Summary
在这里, 我们提出了一个方案, 以编制凋亡胸腺细胞和腹膜巨噬细胞, 并分析了细胞内吞的效率和特定的抑制介导的抑制凋亡胸腺细胞吞没。该协议在包括人工珠子和细菌在内的其他颗粒的细胞介导清除中有着广泛的应用。
Abstract
细胞凋亡是一个自然的过程, 在胚胎发育、稳态调节、免疫耐受诱导和炎症的治疗中起着至关重要的作用。体内凋亡碎片的积累可能会引发慢性炎症反应, 随着时间的推移导致全身自身免疫性疾病。凋亡细胞清除障碍与各种自身免疫性疾病有关。凋亡清除是一个复杂的过程, 在生理条件下很少检测到。它涉及丰富的表面感受器官和信号分子。研究凋亡细胞清除过程提供了深刻的分子机制和随后的生物反应, 这可能导致新的治疗方法的发展。在这里, 我们描述了诱导凋亡胸腺细胞, 腹腔巨噬细胞的制备, 以及流式细胞仪和显微镜分析凋亡细胞清除的协议。所有细胞在一定阶段都会发生凋亡, 许多体内和循环细胞可以吸收凋亡碎片。因此, 这里描述的协议可用于许多应用, 以表征凋亡细胞结合和摄入的许多其他细胞类型。
Introduction
我们的身体每天产生1-10 个凋亡细胞。如此大量的凋亡细胞必须以免疫反应保持静止的方式清除。为了确保及时清除凋亡细胞, 多种组织驻体细胞和循环细胞发展出吞没凋亡细胞的机制 1。细胞凋亡的功能失调调节与各种炎症性疾病的发生和进展有关, 自身免疫 2。细胞凋亡在癌症发展的发病机制及其对常规治疗的抵抗力3,4中也起着至关重要的作用。去除凋亡细胞通常会促进抗炎反应, 这可能与免疫耐受5有关。凋亡细胞清除的干扰推动了自我免疫, 并有助于人类和小鼠全身自身免疫性疾病的发展。
当细胞发生凋亡时, 它们将磷脂酰丝氨酸 (PtdSer) 从内小叶暴露到膜的外小叶。然后, PtdSer 将通过表面受体被吞噬细胞识别。已经发现了十几个受体, 以识别和/或促进凋亡细胞的吞没。一般情况下, 至少有三种类型的表面受体参与凋亡细胞清除: 网络受体, 识别凋亡细胞;发痒的受体, 启动吞没;陪护受体, 促进整个过程7。TAM 受体酪氨酸激酶 (TAM Rtk) 由tyro-3、 axl 和mer 组成, 主要由免疫系统的骨髓细胞表达8。TAM Rtk 的主要功能是作为连接受体, 促进凋亡细胞和碎片的吞噬性去除。本组多年来一直在自身免疫环境下研究 TAM 介导的凋亡细胞清除。维生素 k 依赖性蛋白生长抑制特定蛋白 6 (gas6) 和蛋白 s (pros) 结合并激活 tam 受体9,10。Gas6 产生于心脏、肾脏和肺部。P s 主要是在肝脏中产生的11。TAM 识别凋亡细胞的方式是, Gas6/ProS 的 n 端与凋亡细胞上的 PtdSer 结合, Gas6/ProS 的 c 端与锚定在吞噬细胞表面的 TAM 受体结合。与其他受体一起, 凋亡细胞吞没发生 12。虽然尔可以与配体 ProS 和 Gas6 结合, 但我们发现 Gas6 似乎是 em 介导的凋亡细胞巨噬细胞吞噬的唯一配体, 而这可以被抗莫抗体13阻断.巨噬细胞是专业的吞噬细胞。巨噬细胞快速清除凋亡细胞对于抑制细胞内抗原的炎症和自身免疫反应具有重要意义。莫氏受体酪氨酸激酶是巨噬细胞吞没和凋亡细胞的有效清除14的关键。在小鼠脾脏中, Maer 主要表现为边缘区和有形体巨噬细胞13。
本文介绍的协议描述了诱导细胞凋亡的基本方法, 并演示了检测细胞凋亡过程和效率的方法。这些方案可以很容易地适应研究其他细胞类型的自泡增多症, 在不同来源的凋亡细胞吞没。
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Protocol
实验小鼠在我们的小鼠群体中进行了培育和维持。所有动物工作都是根据辛辛那提大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的指导方针进行的。
1. CFSE 标记凋亡胸腺细胞的制备
- 用 CO2 吸入使两只天真的 C57/B6 小鼠安乐死 10分钟, 并解剖打开胸腔, 用弯曲的细尖钳将胸腺取出 (拔出) 到含有 RPM1640 培养基的10毫升的组织培养培养皿中。
