Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para injetar ovos do grilo, uma técnica que sirva como um método fundamental em muitas experiências no grilo, incluindo, mas não limitado a, a interferência do RNA e a manipulação genomic.
Abstract
Alterando a função gênica em um organismo em desenvolvimento é central para diferentes tipos de experimentos. Embora as ferramentas genéticas tremendamente poderosas tenham sido desenvolvidas em sistemas modelo tradicionais, é difícil manipular genes ou RNA mensageiro (mRNA) na maioria dos outros organismos. Ao mesmo tempo, abordagens evolutivas e comparativas dependem de uma exploração da função gênica em muitas espécies diferentes, necessitando do desenvolvimento e adaptação de técnicas para manipular a expressão fora do momento geneticamente tratável Espécie. Este protocolo descreve um método para injetar reagentes em ovos do grilo para ensaiar os efeitos de uma manipulação dada no desenvolvimento embrionário ou larval. Instruções sobre como coletar e injetar ovos com agulhas chanfradas são descritas. Esta técnica relativamente simples é flexível e potencialmente adaptável a outros insetos. Pode-se reunir e injetar dezenas de ovos em um único experimento, e as taxas de sobrevivência para injeções de buffer-only melhorar com a prática e pode ser tão alto quanto 80%. Esta técnica apoiará vários tipos de abordagens experimentais, incluindo a injecção de agentes farmacológicos, o mRNA tampado in vitro para expressar genes de interesse, RNA duplo-encalhado (dsRNA) para alcançar a interferência do RNA, o uso de aglomerados regularmente repetições palindrômicas curtas interespaçadas (CRISPR) em concerto com reagentes de proteína 9 (Cas9) associados à CRISPR para modificação genômica e elementos transponíveis para gerar linhas transgênicas transitórias ou estáveis.
Introduction
A capacidade de modificar o genoma ou influenciar a expressão gênica em organismos é a base para o projeto de muitos tipos de experimentos que testam a causalidade funcional. Também é fundamental para o trabalho comparativo e evolutivamente relevante que técnicas de modificação genômica e não-genômica estejam disponíveis em organismos fora dos sistemas de modelo animal de laboratório genético tradicional (por exemplo, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans). Se é o desejo de compreender a diversidade organizosa1 ou a adesão ao princípio de Krogh, que para cada questão biológica há um organismo mais adequado à sua solução2,3, acapacidade de modificar genomas ou influência da expressão gênica é essencial para projetos experimentais modernos.
O grilo Gryllus bimaculatus é um sistema emergente de modelo. Usado para o século passado em experimentos de Neurologia4, as duas últimas décadas testemunharam um aumento do interesse experimental no críquete, particularmente focado na evolução e desenvolvimento deste organismo5. O grilo é um inseto hemimetábolos que ramifica basalmente aos insetos holometábolos well-estudados, tais como D. melanogaster e castaneum do Tribolium6. Devido à sua posição útil na árvore evolutiva, os cientistas estão interessados em fazer perguntas experimentais modernas e sofisticadas neste inseto, o que levou a um crescente interesse em adaptar ferramentas moleculares para o uso em G. bimaculatus.
Injeções de reagentes moleculares em ovos de críquete podem ser usadas para experimentos de modificação genômica, bem como manipulações não-genômica da expressão gênica em embriões. Por exemplo, G. bimaculatus transgênica carregando inserções de EGFP foram criadas usando a peptídeo piggybac7,8. Os investigadores criaram com sucesso o Knockout G. bimaculatus usando nucleases do zinco-dedo (ZFNs) e a transcrição ativador-como (tal) nucleases efetoras (Talens) para introduzir rupturas dobro-encalhados em regiões genomic específicas9. Embora ZFNs e TALENs permitam segmentação local específica em animais além dos quatro grandes sistemas de modelos, esses reagentes foram rapidamente ultrapassados pelo sistema CRISPR/Cas9, que é mais simples de usar, mais eficiente e altamente flexível10. Crispr tem sido usado em G. bimaculatus para produzir knock-out11 , bem como Knock-in linhas12,13 além de modificação genômica, dsRNA pode ser injetado em ovos para derrubar a expressão de mRNA no desenvolvimento embriões, permitindo que os investigadores compreendam o papel das transcrições específicas ao longo do desenvolvimento14,15. Alguns detalhes limitados sobre como injetar ovos de críquete foram publicados anteriormente12.
Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para injetar ovos adiantados do G. bimaculatus . Este protocolo é eficaz e facilmente adaptável a vários ajustes do laboratório, materiais da injeção, e possivelmente a outros insetos. Embora detalhes adicionais para projetar e implementar experimentos de modificação e knockdown genômica tenham sido publicados em outro lugar12,13, essasabordagens, emúltima análise, dependem do protocolo de injeção detalhado aqui.
