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Immunology and Infection

Analyse expérimentale de l’Engloutement des thymocytes apoptotiques par les macrophages

Published: May 24, 2019 doi: 10.3791/59731
Automatic Translation
1, 1
1Division of Immunology, Allergy, and Rheumatology, Department of Internal Medicine, College of Medicine, University of Cincinnati

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour préparer les thymocytes apoptotiques et les macrophages péritonéaux et analyser l’efficacité de l’effocytose et le blocage spécifique par inhibiteur de l’engloutement des thymocytes apoptotiques. Ce protocole a une application large dans le dégagement de cellules-médiation d’autres particules y compris les billes artificielles et les bactéries.

Abstract

L’apoptose cellulaire est un processus naturel et joue un rôle crucial dans le développement embryonnaire, la régulation homéostatique, l’induction de la tolérance immunitaire et la résolution de l’inflammation. L’accumulation de débris apoptotiques dans le corps peut déclencher des réactions inflammatoires chroniques qui conduisent à des maladies auto-immunes systémiques au fil du temps. Une altération de la clairance des cellules apoptotiques a été impliquée dans une variété de maladies auto-immunes. La clairance apoptotique est un processus complexe rarement détecté dans des conditions physiologiques. Il implique des récepteurs de surface abondants et des molécules de signalisation. L’étude du processus de clairance des cellules apoptotiques fournit des mécanismes moléculaires perspicaces et des réponses biologiques ultérieures, ce qui peut conduire au développement de nouvelles thérapies. Ici, nous décrivons les protocoles pour l’induction des thymocytes apoptotiques, la préparation des macrophages péritonéaux, et l’analyse de la clairance des cellules apoptotiques par cytométrie en flux et microscopie. Toutes les cellules seront soumises à une apoptose à un certain stade, et de nombreuses cellules résidentielles et circulantes peuvent absorber les débris apoptotiques. Par conséquent, le protocole décrit ici peut être utilisé dans de nombreuses applications pour caractériser la liaison de cellules apoptotiques et l’ingestion par de nombreux autres types de cellules.

Introduction

Notre corps génère 1-10 milliards de cellules apoptotiques sur une base quotidienne. Un tel grand nombre de cellules apoptotiques doit être effacé de manière à ce que les réponses immunitaires demeurent quiescentes. Pour assurer le dégagement des cellules apoptotiques en temps opportun, de nombreux types de cellules résidentes de tissu et de cellules circulantes développent des mécanismes pour engloutir les cellules apoptotiques1. La régulation dysfonctionnelle de l’apoptose a été impliquée dans l’apparition et la progression de diverses maladies inflammatoires et de l’auto-immunité2. L’apoptose joue également un rôle crucial dans la pathogenèse du développement du cancer et sa résistance subséquente aux traitements conventionnels3,4. L’élimination des cellules apoptotiques favorise généralement une réponse anti-inflammatoire, qui peut être liée à la tolérance immunologique5. La perturbation de la clairance des cellules apoptotiques entraîne l’auto-immunisation et contribue au développement de maladies auto-immunes systémiques chez l’homme et la souris6.

Lorsque les cellules subissent l’apoptose, elles exposent la phosphatidylsérine (PtdSer) de la foliole interne à la foliole externe de la membrane. Le PtdSer sera alors reconnu par les phagocytes par les récepteurs de surface. Plus d’une douzaine de récepteurs ont été identifiés pour reconnaître et/ou faciliter l’engloutement des cellules apoptotiques. En général, il existe au moins trois types de récepteurs de surface impliqués dans le dégagement des cellules apoptotiques: récepteurs d’attachement, reconnaître les cellules apoptotiques; les récepteurs de chatouillement, initier l’engulfment; les récepteurs de chaperonner, facilitent l’ensemble du processus7. Les tyrosine kinases du récepteur TAM (TAM RTKs) consistent en Tyro-3, AXL et Mer et sont principalement exprimées par les cellules myéloïdes du système immunitaire8. La fonction principale de TAM RTKs est de servir de récepteurs d’attachement, facilitant l’élimination phagocytaire des cellules apoptotiques et des débris. Notre groupe a étudié la clairance cellulaire apoptotique médiée par TAM dans le cadre de l’auto-immunité pendant de nombreuses années. La protéine dépendante de la vitamine K-dépendant de l’arrestation de protéine 6 (Gas6) et de protéine S (ProS) se lie à et active les récepteurs de Tam9,10. Gas6 est produit dans le coeur, les reins et les poumons. Les ProS sont principalement produits dans le foie11. TAM reconnaît des cellules apoptotiques de telle sorte que le N-terminal de Gas6/ProS se lie au PtdSer sur une cellule apoptotique et le C-terminal de Gas6/ProS se lie aux récepteurs TAM qui ancrés sur la surface des phagocytes. Avec les autres récepteurs, l’flammes des cellules apoptotiques se produit12. Bien que mer puisse se lier à la fois pour les ligands ProS et Gas6, nous avons constaté que Gas6 semble être le seul ligand pour la phagocytose de macrophages de cellules apoptotiques médiées par mer, qui peut être bloquée par l’anticorps anti-mer13. Les macrophages sont des phagocytes professionnels. L’élimination rapide des cellules apoptotiques par les macrophages est importante pour l’inhibition de l’inflammation et des réponses auto-immunes contre les antigènes intracellulaires. Le récepteur de la mer tyrosine kinase est essentiel pour l’engloutement des macrophages et une clairance efficace des cellules apoptotiques14. Dans la rate de souris, mer exprime principalement sur la zone marginale et les macrophages corporels13.

