרים7,20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שני האתגרים העיקריים עם טכניקה זו הם הנושאים הקשורים של גודל מחט אופטימלית ושרידות. למרות מחטים קטנות לשפר את ההישרדות, מחטים עם צר לומן יש מידה רבה יותר של כוחות קפילר בעבודה, מה שהופך אותו סביר יותר כי החלמון יהיה לעבור לתוך המחט גורמת לו לסתום. במקרה הטוב, ניתן לנקות חסימות פשוט על-ידי הזרקת ביצה אחרת או על-ידי ניקוי המחט כמתואר לעיל. אפשר גם לנסות להגביר את לחץ המאזן על מיקרו מזרק עד החלמון הוא דחף מתוך המחט. האתגר העיקרי השני עם טכניקה זו הוא הישרדות. בידינו, שיעורי ההישרדות עבור ביצים מוזרק עם פתרונות ניסיוניים הם בדרך כלל בין 40 ו 80%. שיעורי ההישרדות יכול להיות נמוך כמו 10% עבור אלה המתחילים ללמוד את הטכניקה אבל ישתפר עם תרגול. פקדים שליליים, כמתואר לעיל, חשובים לחוקרים להעריך במדויק שינויים בשיעור הישרדות עם התרגול, בהתחשב בכך שמבוא של חומרים שונים יכול להקטין את שיעורי ההישרדות (איור 3 ג).
העיתוי של זריקות הוא שיקול חשוב עבור כל גישה ניסויית גם. ביצים מבוגרות יותר קשה יותר להזריק מאשר הצעירים יותר, ובאופן כללי, שיעורי הישרדות גבוהים יותר כאשר מזריקים צעיר יותר ולא ביצים מבוגרות יותר. המבוא של המחט וחומר מוזרק בשלבים מאוחרים יותר עלול להוביל לנזק אנטומי בלתי מכוון. עם זאת, עם ניסיון, הזרקה של ביצים ישנות של שניים עד שלושה ימים אפשרית. מיקוד בצד השני של הביצה בשלבים אלה מסייע להימנע מפגיעה העובר, אשר הצורות הראשונות על הצד הגחוני. המיקוד של הקצה האחורי עשוי להגביר את הגישה הכימית למחלקות הגרעיניות הראשונות ולמערך הנבט, המתרחשות בסמוך לקצה זה של הביצה19,21. אם אחד מנסה לתמרן את הגנום, עם המטרה של השגת או הילוכים נפוצה או germline של שינוי הגנום, זריקות צריך להתבצע לפני תאית, אשר מתחיל כ 14 שעות לאחר ביצה הנחת19 . אם הזרקת dsRNA לנקוש ברמות mRNA, חלון הזמן עבור זריקות צריך להיקבע בהתבסס על כמה מוקדם בפיתוח אחד מבקש להפיל גן של ריבית. בעוד ההשפעות של RNAi סביר להניח האחרון במשך זמן מה, dsRNA צריך להיות הציג מראש של הזמן שבו אחת מתכננת להעריך את כל השינויים פנוטיפים. שמירה על מעקב אחר הזמן שחלף במהלך ההזרקה ההתקדמות של התפתחות עובריים עשוי להיות חשוב כדי להבטיח כי ביצי הבמה הנכונה מוזרק. ללא קשר לחומר שהוזרק, עיכובים התפתחותיים בעקבות ההזרקה נפוצים, למרות שרמת ההשהיה עשויה להשתנות בהתאם לסוג הזרקה.
הפרוטוקול המוצג כאן מסתמך על מספר פריטי ציוד יקרים יחסית. עם זאת, הדבר אמור להיות אפשרי להזריק ביצים בהצלחה ללא שימוש בחלק מהפריטים הללו או אפילו. לדוגמה, יש מגוון של מיקרומרססים בשוק, וחלקם עשויים להיות יקרים פחות מאלה המוצעים בטבלת החומרים. אפשר גם פשוט להשתמש במזרק כדי להזריק כמות מתאימה של חומר, אם כי זה ייקח קצת תרגול. במקום מיקרומניפולציה יקרה, אפשר להשתמש במגוון חומרים כדי להחזיק את המחט יציבה ולאפשר מקדמה איטית ומבוקרת, ועיצוב פלסטי פשוט שימש לאחרים22. זה יכול להיות גם אפשרי כדי למנוע את השימוש של שיפוע, למרות הניסיון שלנו מסתובב הנכון יכול לעשות הבדל עצום להצלחה של זריקות. ייתכן שניתן יהיה לחדד מחט משכה על ידי גרירת קצה המחט ביד על פני הנייר החול המשובח ביותר, הערכת תהליך זה תחת מיקרוסקופ. ללא קשר, מחטים מחודדים יגרום לזריקות קל יותר ולשפר את ההישרדות.
טכניקת הזרקה זו גמישה וניתן להשתמש בה למגוון של מניפולציות שונות. כאן, הצגנו את התוצאות של הניסויים dsRNA ו-הקשר הבין-שינוי גנומי, אבל אפשר גם להשתמש CRISPR/Cas או גישות אחרות עם טכניקה זו. בניסויים כלולים כאן, הפנוטיפים המתקבלים היו ברורים וקל להעריך. ניסויים מסוימים עשויים לדרוש שימוש בכלים אימונוהיסטוכימיה או בכלי הדמיה אחרים כדי לראות את ההשפעות של מניפולציה ניסויית. חלופה אחת לזריקות היא השימוש אלקטרופורציה, אשר ניתן להשתמש בו כדי להחדיר DNA או אחרים קרו לתוך תאים ורקמות ב vivo. אלקטרופורציה ניתן להשתמש ביצי קריקט ישנים יותר שם העוברים כבר הקימו על מנת למקד אזורים ספציפיים8, אבל הזרקה היא שימושית יותר כאשר הניסוי דורש כי העובר המתפתח כולו ממוקד. טכניקת הזרקה זו צריכה להיות גם ניתנת להתאמה בקלות לשימוש בביצים ממגוון של חרקים וholometabolous שונים, באופן אידיאלי, לשפר את היכולת לבצע מחקרים השוואתיים משמעותיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקרים שדווחו בפרויקט זה נתמך על ידי פרס פיתוח מוסדי (רעיון) מן המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר מענק P20GM10342 כדי HH3, ועל ידי NSF מספר הפרס IOS-1257217 . בסדר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