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Protocol
1. configuração de hardware e preparação de materiais
Nota: Consulte a tabela 1 e a tabela de materiais para preparação de soluções, reagentes e detalhes do equipamento.
- Configurar um microscópio de dissecação para ver os ovos e guiar a agulha de injeção. (Figura 1a mostra um microscópio de dissecação equipado com fluorescência.) A capacidade de fluorescência é vantajosa, mas não necessária.
- Posicione um micromanipulador de 3 eixos para manobrar a agulha de injeção no lugar (Figura 1a).
- Configurar um microinjector com tubo e um suporte de agulha para injetar pequenas quantidades de material (Figura 1a). Opcionalmente, use um pedal que não é mostrado na figura.
- Projete e crie um carimbo para criar poços para ovos (Figura 1C) imprimindo o inverso do padrão desejado, seja com uma impressora 3D ou com um gravador a laser.
Nota: O carimbo de amostra impresso em 3D mostrado é 4,5 cm x 5 cm com 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm saliências para a criação de poços individuais. Detalhes sobre como fazer uma variedade de moldes personalizáveis foram publicados em outros lugares16. - Prepare o tampão de injeção 10x, o soro fisiológico tamponado de HEPES (HBS), e uma solução de estoque da tintura do Dextran de Tetramethylrhodamine e armazene em 4 ° c.
- Preparar soluções experimentais a serem injetadas, tais como dsRNA, crispr/Cas912, elementos transposáveis, in vitro tampado mRNA7,8, agentesfarmacológicos17, zfns, ou Talens9.
- Coloc a fita da dobro-vara em diversas camadas de fita padrão do laboratório em uma corrediça de vidro do microscópio a fim criar uma plataforma 1 milímetro ou assim acima da corrediça de vidro, que será usada segurando agulhas para a avaliação.
- Prepare um recipiente do grilo aproximadamente 40 cm x 60 cm no tamanho com uma tampa que possui uma abertura mesh-covered para a circulação de ar.
- Adicione alimentos, água e materiais de abrigando.
- Adicione várias dúzias de grilos adultos masculinos e femininos saudáveis. Identifique o grilo adulto pela presença de asas.
Nota: Uma escala de idades do borne-imaginal pode aumentar Rendimentos do ovo. A densidade de grilos deve ser relativamente alta, a fim de ser capaz de coletar ovos suficientes para uma experiência, mas não tão lotado que o canibalismo ocorre. Por exemplo, cerca de duas dúzias de grilos saudáveis, com uma proporção aproximadamente igual de macho para fêmea, em um recipiente do tamanho mencionado acima deve ser suficiente para coletar cerca de 200 ovos em um período de um a dois h. Os grilos podem ser mantidos à temperatura ambiente, mas o desenvolvimento e o comportamento serão ótimos se os grilos forem mantidos em uma incubadora morna (23,5 – 26 ° c), úmida (40-60% de umidade relativa).
2. fazendo agulhas para injeção
- Use capilares de vidro de borosilicate com filamento (veja a tabela de materiais para detalhes do tamanho). Prepare as agulhas de tração no mesmo dia, ou até alguns dias antes de as injeções estarem concluídas.
- Coloc um vidro capilar no extrator, centram o vidro no filamento, e apertam os botões para fixar o vidro no lugar.
- Ajuste a temperatura do extrator perto do Temp da rampa de vidro (-5 ° c a + 10 ° c).
- Use um único-passo, alto-protocolo de calor para puxar um longo cone com uma pequena abertura, mas evitar derreter as extremidades fechadas.
Nota: Por exemplo, ao usar o extrator de micropipeta detalhado na tabela de materiais equipados com um filamento de caixa, use os seguintes parâmetros para vidro com uma temperatura de rampa de 478: Heat 478; Puxe 45; Vel. 75; Del 120. As condições ideais para a produção de uma agulha com a forma mostrada na Figura 2b devem ser determinadas empiricamente por cada usuário. - Pontas da agulha chanfrada na preparação para as injeções.
- Molhe o plano do moedor giratório do chanfrador (Figura 2a) com água pingando. Use a osmose reversa (RO) ou o de (DEPC)-água destilada tratada.
- Coloque a agulha puxada no Biseladora cantos e rode para um ângulo de 20 °.
- Abaixe a agulha até que ele apenas toca o plano de moagem e bisel para 2 a 3 min.
- Avalie o chanfro coloc a agulha chanfrada na fita da dobro-vara que foi aderida a uma corrediça de vidro do microscópio.