- 通过将整个胸腺磨成显微镜滑块的两个磨砂端, 然后通过100μm 的细胞过滤器过滤悬浮液, 获得单个细胞悬浮液。
- 收集10毫升胸腺悬浮液到一个50毫升管和离心机在 300 x g 5分钟。
- 取出上清液, 在 1x PBS 的40毫升中重新悬浮, 并用血细胞计计数细胞数。
- 以 300 x g 离心 5分钟, 并去除上清液。
- 在一个50毫升的 PBS 管中, 以 2X10 8 细胞为单细胞悬浮液 (如果超过 2 x 108个细胞, 在另一个 50 ml 管中重新悬挂另一个 20 毫升的 1 x pbs 中的其余细胞), 在 1x pbs 的20毫升中重新悬浮。
- 通过将40μl 的 cfse 库存溶液 (2.5 Mm) 移注到 1x PBS 的 20 mL 中, 在等量 (20 毫升) 的 1X PBS 中, 在等量 (20 毫升) 的情况下, 将5μm 的 CFSE 制成, 并通过将试管反转2-3 次进行混合。
- 将1.7 步 CFSE 的20毫升从步骤1.6 加入20毫升细胞悬浮液中 (CFSE 的最终浓度现在为 2.5μm)。
注: 每20毫升电池悬浮液, 需要一个20毫升的 CFSE 管。 - 将细胞和 CFSE 混合物管反转2-3 次, 在室温下在黑暗中孵育混合物, 最长为 2分钟, 然后通过加入10毫升的热灭活马血清来停止反应。
- 在室温下, 以 300 x g 离心50 毫升管混合物5分钟。
注: 如果 CFSE 标签成功, 细胞颗粒将成为浅黄色的颜色。 - 取出上清液, 重新悬浮细胞颗粒在 1x PBS 的40毫升和计数细胞数与血细胞计。
- 以 300 x g 离心细胞悬浮液 5分钟, 并丢弃上清液。
- 用 RPMI1640 培养基40毫升再次清洗细胞颗粒。
- 用 RPMI1640 组织培养基 (RPMI1640, 20 mM hepes, 10% FBS (热灭活)、20 mM 谷氨酰胺和 1x Pen/strep) 去除上清液并重新悬浮细胞, 浓度为 7 x10 6 6 细胞/mM。
注: 如果获得更多的细胞, 将需要一个单独的100毫米组织培养盘。 - 在最终浓度为1μm 的细胞悬浮培养中加入 staurosporine, 并在提供 5% CO2 的组织培养孵化器中在37°c 时培养 4小时.
2. 腹腔巨噬细胞的制备
- 在第0天用3% 的硫代乙酸酯1毫升的1毫升注入两只 C57B6 小鼠 (或实验室中的任何基因操纵小鼠)。
- 如步骤1.1 所述, 在第5天对老鼠进行安乐死, 切开并剥落腹部皮肤, 但保持腹膜完整。用连接 18 g 针的10毫升注射器将10毫升的洗涤缓冲液 (RPMI1640, 2% FBS, 0.04% EDTA) 推入腹腔腔, 冲洗腹腔。
- 用相同的针管慢慢回收洗涤缓冲液, 并将洗涤缓冲液收集到50毫升管中 (详情见詹森实验室第15条)。
- 用 1x PBS 清洗腹膜灌胃两次, 以 2 x10 6 细胞和 aliquot 500μl 的密度将 RPMI1640 组织培养基中的腹腔巨噬细胞重新悬浮到24井板的每口井中。将钢板放在组织培养孵化器中2小时。
- 通过吸气和更换500μl 的新鲜培养基, 两次取出漂浮细胞。
- 或者, 加入 TAM 受体酪氨酸抑制剂 RXDX-106, 在图传说中显示的浓度到巨噬细胞培养的每口井和孵育2小时。
3. 腹腔巨噬细胞与凋亡胸腺细胞的共培养
- 从步骤1收集凋亡胸腺细胞, 并用 RPMI1640 培养基清洗三次。在此阶段, 用附件素 v函7-AAD 试剂盒可以测量凋亡诱导的效率。
- 根据实验安排 (例如, 见图 1), 将 0-12 x10 6个细胞 (500μl 介质) 从协议 #2 分配到巨噬细胞培养物的每口井中 。这使得24井板的每口井的整个培养体积为1毫升。在凋亡胸腺细胞加入之前, 将阻断抗体添加到培养中。
- 在提供 5% CO2 的组织培养孵化器中, 在37°c 下培养细胞混合物 4小时.
