Summary
Qui presentiamo un protocollo per iniettare uova di cricket, una tecnica che serve come metodo fondamentale in molti esperimenti nel cricket, tra cui, ma non solo, l'interferenza dell'RNA e la manipolazione genomica.
Abstract
L'alterazione della funzione genica in un organismo in via di sviluppo è fondamentale per diversi tipi di esperimenti. Sebbene siano stati sviluppati strumenti genetici estremamente potenti nei sistemi modello tradizionali, è difficile manipolare i geni o l'RNA messaggero (mRNA) nella maggior parte degli altri organismi. Allo stesso tempo, gli approcci evolutivi e comparativi si basano su un'esplorazione della funzione genica in molte specie diverse, che richiede lo sviluppo e l'adattamento di tecniche per manipolare l'espressione al di fuori attualmente geneticamente trattabile specie. Questo protocollo descrive un metodo per iniettare reagenti nelle uova di cricket per esaminare gli effetti di una data manipolazione sullo sviluppo embrionale o larvale. Vengono descritte le istruzioni per la raccolta e l'iniezione di uova con aghi smussati. Questa tecnica relativamente semplice è flessibile e potenzialmente adattabile ad altri insetti. Si può raccogliere e iniettare decine di uova in un singolo esperimento, e i tassi di sopravvivenza per iniezioni tampone-solo migliorare con la pratica e può essere alto come 80%. Questa tecnica sosterrà diversi tipi di approcci sperimentali, tra cui l'iniezione di agenti farmacologici, l'mRNA in vitro con limite per esprimere geni di interesse, l'RNA a doppio filamento (dsRNA) per ottenere l'interferenza dell'RNA, l'uso di cluster regolarmente ripetizioni palindromiche brevi interspaziose (CRISPR) in concerto con reagenti di proteina 9 (Cas9) associati a CRISPR per la modifica genomica e elementi trasponibili per generare linee transgeniche transitorie o stabili.
Introduction
La capacità di modificare il genoma o influenzare l'espressione genica negli organismi è la base per la progettazione di molti tipi di esperimenti che testano la causalità funzionale. È inoltre fondamentale per il lavoro comparativo ed evolutivamente rilevante che le tecniche di modifica genomica e non genomica siano disponibili negli organismi al di fuori dei tradizionali sistemi genetici del modello animale (ad esempio, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, e Caenorhabditis elegans). Che si tratti del desiderio di comprendere la diversità dell'organismo1 o dell'adesione al principio di Krogh, che per ogni questione biologica c'è un organismo più adatto alla sua soluzione2,3,la capacità di modificare i genomi o influenzare l'espressione genica è essenziale per i moderni progetti sperimentali.
Il cricket Gryllus bimaculatus è un sistema modello emergente. Utilizzato per il secolo scorso in esperimenti neurologici4, gli ultimi due decenni hanno visto un crescente interesse sperimentale per il cricket, particolarmente focalizzato sull'evoluzione e lo sviluppo di questo organismo5. Il grillo è un insetto emimetabolo che si dirama a livello basaleto a insetti olometaboli ben studiati, come D. melanogaster e Tribonocastaneum6. A causa della sua posizione utile sull'albero evolutivo, gli scienziati sono interessati a porre domande sperimentali moderne e sofisticate in questo insetto, che ha portato a un crescente interesse nell'adattamento degli strumenti molecolari per l'uso in G. bimaculatus.
Le iniezioni di reagenti molecolari negli ovuli da cricket possono essere utilizzate per esperimenti di modificazione genomica e manipolazioni non genomiche dell'espressione genica negli embrioni. Ad esempio, sono stati creati transgenici G. bimaculatus che trasportano gli inserimenti eGFP utilizzando il piggyBac7,8. I ricercatori hanno creato con successo G. bimaculatus con nucleasi di dito di zinco (FN) e nuclee effettore (TAL) simili a istruzioni di trascrizione (TALEN) per introdurre rotture a doppio filamento in specifiche regioni genomiche9. Anche se le nomi di rete e i TALEN consentono il targeting specifico del sito in animali oltre i quattro grandi sistemi modello, questi reagenti sono stati rapidamente superati dal sistema CRISPR/Cas9, che è più semplice da usare, più efficiente e altamente flessibile10. CRISPR è stato utilizzato in G. bimaculatus per produrre knock-out11 così come knock-in linee12,13 Oltre alla modificazione genomica, dsRNA può essere iniettato nelle uova per abbattere l'espressione mRNA in sviluppo embrioni, consentendo ai ricercatori di comprendere il ruolo delle trascrizioni specifiche durante lo sviluppo14,15. Alcuni dettagli limitati su come iniettare uova di cricket sono stati pubblicati in precedenza12.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'iniezione di uova di G. bimaculatus precoce. Questo protocollo è efficace e facilmente adattabile a varie impostazioni di laboratorio, materiali di iniezione ed eventualmente ad altri insetti. Sebbene siano stati pubblicati ulteriori dettagli per la progettazione e l'implementazione di esperimenti di modifica e knockdown, pubblicati altrove12,13, questi approcci alla fine si baseranno sul protocollo di iniezione descritto qui.