- Coloque o slide segurando a agulha no palco de um microscópio composto equipado com uma câmera e software de aquisição de imagem.
- Adquira uma imagem da ponta da agulha usando um objetivo 20x.
- Utilize o software de imagem para medir o diâmetro do lúmen interior da agulha apenas proximal à abertura chanfrada (Figura 2C). O tamanho ideal é de 10 μm + 2 μm.
- Descarte as agulhas com uma abertura inferior a 8 μm e acima de 12 μm.
- Guarde as agulhas em um recipiente com uma tampa para evitar ficar empoeirado. Use uma tira de cera ou material similar para elevar as agulhas da parte inferior do recipiente para evitar quebrar as pontas (Figura 2D).
3. coleta e preparação de ovos
- Maximize o número de ovos colocados privando grilos de qualquer material úmido (frascos de água, pratos de ovos) durante a noite ou por pelo menos 8 – 10 h antes de tentar coletar ovos.
Nota: Desde que as fêmeas têm a habilidade de armazenar internamente o esperma, um procedimento cronometrado diferentemente pode ser necessário se a fecundação com cuidado cronometrada é experimentalmente essencial18. - Faça 40 mL de agarose de 1% em água e despeje em um prato de Petri de 10 cm.
- Coloc um selo do ovo-poço na superfície do agarose antes que solidifies.
- Retire o carimbo, uma vez que o agarose é solidificado, para revelar os poços (Figura 1C).
- Encha a placa de poço de agarose com HBS contendo 1% de penicilina/estreptomicina.
- Coloque a tampa no prato, enrole no parafilm e armazene a 4 ° c.
Nota: Os pratos podem ser armazenados por alguns dias a 4 ° c, mas devem ser aquecidos até à temperatura ambiente antes da utilização para evitar a condensação. - Faça um prato de coleta de ovos para os grilos para colocar o ovo, preenchendo um prato de Petri de 35 mm com areia branca playground (Figura 1b).
Nota: A areia especificada na tabela de materiais é do tamanho de grão apropriado. Se os grãos de areia são muito grandes, a areia vai danificar os ovos. - Cubra o prato de ovo com um quadrado de papel toalha cortada para ser de aproximadamente 18 cm x 18 cm, e coloque na parte superior do prato com areia. Através desta toalha de papel cobrir o prato cheio com água da torneira.
- Incline o prato de Petri e aperte suavemente a parte superior para remover o excesso de água.
- Dobre os cantos do quadrado de papel toalha o prato e coloque o prato de ovo na tampa invertida, que vai ajudar a manter a tampa de toalha de papel no lugar.
- Coloque o prato de ovo no escaninho de críquete e permitir que as fêmeas adultas para ovipositar ovos para um a dois h.
Nota: O tempo relativamente curto aqui garante que todos os ovos serão semelhantes no estágio de desenvolvimento no momento da injeção. Se a injeção antes da celularização for importante, as injeções devem ocorrer dentro de 14 h de ovos que colocam19. - Enquanto isso, permitir que o prato de agarose (a partir do passo 3,6) para aquecer a temperatura ambiente em preparação para a realização de ovos para injeção.
- Retire o prato de coleta de ovos, agora contendo ovos recém-colocados, a partir do escaninho de críquete, e retire a tampa de toalha de papel. Coloque um filtro com um tamanho de poros de 0,5 – 1 mm sobre uma taça de pelo menos 500 mL de capacidade (Figura 1b).
- Enxágüe o conteúdo do prato de ovos (areia e ovos) no filtro a água da torneira suavemente running deixando os grãos de areia cair através da malha do filtro na água na Taça abaixo, mas deixando os ovos de críquete na cesta do filtro.
- Encha um recipiente com água RO e coloque-o numa bandeja. Inverta o filtro sobre o recipiente e bata-o contra o prato para desalojar os ovos na água. Os ovos vão afundar para o fundo do recipiente.
- Corte a ponta de uma ponta de pipeta P1000 com uma tesoura para fazer uma abertura de aproximadamente 3 mm de diâmetro. Coloc esta ponta em um pipetador P1000 e use-a para transferir os ovos do recipiente ao prato do molde do ovo do agarose, transferindo tão pouca água como possível.
- Use pinças de plástico para a linha de ovos em poços de agarose preenchido com HBS mais 1% penicilina/estreptomicina. Cada ovo vai afundar para o fundo de um indivíduo bem. Cubra com a tampa do prato de Petri até estar pronto para injetar.
4. Prepare o Microinjector
- Fixe o microinjector a uma fonte de ar comprimido ou de gás (este protocolo foi otimizado usando ar comprimido ou N2).