- 用 1x PBS (含 500Μm EDTA) 清洗每个培养物的油井两次, 以去除自由漂浮的凋亡细胞。
- 在这一阶段用 CD11b-pe 染色板状巨噬细胞。
- 用染色缓冲液 (1x PBS, 1% BSA) 清洗一次板状巨噬细胞。
- 在每口井中加入200Μl 含有 2μl Cd11b-pe 的染色缓冲液。
- 在4°c 下将板材孵化20分钟。
- 用染色缓冲液清洗每口井三次。
- 加入200Μl 染色缓冲液, 并在荧光显微镜下进行印版图像分析。
- 或者, 在 PBS 中加入1毫升利多卡因, 在37°c 下孵育 10分钟, 分离板状巨噬细胞。
- 用重复移液分离板状巨噬细胞。
- 将巨噬细胞悬浮液从24井板的每口井中转移到一个5毫升的圆底流式细胞仪管中。
- 以 300 x g 离心5分钟。
- 取出上清液, 加入200Μl 的染色缓冲液, 其中含有2μl 的 Cd11b-pe (1: 200 染色缓冲液稀释)。
- 在4°c 染色缓冲液中培养细胞悬浮液20分钟。
- 用染色缓冲液清洗细胞悬浮液两次。
- 加入200Μl 染色缓冲液, 用流式细胞仪进行流式细胞仪分析, 并分析 CFSE 阳性巨噬细胞的百分比。
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Representative Results
腹膜巨噬细胞介导的凋亡胸腺细胞吞没分析.按照该方案的描述, 制备并联合培养腹腔巨噬细胞和凋亡细胞。巨噬细胞在冰上被 pe 共轭抗 CD11b 抗体分离并染色20分钟。然后用流式细胞仪清洗和处理巨噬细胞。如图所示, 当培养物中没有添加凋亡细胞时, 右下角象限中没有 CFSE 阳性巨噬细胞 (图 1 a 和图 2, 第一面板)。硫勒糖刺激的腹腔巨噬细胞具有吸收凋亡细胞的可变能力。多达30% 的巨噬细胞在 CFSE 通道中呈阳性, 表明它们在本实验中摄入了 cfse 标记的凋亡细胞 (图 1)。值得注意的是, CFS 阳性巨噬细胞由于强度不同而在右下角象限中扩散, 这表明巨噬细胞内的凋亡细胞数量不同。因此, 对巨噬细胞吞噬凋亡细胞的微观观察对于研究巨噬细胞吸收凋亡细胞的能力至关重要 (图 2)。凋亡细胞与巨噬细胞的比例较高, 不仅增加了巨噬细胞进入凋亡细胞的数量, 而且提高了巨噬细胞摄入更多凋亡细胞的能力 (图 2)。
莫氏阻塞对外泡细胞增多症的剂量依赖性抑制。
在另一组实验中, 我们发现约15% 的巨噬细胞在巨噬细胞培养中加入 CFSE 阳性 (定量 6:1) 为 4小时, 表明它们是吞噬巨噬细胞 (图 3 )Er对巨噬细胞的一个作用是通过桥接分子 gas6 识别和介导凋亡细胞的吞噬。为了测试因梅尔抑制而产生的泡泡性的百分比, 我们在培养中加入了抗莫细胞抗体, 以阻断莫代介导的泡泡性。Er 抗体以剂量依赖性的方式阻断巨噬细胞的吞噬细胞分泌物 (图 3c,图 3d), 整体阻断可能占当前环境中吞噬效率的30% 左右 (图 3), 这一数据也在我们之前与 Er 淘汰赛巨噬细胞13的研究中得到了证实。然后, 我们用新获得 FDA 批准的 TAM 受体抑制剂 RXDX-106 测试了抑制效果, 该抑制剂抑制具有不同亲和力的所有 TAM 受体 (Axl>>Tyro3>Mer)。在与凋亡胸腺细胞共培养前 2小时, 将 RXDX-106 添加到巨噬细胞培养中。如图 4所示, Rxdx-106 以剂量依赖性的方式抑制巨噬细胞的吸附性。饱和抑制浓度约为 100 nM (图 4, 实线), 这种浓度似乎比缺乏摩尔 (图 4虚线) 或 er 抗体 (图3, 面板 d) 本身更有效。由于巨噬细胞表达表面16上的所有三个 tam 受体, 预计将看到较高浓度的 rxdx-106 (超过 100 nm) 将阻止所有三个受体, 因此, 将更有效地阻止泡泡性比针对一个单一的 TAM 受体, m。