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Protocol
1. Configurazione e preparazione dei materiali da parte dell'hardware
NOT: Consultare la Tabella 1 e la Tabella dei Materiali per la preparazione di soluzioni, reagenti e dettagli sulle attrezzature.
- Impostare un microscopio dissezioso per vedere le uova e guidare l'ago di iniezione. (Lafigura 1A mostra un microscopio sezionato dotato di fluorescenza).) La capacità di fluorescenza è vantaggiosa ma non necessaria.
- Posizionare un micromanipolatore a 3 assi per manovrare l'ago di iniezione in posizione (Figura1A).
- Impostare un microiniettore con tubi e un supporto ad ago per iniettare piccole quantità di materiale (Figura 1A). Facoltativamente, utilizzare un pedale che non è mostrato nella figura.
- Progettare e creare un timbro per creare pozzi per le uova (Figura 1C) stampando l'inverso del modello desiderato, sia con una stampante 3D o un incisore laser.
NOT: Il timbro campione stampato in 3D mostrato è 4,5 cm x 5 cm con 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm per la creazione di singoli pozzi. Dettagli su come fare una varietà di stampi personalizzabili sono stati pubblicati altrove16. - Preparare 10x Buffer di iniezione, HEPES buffered saline (HBS), e una soluzione stock di Tetramethylrhodamine Dextran tintura e conservare a 4 gradi centigradi.
- Preparare soluzioni sperimentali da inienaturare, come dsRNA, CRISPR/Cas912, elementi trasponibili, mRNA con tappo in vitro7,8, agenti farmacologici17, .GAR o TALENS9.
- Posizionare il nastro a doppia levetta su diversi strati di nastro da laboratorio standard su un vetrino al microscopio di vetro per creare una piattaforma di 1 mm circa sopra lo scivolo di vetro, che verrà utilizzato per tenere gli aghi per la valutazione.
- Preparare un contenitore da cricket di circa 40 cm x 60 cm di dimensioni con un coperchio che possiede un'apertura coperta di rete per la circolazione dell'aria.
- Aggiungere cibo, acqua e materiali riparatori.
- Aggiungere diverse decine di grilli adulti sani e maschi. Identificare il cricket adulto dalla presenza di ali.
NOT: Una gamma di età post-immaginarie può aumentare la resa delle uova. La densità dei grilli dovrebbe essere relativamente alta per essere in grado di raccogliere abbastanza uova per un esperimento, ma non così affollata che si verifica il cannibalismo. Ad esempio, circa due dozzine di grilli sani, con un rapporto tra uomini e donne, in un contenitore delle dimensioni sopra indicate dovrebbero essere sufficienti per raccogliere circa 200 uova in un periodo da uno a due h. I grilli possono essere mantenuti a temperatura ambiente, ma lo sviluppo e il comportamento saranno ottimali se i grilli sono mantenuti in un incubatore caldo (23,5-26 gradi centigradi), umido (40 - 60% di umidità relativa).
2. Fare aghi per l'iniezione
- Utilizzare Capillari di vetro Borosilicate con filamento (vedere la Tabella dei Materiali per i dettagli delle dimensioni). Preparare gli aghi di trazione nello stesso giorno, o fino a pochi giorni prima che le iniezioni siano completate.
- Posizionare un vetro capillare nell'emittente, centrare il vetro sul filamento e stringere le manopole per fissare il vetro in posizione.
- Impostare la temperatura dell'epullre vicino alla temperatura della rampa di vetro (da -5 a 10 gradi centigradi).
- Utilizzare un protocollo a passo singolo e ad alto calore per tirare un lungo cono con una piccola apertura, ma evitare di sciogliere le estremità chiuse.
NOT: Ad esempio, quando si utilizza l'emittente micropipette descritto nella Tabella dei Materiali dotata di filamento a scatola, utilizzare i seguenti parametri per il vetro con una temperatura di rampa di 478: Calore 478; Tirare 45; Vel 75; Del 120. Le condizioni ottimali per la produzione di un ago con la forma illustrata nella Figura 2B devono essere determinate empiricamente da ogni utente. - Punte di aghi di smusso in preparazione per le iniezioni.
- Sorseggiare il piano di smerigliatrice rotante dello svelatore (Figura 2A) con acqua gocciolante. Utilizzare acqua distillata inosmosi inversa (RO) o diethylpyrocarbonate (DEPC).
- Posizionare l'ago tirato nello smusso e ruotare in un angolo di 20 gradi.
- Abbassare l'ago fino a toccare solo il piano di macinazione e smussare per 2 o 3 min.
- Valutare la smussatura posizionando l'ago smussato su nastro a doppia levetta che è stato aderito a un vetrino del microscopio di vetro.
- Posizionare la diapositiva che tiene l'ago sullo stage di un microscopio composto dotato di una fotocamera e di un software di acquisizione delle immagini.