Nota: Se estiver usando um tanque de ar portátil, preencha pelo menos 75 psi. O tanque perderá a pressão do ar durante todo as injeções e pode precisar de ser reenchido; as injeções tornam-se difíceis abaixo de 40psi. - Ligue o microinjector. Defina o tempo de injeção para 0,17 s e a pressão para 10 – 15 psi.
Nota: A pressão exata necessária dependerá da abertura da agulha e deve ser determinada empiricamente para cada rodada de injeção e/ou agulha nova usada. - Certifique-se de que o botão BALANCE do microinjector está virado para 0 (normalmente totalmente no sentido anti-horário) e que o microinjector está pressurizado e no modo de injecção .
5. injeções de
- Filtre cerca de 500 μL de tampão de injecção 10x utilizando uma seringa de 1 mL e um filtro de seringa de 0,45 μm.
- Misture os reagentes da injeção (os detalhes que se seguem são para a injeção de dsRNA preparado como descrito em12).
Nota: Pode ser aconselhável projetar e executar vários controles, especialmente quando se aprende primeiro esta técnica. Poking ovos sem injetar, injetando buffer + corante sozinho, ou injetando buffer + corante + um reagente de controle (como eGFP dsRNA) são todos bons testes de como disruptivas vários elementos do protocolo de injeção pode ser. Veja a Figura 3 para a capacidade de sobrevivência de vários controles diferentes. - Comece com uma alíquota de 4 mL de dsRNA.
- Adicione 0,5 mL do tampão de injeção 10x filtrado à alíquota de dsRNA.
- Adicionar 0,5 ml de 50 mg/ml tetramethyl rodamina Dextran Dye Stock Solution. Se trabalhar em um espaço de dissecação sem fluorescência, use o vermelho do phenol preferivelmente.
- Mantenha todos os materiais no gelo durante a duração do período de injeção.
- Coloque a solução de injeção em uma agulha de injeção usando pontas de carga de 20 mL e um Pipet P10.
- Elaborar uma solução injetável de 1,5 mL e inserir a ponta de carga na extremidade larga da agulha de injecção.
- Ejecte a solução tão distante para baixo na agulha como possível e elimine bolhas de ar sacudendo delicadamente; tenha cuidado para não quebrar a agulha.
- Coloque o prato de ovos o microscópio de dissecação e selecione uma baixa ampliação de cerca de 10x (1x ampliação visto através de 10x olho objetivos).
- Insira a agulha na carcaça de injecção e aperte.
Nota: Tenha cuidado para que a agulha esteja correctamente e firmemente inserida na carcaça. Para fazer isso, puxe a extremidade larga da agulha para fora da carcaça metálica, trazendo a tubulação de silício na carcaça com ele. Ajuste a tubagem de silicone de modo a que a extremidade de vidro da agulha se saliente apenas para além do silício. Se isso não for feito, o tubo de silício pode ser beliscado entre o vidro ea carcaça de metal, bloqueando a extremidade da agulha. - Insira cuidadosamente a carcaça de injeção com uma agulha acoplada no micromanipulador. Esteja ciente da extremidade afiada da agulha e tenha cuidado que não é colidido em superfícies e quebrado.
- Ao olhar ambos os ovos e a agulha através do microscópio, mova a agulha perto dos ovos no canto esquerdo superior da grade do prato.
- Abaixe a agulha até a ponta entrar no HBS mais 1% de solução tamponada de penicilina/estreptomicina no prato.
- Centrar a agulha no campo de visão e mover o prato de ovo para que a agulha é de alguns mm mais perto da borda do prato do que os ovos.
- Não obstrua a vista da grelha dos ovos com a agulha.
- Ajuste o microscópio ao filtro apropriado para o RHODAMINE assim que é possível observar a fluorescência na agulha e centrar-se sobre a ponta da agulha.
- No microinjetor, gire lentamente o botão BALANCE no sentido horário até que a solução de injeção comece a vazar da agulha para a solução de suspensão. O número de saldo na tela do microinjector começará a aumentar, embora o valor numérico não seja importante. Em seguida, gire o botão para trás no sentido anti-horário ligeiramente apenas até que o corante pare de vazar da agulha.
Nota: É crítico ajustar este contrapeso cada vez que uma agulha nova é usada. Sem o equilíbrio ajustado apropriadamente, o microinjector continuará a injetar por algum tempo depois que a injeção é disparada. É mesmo possível que um único impulso do botão de injeção com uma agulha desequilibrada resultará na expulsão de todo o conteúdo da agulha carregada. - Com a agulha centrada no campo de visão, mova o prato de ovo para que a agulha é destinada ao ovo a ser injetado primeiro. Recomenda-se que as injeções comecem em um canto da grade de ovos arranjados, por exemplo, o canto esquerdo superior.