图 1.腹腔巨噬细胞吞噬凋亡胸腺细胞的百分比。用 1 mm 的足孢菌素孵育4小时诱导凋亡胸腺细胞, 并按图面板所示的比例加入巨噬细胞培养: (a) 1: 0;(B) 1: 1;(C) 1: 2;(D) 1: 4;(E) 1: 6;(F) 1: 8;(G) 1:10;(H) 1:12。数据是用流式细胞仪获得的。利用与流式细胞仪相关的软件对吞噬巨噬细胞的百分比进行了分析。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2.泡泡症的显微分析.体外细胞增多症如图 1所示。用 CD11b-pe 原位染色吞噬巨噬细胞, 用甲醛固定, 并进行评价。利用荧光显微镜获得图像, 并使用与显微镜相关的软件进行分析。代表插入被数字放大, 并显示在下面的每个图像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3.抗莫抗体抑制腹腔巨噬细胞的兴奋性。按照该方案的描述, 制备了凋亡细胞, 并与巨噬细胞共培养了4小时。抗 er ab 在与凋亡细胞共培养前立即加入巨噬细胞培养。然后用抗小鼠 Cd11b-pe 抗体在冰上分离和染色 20分钟, 获得并分析数据, 如图1所示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4.RXDX-106 介导抑制巨噬细胞的泡泡.上胚泡被设置为如图 3所示。在与凋亡胸腺细胞共培养前两小时添加 RXDX-106。腹腔巨噬细胞的脑缺相似, 为对照组。利用流式细胞仪软件对 CD11b 阳性细胞的吞噬细胞百分比进行了采集和分析。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
细胞凋亡是一个高度保守的细胞死亡过程, 涉及许多信号级联, 并诱导蛋白质的表达, 分泌和运输。细胞凋亡常与细胞形态变化有关 17。凋亡细胞主动释放细胞因子和趋化因子, 吸引吞噬细胞迁移到该位点, 并在严格控制下启动吞没过程18。另一方面, 坏死细胞死亡释放引发炎症反应的危险信号1。凋亡细胞的有效或长时间清除会导致这些细胞的继发性坏死 19。因此, 在细胞凋亡诱导中的时机是非常关键的实验。诱导细胞凋亡的方法有很多种。然而, 诱导的持续时间和强度取决于细胞类型。我们建议建立滴定实验, 以确定最大 (90-95) 的最佳条件细胞凋亡的产生。采用 Annexin-V/7-AAD 凋亡检测试剂盒, 并在实验室中遵循说明, 对凋亡效率进行评价。我们的实验室在过去尝试了两种不同的方法来诱导胸腺细胞凋亡。伽玛辐射似乎是一种更好的方法, 因为它在培养中没有化学残留, 导致坏死细胞死亡的情况很少。我们在 RPMI1640 培养基中, 我们将胸腺细胞暴露在500拉-辐射中, 然后是4-h 培养。我们观察到约95% 的凋亡胸腺细胞13。当散热器不可用时, 我们诱导胸腺细胞在培养4小时内与1Μm 的 stauro肽发生凋亡 (步骤 1.15)。原代细胞通常对细胞凋亡诱导更为敏感。在与吞噬细胞共同培养之前, 还需要采取广泛的清洗步骤来去除培养中的化学物质。有许多方法可以标记凋亡细胞。虽然毒性与高浓度有关, 但当仔细优化21时, CFSE 会非常有效地保留在细胞质中。pHrodo 是一种酸敏染料, 随着环境 ph 值的降低, 荧光会增加。由于噬菌体溶酶体的 pH 值较低, 在检测22中, 吞噬细胞凋亡细胞可以很容易地与物理连接而不吞没凋亡细胞区分开来。