- Acquisire un'immagine della punta dell'ago utilizzando un obiettivo 20x.
- Utilizzare il software di imaging per misurare il diametro del lume interno dell'ago appena prossimato all'apertura smussata (Figura 2C). La dimensione ottimale è di 10 m e 2 m.
- Scartare gli aghi che hanno un'apertura inferiore a 8 m e superiore a 12 m.
- Conservare gli aghi in un contenitore con un coperchio per evitare di essere polverosi. Utilizzare una striscia di cera o materiale simile per elevare gli aghi dal fondo del contenitore per evitare di rompere le punte (Figura 2D).
3. Raccolta e preparazione delle uova
- Massimizzare il numero di uova deposte privando i grilli di qualsiasi materiale umido di deposizione (fiale d'acqua, piatti a base di uova) durante la notte o per almeno 8-10 h prima di tentare di raccogliere le uova.
NOT: Poiché le femmine hanno la capacità di conservare internamente lo sperma, può essere necessaria una procedura a tempo diverso se la fecondazione accuratamente a tempo è sperimentalmente essenziale18. - Fare 40 mL di 1% agarose in acqua e versare in una piastra di Petri 10 cm.
- Posizionare un timbro a vescino sulla superficie dell'agarose prima che si solidifiche.
- Rimuovere il timbro, una volta che l'agarose è solidificato, per rivelare i pozzi (Figura 1C).
- Riempire la piastra di agarose con HBS contenente 1% Penicillin/Streptomycin.
- Mettere il coperchio sul piatto, avvolgere in parafilm e conservare a 4 gradi centigradi.
NOT: I piatti possono essere conservati per un paio di giorni a 4 gradi centigradi, ma devono essere riscaldati fino a temperatura ambiente prima dell'uso per evitare la condensa. - Fai un piatto da collezione di uova per i grilli per deporre le uova riempiendo un piatto di petri da 35 mm con sabbia bianca del parco giochi (Figura 1B).
NOT: La sabbia specificata nella Tabella dei Materiali ha le dimensioni appropriate del grano. Se i granelli di sabbia sono troppo grandi, la sabbia danneggerà le uova. - Coprire il piatto di uova con un quadrato di carta assorbente tagliato per circa 18 cm x 18 cm, e posizionare sulla parte superiore del piatto con sabbia. Attraverso questo tovagliolo di carta coprire il piatto riempito con acqua del rubinetto.
- Inclinare la piastra di Petri e spremere delicatamente la parte superiore per rimuovere l'acqua in eccesso.
- Infilare gli angoli del quadrato del tovagliolo di carta sotto il piatto e posizionare il piatto di uova nel coperchio invertito, che contribuirà a mantenere il coperchio dell'asciugamano di carta in posizione.
- Mettere il piatto d'uovo nel cestino del grillo e lasciare che le femmine adulte oviposit uova per uno o due h.
NOT: Il tempo relativamente breve qui assicura che tutte le uova saranno simili nella fase di sviluppo al momento dell'iniezione. Se l'iniezione prima della cellularizzazione è importante, le iniezioni dovrebbero avvenire entro 14 h di deposizione di uova19. - Nel frattempo, lasciare che il piatto di agarose (dal punto 3.6) si scaldi a temperatura ambiente in preparazione per l'iniezione di uova.
- Rimuovere il piatto di raccolta delle uova, ora contenente uova appena deposte, dal cestino del grillo, e rimuovere il coperchio dell'asciugamano di carta. Posizionare un colino con una dimensione del poro di 0,5-1 mm su un becher di almeno 500 mL di capacità (Figura 1B).
- Sciacquare il contenuto del piatto di deposizione delle uova (sabbia e uova) nel colino sotto l'acqua del rubinetto che scorre delicatamente lasciando i grani di sabbia cadere attraverso la rete del colino in acqua nel becchere sottostante, lasciando le uova di grillo nel cesto del colino.
- Riempire un contenitore con acqua RO e metterlo in un vassoio. Invertire il colino sopra il contenitore e toccarlo contro il piatto per spostare le uova in acqua. Le uova affonderanno sul fondo del contenitore.
- Tagliare la punta di una punta di pipetta P1000 con le forbici per fare un'apertura di circa 3 mm di diametro. Mettere questa mancia su un pipettor P1000 e utilizzarlo per trasferire le uova dal contenitore al piatto di muffa uovo di agarose, trasferendo meno acqua possibile.
- Utilizzare pinzette di plastica per allineare le uova in pozzi di agarose riempiti con HBS più 1% Penicillin/ Streptomycin. Ogni uovo affonderà sul fondo di un pozzo individuale. Coprire con il coperchio della piastra di Petri fino a quando non è pronto per l'iniezione.
4. Preparare il Microiniettore
- Attaccare il microiniettore a una fonte di aria o gas compressa (questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando aria compressa o N2).