- Ajuste a ampliação para cerca de 50x; nesta ampliação, um único ovo preencherá a maior parte do campo de visão.
- Use tanto o micromanipulador e uma mão sobre o prato de ovo para mover a agulha em posição para a injeção.
- Avance a agulha utilizando o micromanipulador e insira a ponta da agulha no primeiro ovo a ser injetado.
- Insira a agulha a 20 – 30% de comprimento do ovo da extremidade posterior (blunter) do ovo (Figura 1e), perpendicular ao eixo longo do ovo.
- Injete a solução com o pedal de injecção ou com o botão de injecção no microinjector. Um bolus pequeno do material fluorescente dentro do ovo indicará uma injeção bem sucedida (Figura 1D).
Nota: Não é incomum que algumas gemas sejam ejetadas do ovo durante a injeção (Figura 1F), e isso não indica necessariamente que o óvulo injetado será inviável. - Retraia a agulha do ovo. Se o ovo é levantado involuntariamente fora de seu poço em cima da retração da agulha, use o fórceps pequeno para empurrar o ovo de volta em seu poço ao retrting a agulha.
- Se a agulha obstruir durante a injeção, retire a agulha do ovo e, mantendo a agulha submersa no HBS mais 1% solução de penicilina/estreptomicina cobrindo os ovos, limpe a agulha entupida usando a função Clear ou empurrando a injeção Botão.
- Continuando a usar a mesma agulha, repita o procedimento de injeção para o maior número possível de ovos. No início, este pode ser apenas cerca de 20 ou 30 ovos, mas vai aumentar para mais de 100 com a prática.
- Se a agulha ficar entupida e não puder ser apagada, descarte a agulha, encha uma nova agulha e comece novamente (ou seja, retorne à etapa 5,7).
- Guarde o prato de ovos injetados em uma incubadora quente (23,5 – 26 ° c) que é levemente úmido (para minimizar a evaporação) até que os embriões tenham atingido o estágio desejado de desenvolvimento para a análise.
- Pelo menos a cada 24 h, remover os ovos que não são mais viáveis (Figura 3a, B), e substituir a solução de suspensão com HBS fresco mais 1% penicilina/estreptomicina.
- Dois a três dias após a injeção, transfira os ovos pela pipetagem delicada ou com o fórceps plástico às toalhas de papel umedecidas com HBS mais 1% penicilina/Streptomycin em um prato de Petri lidded para continuar o desenvolvimento na incubadora morna, úmida.
- Monitore os ovos e remova os ovos que não são mais viáveis a cada dia (Figura 3a, B).
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Representative Results
Os grilos prontamente colocam ovos no material úmido, e fornecendo material adequado, como areia úmida ou sujeira, induz-os a colocar um grande número de ovos. Isto é especialmente eficaz se os grilos são primeiro privados de material de postura de ovos para 8 – 10 h. os ovos colocados em areia limpa podem ser facilmente separados, recolhidos (Figura 1b) e colocados em poços de ovos concebidos medida para injeção (Figura 1C). Um microscópio de dissecação, um microinjector, e um micromanipulador (Figura 1a) podem ser usados para injetar ovos individuais com uma variedade de materiais (Figura 1D). Os ovos são injetados perto da extremidade posterior, em um ponto aproximadamente 20 – 30% ao longo do eixo ântero-posterior (Figura 1e). Distinguir a extremidade anterior mais apontada da extremidade mais Blunted do posterior pode ser difícil, porque estas diferenças são frequentemente sutis (Figura 1e). Rolando um ovo de lado a lado muitas vezes ajuda a revelar qual é o fim que. Após a remoção da agulha de injecção, a gema de ovo é ejetado às vezes (Figura 1F), embora esta não pareça comprometer a saúde do embrião tornando-se para dentro.
Uma das etapas mais críticas neste protocolo é a preparação de agulhas chanfradas. Depois de puxar as agulhas compridas e finas, devem ser chanfradas a um ângulo de 20 ° e ter um diâmetro de abertura de 10μm (± 2 μm). Se o diâmetro for muito grande, a solução de injeção vazará para fora da agulha, e estas agulhas criará grandes buracos em ovos, diminuindo as taxas de sobrevivência. Agulhas mais estreitas aumentam a capacidade de sobrevivência, mas se eles são muito estreitos, eles tendem a entupir facilmente, o que torna as injeções lentas e frustrantes. Com um diâmetro de agulha de 10 μm ± 2 μm, é possível injetar para cima de 100 ovos com uma única agulha sem ter a obstrução da agulha.