众多表面受体 (TAM 受体、甘露糖受体、整合素 (cd11bcd18)、清除剂受体、Fc 受体等) 允许吞噬细胞区分自我和病原体, 并区分随后的反应23。不同的受体一起工作, 以完成一个相当复杂的过程。阻塞性受体可能会导致吞噬性的部分抑制。初级巨噬细胞可通过不同的方法 (骨髓源巨噬细胞、腹腔巨噬细胞、脾脏巨噬细胞等) 从不同的资源中制备。聚糖诱导的巨噬细胞的优点是巨噬细胞的吞噬表型偏斜;缺点是硫代甘油需要在黑暗中陈酿至少3个月。然而, 硫代甘油酸溶液的保质期为2年。解决方案的一个恒定的库存应该克服这个缺点。在腹腔巨噬细胞的制备过程中, 腹腔巨噬细胞采集中的微量红细胞不应影响实验, 因为在2小时的巨噬细胞培养后, 红血球将与漂浮细胞一起被冲走。大量的红细胞 (可见颗粒) 可能需要使用 ACK 裂解缓冲液进行治疗。巨噬细胞往往紧紧地粘附在培养表面。文献中引用了不同的方法, 从表面24 中分离粘附细胞。基于酶的分离产生最高水平的细胞恢复, 但可能会损害表面受体, 损害细胞功能和相关的分析。表面受体的改变也可能影响受体为基础的流式细胞术分析。利多卡因钙离子通道25 的阻断, 导致细胞形态转变为更球形的构象。在我们的实验中, 它是将巨噬细胞从表面分离而无明显损伤的最佳方法。
含有凋亡细胞的巨噬细胞可以通过流式细胞仪或显微检测进行分析。流式细胞仪可以在短时间内用于分析大量细胞, 并可通过对特定表面或细胞质蛋白的抗体差异化染色来进一步识别细胞亚型。在共发分裂系统中, 凋亡细胞数量的最佳浓度 (比率) 也可以通过流式细胞仪分析来确定。与流式细胞仪分析相比, 显微分析在细胞数量和差异染色方面存在局限性。然而, 荧光显微镜提供了深入的信息。对巨噬细胞吞噬凋亡的微观分析对于研究巨噬细胞吸收凋亡细胞的能力和动力学具有重要意义。整个摄入过程的延时可能会提供详细的信息, 说明吞没一个凋亡细胞需要多长时间, 以及有多少凋亡细胞可以同时摄入一个巨噬细胞。吞噬巨噬细胞也可以通过西方印迹进行分析, 以研究被吞没过程调节的信号分子。与这一过程相关的基因表达谱可以通过实时 PCR 进行评估。
最后, 该方案为泡泡症的实验分析提供了一个基本平台。其他细胞类型 (树突状细胞、系膜细胞、上皮细胞) 也可以在其居住地吸收凋亡细胞。这些细胞有偏好利用不同的受体识别和启动凋亡细胞清除 2的过程。整体吞噬效率可能受几个因素的影响, 包括实验因素和细胞类型的特异性因素。文献中报道的不同结果可能是由于 1) 共同文化的持续时间;2) 吞噬细胞和凋亡细胞的来源和制备;3) 将凋亡细胞与吞噬细胞分离的方法。这里描述的协议可能适用于其他细胞的吞噬电位。可能需要进行优化, 以最大限度地发挥目标细胞的吞噬潜力。我们分析了肾系膜细胞吞噬的凋亡的凋亡胸腺细胞产生的相同的方式, 在本协议中描述。中性粒细胞通过消除病原体在先天免疫系统中发挥着关键作用。流式细胞仪可通过流式细胞仪分析标记细菌或颗粒的中性粒细胞吞噬。然而, 中性粒细胞的半衰期很短 (6-8), 细菌或真菌的中性粒细胞吞噬发生在几秒钟到 27分钟,28。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
邵实验室的研究得到了医学院研究创新奖和辛辛那提大学内科初级教师试点奖的支持, 并获得了 NIDDK/nih 颁发的 DK K01_095067。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
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