NOT: Se si utilizza un serbatoio d'aria portatile, riempire fino ad almeno 75 psi. Il serbatoio perderà la pressione dell'aria durante le iniezioni e potrebbe essere necessario riempire; iniezioni diventano difficili al di sotto di 40psi. - Accendere il microiniettore. Impostare il tempo di iniezione su 0,17 s e la pressione a 10–15 psi.
NOT: La pressione esatta necessaria dipenderà dall'apertura dell'ago e deve essere determinata empiricamente per ogni ciclo di iniezione e/o nuovo ago utilizzato. - Assicurarsi che la manopola BALANCE del microiniettore sia rivolta a 0 (in genere completamente in senso antiorario) e che il microiniettore sia pressurizzato e in modalità di iniezione.
5. Iniezioni
- Filtrare circa 500 l of 10x Buffer di iniezione utilizzando una siringa da 1 mL e un filtro a siringa da 0,45 m.
- Reagenti di iniezione di miscelazione (i dettagli che seguono sono per l'iniezione di dsRNA preparati come descritto nel12).
NOT: Può essere consigliabile progettare ed eseguire diversi controlli, soprattutto quando si sta imparando questa tecnica per la prima volta. Le uova iniettate senza iniettare, iniettare il tampone da solo e il tampone da ttigli, un reagente di controllo (come eGFP dsRNA) sono tutti buoni test di quanto possano essere dirompenti i vari elementi del protocollo di iniezione. Vedere Figura 3 per la sopravvivenza di un numero di controlli diversi. - Iniziare con un'aliquota dsRNA da 4 mL.
- Aggiungete 0,5 mL del buffer di iniezione 10x filtrato all'aliquota dsRNA.
- Aggiungere 0,5 mL di 50 mg/mL Tetramethyl rhodamine Dextran soluzione di brodo. Se si lavora su un ambito di dissezione senza fluorescenza, utilizzare Phenol Red invece.
- Conservare tutti i materiali sul ghiaccio per tutta la durata del periodo di iniezione.
- Caricare la soluzione di iniezione in un ago di iniezione utilizzando punte di carico da 20 mL e un pipet p10.
- Predisporre una soluzione di iniezione di 1,5 ml e inserire la punta di carico nell'estremità larga dell'ago di iniezione.
- Espellere la soluzione il più in basso possibile nell'ago ed eliminare le bolle d'aria sfogliando delicatamente; fare attenzione a non rompere l'ago.
- Posizionare il piatto di uova al microscopio dissetivo e selezionare un basso ingrandimento di circa 10x (1x ingrandimento visto attraverso obiettivi oculari 10x).
- Inserire l'ago nell'alloggiamento di iniezione e stringere.
NOT: Fare attenzione che l'ago sia correttamente e saldamente inserito nell'alloggiamento. Per fare questo, tirare l'estremità larga dell'ago indietro fuori dall'alloggiamento di metallo, portando il tubo di silicio nell'alloggiamento con esso. Regolare il tubo di silicio in modo che l'estremità in vetro dell'ago sporge appena oltre il silicio. Se questo non è fatto, il tubo di silicio può ottenere pizzicato tra il vetro e l'alloggiamento del metallo, bloccando l'estremità dell'ago. - Inserire con attenzione l'alloggiamento di iniezione con un ago attaccato nel micromanipolatore. Essere consapevoli dell'estremità tagliente dell'ago e fare attenzione che non è urtato in superfici e rotto.
- Mentre si osservano sia le uova che l'ago al microscopio, spostare l'ago vicino alle uova nell'angolo in alto a sinistra della griglia del piatto.
- Abbassare l'ago fino a quando la punta entra nell'HBS più 1% Penicillin/Streptomycin soluzione tampone nel piatto.
- Centrare l'ago nel campo visivo e spostare il piatto dell'uovo in modo che l'ago sia di qualche mm più vicino al bordo del piatto rispetto alle uova.
- Non ostruire la vista della griglia di uova con l'ago.
- Impostare il microscopio sul filtro appropriato per la Rhodamine in modo che sia possibile osservare la fluorescenza nell'ago e concentrarsi sulla punta dell'ago.
- Sul microiniettore, ruotare lentamente la manopola BALANCE in senso orario fino a quando la soluzione di iniezione inizia a fuoriuscire dall'ago nella soluzione di sospensione. Il numero di equilibrio sullo schermo del microiniettore inizierà ad aumentare, anche se il valore numerico non è importante. Successivamente, girare la manopola in senso antiorario leggermente solo fino a quando il tintura smette di fuoriuscire dall'ago.
NOT: È fondamentale impostare questo equilibrio ogni volta che viene utilizzato un nuovo ago. Senza il bilanciamento impostato in modo appropriato, il microiniettore continuerà a iniettare per qualche tempo dopo l'iniezione viene attivata. È anche possibile che una singola pressione del pulsante di iniezione con un ago sbilanciato comporterà l'espulsione dell'intero contenuto dell'ago caricato. - Con l'ago centrato nel campo visivo, spostare il piatto dell'uovo in modo che l'ago sia rivolto all'uovo da iniettare per primo. Si raccomanda che le iniezioni inizino in un angolo della griglia di uova disposte, ad esempio, l'angolo in alto a sinistra.