As agulhas podem ser chanfradas com um micro moedor ou um chanfrador (Figura 2a). Estas partes de equipamento podem ser obtidas com um microscópio Unido, ou uma poderia adicionar um espaço de dissecação em um carrinho independente para os modelos que não incluem o microscópio. Um micromanipulador pequeno prende a agulha, que pode ser inclinada ao ângulo desejado e abaixada à superfície de um plano de moedura de giro, que seja umedecido com água do gotejamento. Um exemplo de uma agulha puxada, mas sem proteção, pode ser observado na Figura 2b, e uma agulha com bisel de 20 ° é mostrada na Figura 2C. As agulhas devem então ser armazenadas com segurança para evitar danos e ser mantidas limpas (Figura 2D).
O ajuste da pressão de equilíbrio e injeção apropriadamente no microinjetor deve permitir injetar uma quantidade comparável de material em cada ovo injetado com a mesma agulha. A optimização de pressões da injeção e do contrapeso será necessária ao mudar a uma agulha com um diâmetro diferente. Essa otimização maximizará a consistência dos pulsos de injeção.
A taxa de sobrevida é um parâmetro importante para avaliar o sucesso desses experimentos. A maioria dos ovos mortos pode ser facilmente identificada pela visão da seguinte forma: a gema e o tecido embrionário dentro do ovo começam a se amontoar de forma desigual (Figura 3a) e, eventualmente, a maior parte da gema migrará para um lado do ovo (Figura 3B). Quando avaliados após 4 – 6 dias (equivalentes aos estágios 8 – 15)19, maior que 85% dos ovos não injetados sobreviveram enquanto os ovos injetados com reagentes experimentais geralmente apresentaram menor sobrevida (Figura 3C). O controle de todos os aspectos da própria injeção, incluindo a punção da agulha, a introdução de corante e tampão, ou a presença de veículo ou dsRNA, é necessário para compreender os verdadeiros efeitos da tentativa de manipulação experimental (Figura 3C). dependendo da manipulação experimental, um nível mais elevado de letalidade pode ser esperado, e um pode precisar de alterar o sincronismo do ensaio ou o sincronismo da injeção a fim avaliar todos os efeitos não-letais da manipulação.
A forma como se avalia os resultados fenotípicos da injeção depende do que foi injetado. Por exemplo, as alterações fenotípicas resultantes de knockdowns de mRNA específicas podem ser óbvias no nível de anatomia bruta. Por exemplo, o potenciador genético do Zeste (E (z)) normalmente suprime os genes Hox , incluindo o ultrabithorax (UBX). Injetar dsRNA para e (z) derruba a função e (z) e libera a supressão UBX , resultando em expressão UBX ectópica. Isso leva à transformação de cinco pares de apêndices ventrais (antena, maxila, labium, T1 e T2) em apêndices semelhantes à perna T3, devido à desreferência de UBX nesses segmentos20. Em um segundo exemplo, é possível usar a expressão de GFP para ensaiar a inserção bem sucedida de um transgene. Por exemplo, quando um cDNA que codifica um gene histone 2B EGFP-etiquetado o controle de um promotor de Actin do bimaculatus do G. foi introduzido no genoma do grilo usando o transposase de piggybac , tornou-se possível visualizar cada núcleo no ovo usando fluorescência para excitar a proteína His2B eGFP-Tagged (Figura 4C, D). Neste caso, foi possível monitorar o movimento dos núcleos ao longo do tempo7.
| Nome da solução | Componentes | Comentários/descrição |
| Solução tampão de injeção 10x | Em 1 L H2o adicionar: 0,8 g nacl, 0, 9 g nd2hpo4, 0, 4 g KH2po4, 2,98 g KCl | Armazene o estoque em 4 ° c. Filtre uma pequena quantidade imediatamente antes da utilização com uma seringa de 1 mL equipada com um filtro de seringa de 0,45 μm. Repita o que for necessário para filtrar aproximadamente 500 μL de solução injetável. Mantenha a solução de injeção filtrada no gelo durante a duração do experimento. |
| Soro fisiológico tamponado HEPES | Em 1 L H2O, adicionar: 8,77 g nacl, 5,2 g HEPES, | pH a 7,0 e armazenar a 4 ° c. |
| Tetramethyl RHODAMINE Dextran (10.000 MW) solução de corante | Tintura de RHODAMINE de Thermofisher | Este corante é muitas vezes vendido como um pó liofilizado. Neste caso, compõem uma solução de estoque de 50 mg/mL com água. Centrifugue a 12.000 x g durante 5 min para remover quaisquer partículas insolúveis. Recolher o sobrenadante após a centrifugação, evitando qualquer material particulado na parte inferior do tubo, alíquota e congelar a-20 ° c. As alíquotas de estoque em uso podem ser mantidas a 4 ° c por uma a duas semanas. Evite congelar-thawing alíquotas várias vezes. Se as agulhas estão obstruindo devido à tintura, o corante pode igualmente ser filtrado com o Whatman #2 papel de filtro. |
Tabela 1: receitas e notas da solução.