Le protocole présenté ici décrit une méthode de base pour induire l’apoptose cellulaire et de démontrer des moyens de mesurer le processus et l’efficacité de l’effocytose. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés pour étudier l’effocytose par d’autres types de cellules dans l’flammes de cellules apoptotiques d’origines différentes.

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Protocol

Des souris expérimentales ont été élevées et maintenues dans notre colonie de souris. Tous les travaux sur les animaux ont été menés conformément aux directives du Comité institutionnel de l’Université de Cincinnati sur les soins et l’utilisation des animaux (IACUC).

1. préparation des thymocytes apoptotiques étiquetés CFSE

  1. Euthanasier deux souris C57/B6 naïves par CO2 inhalation pendant 10 min et disséquer pour ouvrir la cavité thoracique, enlever (retirer) le thymus avec des pinces fines incurvées dans la boîte de Petri de culture tissulaire contenant 10 ml de milieu RPMI1640.
  2. Obtenir une suspension à une seule cellule en broyant le thymus entier contre deux extrémités givrées des lames du microscope, puis filtrer la suspension à l’aide de la passoire à cellules 100 μM.
  3. Prélever la suspension de thymus de 10 mL dans un tube de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
  4. Retirer le surnageant, resuspendre dans 40 mL de 1x PBS, et compter les nombres de cellules avec un hémocytomètre.
  5. Centrifugez à 300 x g pendant 5 min et enlevez le surnageant.
  6. Resuspendre dans 20 mL de 1x PBS dans un tube de 50 mL comme suspension à une seule cellule avec jusqu’à 2 x 108 cellules (si plus de 2 x 108 cellules, resuspendre le reste des cellules dans un autre 20 ml de 1 x PBS dans un tube de 50 ml différent).
  7. Faire 5 μM de CFSE en volume égal (20 mL) de 1x PBS dans un tube séparé de 50 mL en pipetant 40 μL de solution d’action de CFSE (2,5 mM) dans 20 mL de 1x PBS et bien mélanger en invertant le tube 2-3 fois.
  8. Ajouter les 20 mL de CFSE de l’étape 1,7 dans les 20 mL de suspension cellulaire de l’étape 1,6 (la concentration finale de CFSE est maintenant de 2,5 μM).
    Remarque: pour chaque suspension de cellule de 20 mL, un tube de 20 mL de CFSE est nécessaire.
  9. Inversez la cellule et le tube de mélange de CFSE 2-3 fois et Incubez le mélange dans l’obscurité à température ambiante pendant un maximum de 2 min, puis arrêtez la réaction en ajoutant 10 mL de sérum de cheval inactivé à la chaleur.
  10. Centrifuger le mélange de tube de 50 mL à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
    Remarque: si l’étiquetage CFSE réussit, le culot de la cellule deviendra de couleur jaune clair.
  11. Retirer le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire dans 40 mL de 1x PBS et compter les nombres de cellules avec un hémocytomètre.
  12. Centrifugez la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min et jetez le surnageant.
  13. Laver à nouveau le culot de la cellule avec 40 mL de milieu RPMI1640.
  14. Enlevez le surnageant et resuspendez les cellules avec le milieu de culture tissulaire RPMI1640 (RPMI1640, 20 mm HEPES, 10% FBS (chaleur inactivée), 20 mM de glutamine et 1x PEN/STREP) à une concentration de 7 x 106 cellules/ml dans un plat de culture tissulaire de 100 mm.
    Remarque: si plus de cellules sont obtenues, un plat de culture de tissu de 100 mm séparé sera nécessaire.
  15. Ajouter la la staurosporine dans la culture de suspension cellulaire à une concentration finale de 1 μM et la culture pendant 4 h à 37 ° c dans un incubateur de culture tissulaire fourni avec 5% de CO2.