- Regolare l'ingrandimento a circa 50x; a questo ingrandimento, un singolo uovo riempirà la maggior parte del campo visivo.
- Utilizzare sia il micromanipolatore che la mano sul piatto dell'uovo per spostare l'ago in posizione per l'iniezione.
- Far avanzare l'ago utilizzando il micromanipolatore e inserire la punta dell'ago nel primo uovo da iniettare.
- Inserire l'ago a una lunghezza del 20-30% dell'uovo dall'estremità posteriore (smussata) dell'uovo (Figura 1E), perpendicolare al lungo asse dell'uovo.
- Soluzione di iniezione con il pedale del piede di iniezione o il pulsante di iniezione sul microiniettore. Un piccolo bolo di materiale fluorescente all'interno dell'uovo indicherà un'iniezione di successo (Figura 1D).
NOT: Non è raro che qualche tuorlo venga espulso dall'uovo durante l'iniezione (Figura 1F), e questo non indica necessariamente che l'uovo iniettato sarà inutilizzabile. - Ritirare l'ago dall'uovo. Se l'uovo viene involontariamente sollevato dal suo pozzo dopo la retrazione dell'ago, utilizzare piccole pinze per spingere l'uovo indietro nel suo pozzo mentre si ritrae l'ago.
- Se l'ago si intasa durante l'iniezione, rimuovere l'ago dall'uovo e, mantenendo l'ago immerso nella soluzione HBS più 1% Penicillin/ Streptomynin che copre le uova, cancellare l'ago intasato utilizzando la funzione Clear o spingendo l'inietta abbottonare.
- Continuando a usare lo stesso ago, ripetere la procedura di iniezione per il maggior numero possibile di uova. In un primo momento, questo può essere solo circa 20 o 30 uova, ma aumenterà a oltre 100 con la pratica.
- Se l'ago diventa intasato e non può essere eliminato, scartare l'ago, riempire un nuovo ago e ricominciare (ad esempio, tornare al punto 5.7).
- Conservare il piatto di uova iniettate in un'incubatrice calda (23,5–26 gradi centigradi) leggermente umida (per ridurre al minimo l'evaporazione) fino a quando gli embrioni non hanno raggiunto lo stadio di sviluppo desiderato per l'analisi.
- Almeno ogni 24 h, rimuovere le uova che non sono più vitali (Figura 3A, B) e sostituire la soluzione di sospensione con HBS fresco più 1% Penicillin/Streptomycin.
- Due o tre giorni dopo l'iniezione, trasferire le uova con una leggera pipettatura o con pinze plastiche su asciugamani di carta inumiditi con HBS più l'1% di Penicillina/Streptomycin in una piastra di petri ricoperta di coperchio per continuare lo sviluppo nell'incubatrice calda e umida.
- Monitorare le uova e rimuovere le uova che non sono più vitali ogni giorno (Figura 3A, B).
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Representative Results
I grilli depongono prontamente le uova nel materiale umido e forniscono materiale adeguato, come sabbia umida o sporcizia, li induce a deporre un gran numero di uova. Ciò è particolarmente efficace se i grilli vengono prima privati di materiale per la deposizione delle uova per 8-10 h. Le uova deposte nella sabbia pulita possono essere facilmente separate, raccolte (Figura 1B) e collocate in pozzi di uova progettati su misura per l'iniezione (Figura 1C). Un microscopio sezionato, un microiniettore e un micromanipolatore (Figura 1A) possono essere utilizzati per iniettare singole uova con una varietà di materiali (Figura 1D). Le uova vengono iniettate vicino all'estremità posteriore, in un punto di circa il 20-30% lungo l'asse anteriore-posteriore (Figura 1E). Distinguere l'estremità anteriore più appuntita dall'estremità posteriore più smussata può essere difficile, in quanto queste differenze sono spesso sottili (Figura 1E). Rotolare un uovo da un lato all'altro spesso aiuta a rivelare quale fine è quale. Dopo la rimozione dell'ago di iniezione, il tuorlo d'uovo viene talvolta espulso (Figura 1F), anche se questo non sembra compromettere la salute dell'embrione in via di sviluppo all'interno.
Uno dei passaggi più critici in questo protocollo è la preparazione di aghi smussati. Dopo aver tirato a lungo, aghi sottili devono essere smussati ad un angolo di 20 gradi e hanno un diametro di apertura di 10m .2 m. Se il diametro è troppo grande, la soluzione di iniezione fuoriesce dall'ago, e questi aghi creeranno grandi fori nelle uova, diminuendo i tassi di sopravvivenza. Aghi più stretti aumentano la sopravvivenza, ma se sono troppo stretti, tendono a intasarsi facilmente, il che rende le iniezioni lente e frustranti. Con un diametro dell'ago di 10 m e 2 m, è possibile iniettare verso l'alto di 100 uova con un singolo ago senza avere lo intasamento dell'ago.