Figura 1: visão geral do protocolo de injeção de ovo. (A) um conjunto típico que pode ser usado para injeções de ovos. (B) os ovos são separados da areia através de uma peneira. (C) os ovos são prendidos para a injeção em poços pequenos feitos coloc um molde no agarose morno, líquido. (D) a fluorescência na agulha e em cinco ovos injetados pode ser observada através do microscópio de dissecação fluorescente. E) um óvulo não injetado. A extremidade anterior (ligeiramente apontada; esquerda) e extremidade posterior (mais Blunted; direita) são distinguíveis de se. A região mais adequada para injeção, perto da extremidade posterior, é mostrada com o suporte. (F) um ovo dois dias após a injecção. O local da injeção é visível como uma ligeira descoloração, e uma pequena quantidade de gema expelida é evidente (seta). Barras de escala = 1 mm (D); 0,5 mm (e e F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: as agulhas são chanfradas usando um micro moedor ou um beveller. (A) um exemplo de um micro moedor com uma superfície de moedura circular, girando umedecido pingando a água do ro (gotas da água da seringa mostrada na parte superior da imagem). (B) antes de chanfradura, as agulhas puxadas são longas e estreitas. (C) após chanfradura a 20 °, é criada uma agulha de injecção afiada. Observe o diâmetro de 10 μm do lúmen interno. (Barras de escala vermelha = 10 μm). (D) puxado, as agulhas chanfradas podem ser armazenadas em um prato de Petri com uma tampa e ser mantidas no lugar usando a cera dental. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: as injeções podem diminuir a taxa de sobrevida. (A) os ovos inoperantes e morrendo são óbvios em cima da inspeção visual. (B) ao longo do tempo, o material migrará para um lado do ovo. (C) comparação das taxas de sobrevida de quatro a seis dias após a colocação de ovos para uma variedade de condições, incluindo: ovos não injetados (n = 6 experimentos); ovos perfurados com agulha de 9 μm mas não injetados (n = 2 experimentos); ovos injetados com tampão e corante (n = 13 experimentos); ovos injetados com tampão, corante e vetor plasmídeo (n = 2 experimentos); ovos injetados com tampão, corante e DMSO (n = 11 experimentos); e ovos injetados com tampão, corante e controle dsRNA (n = 22 experimentos). O tipo de controle dsRNA usado incluiu dsRNA contra eGFP ou dsRed. Os números na base de cada barra observam o número total de ovos sobreviventes/ovos totais usados para cada condição. As barras de erro representam o erro padrão da média. Barra de escala = 1 mm (A e B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: avaliação dos resultados da injeção. (A-B) A injeção do potenciador de Zeste (E (z)) dsRNA altera a expressão normal de UBX mRNA (tipo selvagem mostrado em (a) e conduz à transformação das antenas (an) e do bocal (MX, libra) em apêndices perna-like (B). (C-D) A injeção de ovos precoces com o elemento transposável piggyBac e histone2B-eGFP produz embriões transgênicos expressando GFP em todos os núcleos. A localização dos núcleos pode ser observada 8 h após a postura de ovos (C) e 20 h após a postura do ovo (D). Abreviaturas: an = Antenna; MX = maxila; Lb = labium; T1-3 = pernas torácicas 1 a 3; RNAi = interferência de RNA; GB = G. bimaculatus; Act = actina; H2B = histona H2B; GFP = proteína verde fluorescente. Barras de escala = 200 μm (A e B); 500 μm (e e F). Esses resultados experimentais foram originalmente descritos em outro lugar7,20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os dois desafios principais com esta técnica são as edições relacionadas do tamanho e do survivability óptimos da agulha. Embora as agulhas menores melhorem o survivability, as agulhas com lúmens mais estreitos têm um maior grau de forças capilares no trabalho, que o faz mais provável que o gema se mova na agulha que causa o entupir. Na melhor das casos, os bloqueios podem ser limpos simplesmente injetando outro ovo ou limpando a agulha como descrito acima. Um pode igualmente tentar aumentar a pressão do contrapeso no microinjector até que a gema esteja empurrada para fora da agulha. O outro grande desafio com esta técnica é a capacidade de sobrevivência. Em nossas mãos, as taxas de sobrevida de ovos injetados com soluções experimentais são tipicamente entre 40 e 80%. As taxas de sobrevivência pode ser tão baixo quanto 10% para aqueles que começam a aprender esta técnica, mas vai melhorar com a prática. Os controles negativos, como descrito acima, são importantes para que os pesquisadores avaliem com precisão as mudanças na taxa de sobrevida com a prática, uma vez que a introdução de vários materiais pode diminuir as taxas de sobrevida (Figura 3C).