Gli aghi possono essere smussati con una smerigliatrice micro o smussatura (Figura2A). Questi pezzi di attrezzature possono essere ottenuti con un microscopio collegato, o si potrebbe aggiungere un ambito di sezionazione su un supporto indipendente per modelli che non includono il microscopio. Un piccolo micromanipolatore tiene l'ago, che può essere inclinato all'angolo desiderato e abbassato alla superficie di un piano di macinazione rotante, che viene inumidito con acqua gocciolante. Un esempio di ago tirato, ma non smussato può essere visto in Figura 2B, e un ago con una smussatura a 20 gradi è mostrato nella Figura 2C. Gli aghi devono quindi essere conservati in modo sicuro per evitare danni e per essere tenuti puliti (Figura2D).
L'impostazione appropriata dell'equilibrio e della pressione di iniezione sul microiniettore dovrebbe consentire di iniettare una quantità comparabile di materiale in ogni uovo iniettato con lo stesso ago. L'ottimizzazione delle pressioni di iniezione e di equilibrio sarà necessaria quando si passa ad un ago con un diametro diverso. Questa ottimizzazione massimizzerà la consistenza degli impulsi di iniezione.
Il tasso di sopravvivenza è un parametro importante per valutare il successo di questi esperimenti. La maggior parte delle uova morte può essere facilmente identificata alla vista come segue: il tuorlo e il tessuto embrionale all'interno dell'uovo iniziano ad agglomerarsi in modo non uniforme (Figura 3A) e alla fine la maggior parte del tuorlo migrerà su un lato dell'uovo (Figura 3B). Quando sono stati valutati dopo 4-6 giorni (equivalente agli stadi 8-15)19, più dell'85% degli ovuli non imettati è sopravvissuto mentre le uova iniettate con reagenti sperimentali avevano generalmente un tasso di sopravvivenza più basso (Figura 3C). Il controllo di tutti gli aspetti dell'iniezione stessa, compresa la puntura dell'ago, l'introduzione di tintura e tampone, o la presenza di veicoli o dsRNA, è necessario per comprendere i veri effetti della manipolazione sperimentale tentata(Figura 3C). A seconda della manipolazione sperimentale, ci si può aspettare un livello più elevato di letalità, e potrebbe essere necessario modificare la tempistica del saggio o la tempistica dell'iniezione al fine di valutare eventuali effetti non letali della manipolazione.
Il modo in cui si valutano i risultati fenotipici dell'iniezione dipende da ciò che è stato iniettato. Ad esempio, i cambiamenti fenotipici come risultato di specifici knockdown mRNA possono essere evidenti a livello di anatomia lorda. Ad esempio, il gene Enhancer di zeste (E(z)) normalmente sopprime i geni Hox tra cui Ultrabithorax (Ubx). L'iniezione di dsRNA per E(z) abbatte la funzione E(z) e rilascia la soppressione di Ubx, con conseguente espressione Ectopic Ubx. Questo porta alla trasformazione di cinque coppie di appendici ventrali (antenna, mascella, labium, T1 e T2 gamba) in Appendici T3 gamba-come, a causa della derepressione di Ubx in quei segmenti20. In un secondo esempio, è possibile utilizzare l'espressione GFP per formulare il successo dell'inserimento di un transgene. Ad esempio, quando un gene Histone 2B con codifica cDNA con etichettatura eGFP sotto il controllo di un promotore di G. bimaculatus Actin è stato inserito nel genoma del grillo usando la trasposasi piggyBac, è diventato possibile visualizzare ogni nucleo nell'uovo usando la fluorescenza per eccitare la proteina His2B etichettata con eGFP (Figura 4C,D). In questo caso, è stato possibile monitorare il movimento dei nuclei nel tempo7.
| Nome della soluzione | Componenti | Commenti/Descrizione |
| 10x Soluzione buffer di iniezione | In 1 L H2O aggiungere: 0.8 g NaCl, 0.09 g Na2HPO4, 0.04 g KH2PO4, 2.98 g KCl | Conservare le scorte a 4 gradi centigradi. Filtrare una piccola quantità immediatamente prima dell'uso con una siringa da 1 mL dotata di un filtro di siringa da 0,45 m. Ripetere l'operazione per filtrare circa 500 - L di soluzione di iniezione. Mantenere la soluzione di iniezione filtrata sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento. |
| HEPES memorizzanella salina tampone | In 1 L H2O, aggiungere: 8.77 g NaCl, 5.2 g HEPES, | pH a 7,0 e conservare a 4 gradi centigradi. |
| Soluzione di stodano Tetramethyl Rhodamine Dextran (10,000 MW) | Tinri di Rhodamine di Thermofisher | Questo tinriè è spesso venduto come polvere liofilizzata. In questo caso, creare una soluzione di riserva di 50 mg/mL con acqua. Centrifuga a 12.000 x g per 5 min per rimuovere eventuali particelle insolubili. Raccogliere il supernatante dopo la centrifugazione, evitando qualsiasi particolato nella parte inferiore del tubo aliquota e congelare a -20 gradi centigradi. Le scorte in uso possono essere mantenute a 4 gradi centigradi per una o due settimane. Evitare aliquote congelanti più volte. Se gli aghi si intasano a causa di tintura, il tintura può anche essere filtrato attraverso Whatman #2 carta da filtro. |
Tabella 1: Ricette e note di soluzione.
Figura 1: Panoramica del protocollo di iniezione delle uova. (A) Un set tipico che può essere utilizzato per le iniezioni di uova. (B) Le uova sono separate dalla sabbia attraverso un setaccio. (C) Le uova vengono tenute per l'iniezione in piccoli pozzi realizzati mettendo uno stampo in agarose calde e liquide. (D) La fluorescenza nell'ago e in cinque uova iniettate può essere osservata attraverso il microscopio di dissezione fluorescente. (E) Un uovo non iniettato. L'estremità anteriore (leggermente appuntita; sinistra) e l'estremità posteriore (più smussata; destra) sono distinguibili l'una dall'altra. La regione più adatta per l'iniezione, vicino all'estremità posteriore, è mostrata con la staffa. (F) Un uovo due giorni dopo l'iniezione. Il sito di iniezione è visibile come una leggera scolorimento, e una piccola quantità di tuorlo espulso è evidente (freccia). Barre della scala: 1 mm (D); 0,5 mm (E ed F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gli aghi vengono smussati utilizzando una smerigliatrice o una smussatura. (A) Un esempio di un micro smerigliatrice con una superficie di macinazione circolare e rotante inumidita gocciolando acqua RO (l'acqua gocciola dalla siringa mostrata nella parte superiore dell'immagine). (B) Prima della smussata, gli aghi tirati sono lunghi e stretti. (C) Dopo la smussatura fino a 20 gradi, viene creato un aghi di iniezione affilati. Si noti il diametro di 10 m del lume interno. (Barre della scala rossa 10 m). (D) Gli aghi tirati e smussati possono essere conservati in un piatto Petri con coperchio e tenuti in posizione con cera dentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le iniezioni possono diminuire il tasso di sopravvivenza. (A) Le uova morte e morenti sono evidenti al momento dell'ispezione visiva. (B) Nel corso del tempo, il materiale migrerà su un lato dell'uovo. (C) Confronto dei tassi di sopravvivenza da quattro a sei giorni dopo la deposizione delle uova per una varietà di condizioni, tra cui: uova non iniettate (n - 6 esperimenti); uova forate con un ago di 9 m ma non iniettate (n : 2 esperimenti); uova iniettate con tampone e tinture (n - 13 esperimenti); uova iniettate con tampone, tinture e vettore plasmide (n - 2 esperimenti); uova iniettate con tampone, tinture e DMSO (n esperimenti n ) ; e uova iniettate con tampone, tinture e dsRNA di controllo (n - 22 esperimenti). Il tipo di dsRNA di controllo utilizzato includeva dsRNA contro eGFP o dsRed. I numeri alla base di ogni battuta indicano il numero totale di uova sopravvissute / uova totali utilizzate per ogni condizione. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Barra della scala: 1 mm (A e B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione dei risultati dell'iniezione. (A-B) L'iniezione di Sme potenziatore di ste (E(z)) dsRNA altera la normale espressione dell'mRNA Ubx (tipo selvaggio mostrato in (A) e porta alla trasformazione delle antenne (AN) e delle parti della bocca (Mx, Lb) in appendici simili a gambe (B). (C-D) L'iniezione di uova precoci con l'elemento trasponibile piggyBac e istone2B-eGFP produce embrioni transgenici che esprimono GFP in tutti i nuclei. La posizione dei nuclei può essere osservata 8 h dopo la deposizione delle uova (C) e 20 h dopo la deposizione dell'uovo (D). Abbreviazioni: Un'antenna; Mx - maxilla; Lb - labio; T1-3 - gambe toraciche da 1 a 3; RNAi - Interferenza dell'RNA; Gb - G. bimaculatus; Atto : actin; H2B - Istone H2B; GFP - Proteina fluorescente verde. Barre della scala: 200 m (A e B); 500 m (E ed F). Questi risultati sperimentali sono stati originariamente descritti altrove7,20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le due sfide principali con questa tecnica sono le questioni correlate di dimensioni ottimali dell'ago e sopravvivenza. Anche se gli aghi più piccoli migliorano la sopravvivenza, gli aghi con lumen più stretti hanno un maggior grado di forze capillari al lavoro, il che rende più probabile che il tuorlo si muova nell'ago causandone l'intasare. Nel migliore dei casi, i blocchi possono essere eliminati semplicemente iniettando un altro uovo o cancellando l'ago come descritto sopra. Si può anche tentare di aumentare la pressione di equilibrio sul microiniettore fino a quando il tuorlo viene spinto fuori dall'ago. L'altra grande sfida con questa tecnica è la sopravvivenza. Nelle nostre mani, i tassi di sopravvivenza per le uova iniettate con soluzioni sperimentali sono in genere tra il 40 e l'80%. I tassi di sopravvivenza possono essere bassi come 10% per coloro che iniziano a imparare questa tecnica, ma miglioreranno con la pratica. I controlli negativi, come descritto in precedenza, sono importanti per i ricercatori per valutare con precisione i cambiamenti nel tasso di sopravvivenza con la pratica, dato che l'introduzione di vari materiali può ridurre i tassi di sopravvivenza (Figura 3C).