O sincronismo das injeções é uma consideração importante para cada aproximação experimental também. Os ovos mais velhos são mais difíceis de injetar do que os mais jovens, e, em geral, as taxas de sobrevivência são maiores quando injetando mais jovens em vez de ovos mais velhos. A introdução da agulha e do material injetado em estágios posteriores pode levar a danos anatômicos não intencionais. Com a experiência, no entanto, a injeção de ovos de dois a três dias de idade é possível. Visando o lado dorsal do ovo nestas fases ajuda a evitar danificar o embrião, que se forma primeiro no lado ventral. Visando a extremidade posterior pode aumentar o acesso do reagente às primeiras divisões nucleares e formação da faixa germinal, que ocorrem perto desta extremidade do ovo19,21. Se um está tentando manipular o genoma, com o objetivo de alcançar a transmissão somática ou germline generalizada da modificação do genoma, injeções devem ser realizadas antes da celularização, que começa aproximadamente 14 h após a postura de ovos19 . Se injetando dsRNA para derrubar níveis de mRNA, a janela de tempo para injeções deve ser determinada com base em como cedo no desenvolvimento um deseja derrubar um gene de interesse. Quando os efeitos de RNAi prováveis durar por alguma hora, dsRNA precisa de ser introduzido adiantado do tempo em que um planeia avaliar todas as mudanças no phenotype. Manter o controle do tempo decorrido durante a injeção e a progressão do desenvolvimento embrionário pode ser importante para garantir que os ovos do estágio adequado estão sendo injetados. Independentemente de qual material é injetado, atrasos no desenvolvimento após a injeção são comuns, embora o grau do atraso pode variar dependendo do injectante.
O protocolo aqui apresentado depende de um número de peças de equipamento relativamente dispendiosas. Deve ser possível, no entanto, injetar ovos com sucesso sem o uso de alguns ou até mesmo todos esses itens. Por exemplo, há uma variedade de microinjetores no mercado, e alguns podem ser menos caros do que aquele sugerido na tabela de materiais. Também é possível simplesmente usar uma seringa para injetar uma quantidade apropriada de material, embora isso levaria alguma prática. Em vez de um micromanipulador caro, um poderia usar uma variedade de materiais para segurar a agulha constante e permitir um avanço lento, controlado, e um projeto simples do Plasticine foi usado por outro22. Também pode ser possível evitar o uso de um beveller, embora em nossa experiência de chanfradura adequada pode fazer uma enorme diferença para o sucesso das injeções. Pode ser possível afiar uma agulha puxada arrastando a ponta da agulha à mão através do papel o mais fino da areia, avaliando este processo um microscópio. Independentemente, agulhas afiadas vai fazer injeções mais fácil e melhorar a capacidade de sobrevivência.
Esta técnica da injeção é flexível e pode ser usada para uma variedade de manipulações diferentes. Aqui, mostramos resultados para experimentos de modificação genômica dependentes de dsRNA e piggyBac, mas também é possível usar CRISPR/CAS ou outras abordagens com essa técnica. Nos experimentos incluídos aqui, os fenótipos resultantes eram óbvios e fáceis de avaliar. Alguns experimentos podem requerer o uso de imuno-histoquímica ou outras ferramentas de visualização, a fim de ver os efeitos da manipulação experimental. Uma alternativa às injeções é o uso de eletroporação, que pode ser usada para introduzir DNA ou outras macromoléculas em células e tecidos in vivo. O electroporation pode ser usado em uns ovos mais velhos do grilo onde os embriões tenham formado já a fim alvejar regiões específicas8, mas a injeção é mais útil quando a experimentação exige que o embrião tornando-se inteiro é alvejado. Esta técnica da injeção deve igualmente facilmente ser adaptável para o uso nos ovos de uma variedade de insetos hemimetábolos e holometábolos diferentes, idealmente melhorando a habilidade de empreender estudos comparativos significativos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa relatada neste projeto foi apoiada por um prêmio de desenvolvimento institucional (IDeA) do Instituto Nacional de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde o número de subvenção P20GM10342 a HH3, e pelo número de prêmio NSF IOS-1257217 para CGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
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