La tempistica delle iniezioni è una considerazione importante anche per ogni approccio sperimentale. Le uova più vecchie sono più difficili da iniettare rispetto a quelle più giovani e, in generale, i tassi di sopravvivenza sono più elevati quando si iniettano uova più giovani piuttosto che più vecchie. L'introduzione dell'ago e del materiale iniettato nelle fasi successive può portare a danni anatomici indesiderati. Con l'esperienza, tuttavia, è possibile l'iniezione di uova vecchie da due a tre giorni. Puntare sul lato dorsale dell'uovo in queste fasi aiuta a evitare di danneggiare l'embrione, che si forma per primo sul lato ventrale. Il targeting per l'estremità posteriore può aumentare l'accesso reagente alle prime divisioni nucleari e alla formazione di bande germiche, che si verificano vicino a questa estremità dell'uovo19,21. Se si sta tentando di manipolare il genoma, con l'obiettivo di ottenere la trasmissione somatica o germinale diffusa della modificazione del genoma, le iniezioni devono essere eseguite prima della cellularizzazione, che inizia circa 14 h dopo la deposizione delle uova19 . Se l'iniezione di dsRNA a livelli di mRNA knockdown, la finestra temporale per le iniezioni deve essere determinata in base a quanto presto si desidera ridurre un gene di interesse. Mentre gli effetti dell'RNAi probabilmente durano per qualche tempo, il dsRNA deve essere introdotto prima del momento in cui si prevede di valutare eventuali cambiamenti nel fenotipo. Tenere traccia del tempo trascorso durante l'iniezione e la progressione dello sviluppo embrionale può essere importante per garantire che vengano iniettati gli ovuli appropriati. Indipendentemente dal materiale iniettato, i ritardi dello sviluppo dopo l'iniezione sono comuni, anche se il grado del ritardo può variare a seconda dell'iniettore.
Il protocollo qui presentato si basa su una serie di attrezzature relativamente costose. Dovrebbe essere possibile, tuttavia, iniettare le uova con successo senza l'uso di alcuni o addirittura tutti questi elementi. Per esempio, ci sono una varietà di microiniettori sul mercato, e alcuni possono essere meno costosi di quello suggerito nella Tabella dei Materiali. È anche possibile utilizzare semplicemente una siringa per iniettare una quantità appropriata di materiale, anche se questo richiederebbe una certa pratica. Invece di un costoso micromanipolatore, si potrebbe utilizzare una varietà di materiali per tenere l'ago stabile e consentire un lento, avanzata controllata, e un semplice design di plastilina è stato utilizzato da altri22. Può anche essere possibile evitare l'uso di uno smusso, anche se nella nostra esperienza una smussatura corretta può fare un'enorme differenza per il successo delle iniezioni. Può essere possibile affilare un ago tirato trascinando la punta dell'ago a mano sulla carta vetrata più fine, valutando questo processo al microscopio. Indipendentemente da ciò, aghi affilati renderà le iniezioni più facili e migliorare la sopravvivenza.
Questa tecnica di iniezione è flessibile e può essere utilizzata per una varietà di manipolazioni diverse. Qui, abbiamo mostrato i risultati per gli esperimenti di modifica genomica dipendenti dal dsRNA e piggyBac, ma è anche possibile utilizzare CRISPR/Cas o altri approcci con questa tecnica. Negli esperimenti qui inclusi, i fenotipi risultanti erano ovvi e facili da valutare. Alcuni esperimenti possono richiedere l'uso di immunohistochimica o altri strumenti di visualizzazione al fine di vedere gli effetti della manipolazione sperimentale. Un'alternativa alle iniezioni è l'uso dell'elettroporazione, che può essere utilizzata per introdurre DNA o altre macromolecole nelle cellule e nei tessuti in vivo. L'elettroporazione può essere utilizzata in ovuli da cricket più anziani in cui gli embrioni si sono già formati per colpire regioni specifiche8, ma l'iniezione è più utile quando l'esperimento richiede che l'intero embrione in via di sviluppo sia mirato. Questa tecnica di iniezione dovrebbe anche essere facilmente adattabile per l'uso nelle uova da una varietà di diversi insetti emimeboli e olometaboli, migliorando idealmente la capacità di intraprendere studi comparativi significativi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questo progetto è stata sostenuta da un Premio per lo Sviluppo Istituzionale (IDeA) dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità con numero di sovvenzione P20GM10342 a HH3, e dal numero di premio NSF IOS-1257217 a Della CGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
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