2. préparation des macrophages péritonéaux

  1. Injecter deux souris C57B6 (ou toute souris manipulée par un gène dans le laboratoire) par voie intrapéritonéale avec 1 ml de thioglycolate vieilli à 3% au jour 0.
  2. Euthanasier les souris au jour 5 comme à l’étape 1,1, couper et peler ouvrir la peau abdominale, mais laisser le péritoneum intact. Rincer la cavité péritonéale en poussant rapidement 10 mL de tampon de lavage (RPMI1640% FBS, 0,04% EDTA) dans la cavité péritonéale à l’aide d’une seringue de 10 mL attachée avec une aiguille de 18 G.
  3. Récupérez lentement le tampon de lavage avec la même aiguille/seringue et collectez le tampon de lavage dans un tube de 50 mL (les détails se rapportent à l’article15du laboratoire Janssen).
  4. Lavez le gavage péritonéal deux fois avec 1x PBS, Resuspendez les macrophages péritonéaux dans le milieu de culture tissulaire RPMI1640 à une densité de 2 x 106 cellules/ml et aliquote 500 μl dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Laisser la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant 2 h.
  5. Retirer les cellules flottantes en aspirant et en remplaçant avec 500 μL de milieu de culture fraîche, deux fois.
  6. Eventuellement, ajouter l’inhibiteur de tyrosine de récepteur de TAM, RXDX-106, aux concentrations indiquées dans les légendes de figure dans chaque puits de la culture de macrophages et incuber pendant 2 h.

3. co-culture des macrophages péritonéaux avec des thymocytes apoptotiques

  1. Collectez les thymocytes apoptotiques de l’étape 1 et lavez trois fois avec le milieu RPMI1640. L’efficacité de l’induction apoptotique peut être mesurée à ce stade avec le kit Annexin V/7-AAD.
  2. Distribuer 0-12 x 106 cellules (en 500 μl de milieu) dans chaque puits des cultures de macrophages du protocole #2, selon l’arrangement expérimental (p. ex., voir la figure 1). Cela rend le volume de culture entier de 1 mL dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Ajouter l’anticorps bloquant dans la culture immédiatement avant l’addition de thymocytes apoptotiques.
  3. Culture du mélange cellulaire à 37 ° c pendant 4 h dans un incubateur de culture tissulaire fourni avec 5% de CO2.
  4. Lavez chaque puits de la culture avec 1x PBS (contenant 500 μM d’EDTA) deux fois pour enlever les cellules apoptotiques flottantes.
  5. Tache les macrophages liés à la plaque avec CD11b-PE à ce stade.
    1. Lavez les macrophages liés à la plaque avec un tampon de coloration (1x PBS, 1% BSA) une fois.
    2. Ajouter 200 μL de tampon de coloration contenant 2 μL de CD11b-PE dans chaque puits.
    3. Incuber la plaque à 4 ° c pendant 20 min.
    4. Lavez chaque puits de la plaque trois fois avec le tampon de coloration.
    5. Ajouter 200 μL de tampon de coloration et continuer la plaque pour l’analyse d’image sous le microscope fluorescent.
  6. Alternativement, détachez les macrophages liés à la plaque en ajoutant 1 mL de lidocaïne à 1% dans le PBS et en incubant pendant 10 min à 37 ° c.
  7. Détachez les macrophages liés à la plaque avec le pipetage répété.
  8. Transférer la suspension de macrophages dans un tube FACS à fond rond de 5 mL de chaque puits de la plaque de 24 puits.
  9. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
  10. Retirer le surnageant et ajouter 200 μL de tampon de coloration contenant 2 μL de CD11b-PE (1:200 dilution dans le tampon de coloration).
  11. Incuber la suspension cellulaire dans le tampon de coloration à 4 ° c pendant 20 min.
  12. Lavez la suspension cellulaire deux fois avec un tampon de coloration.
  13. Ajouter 200 μL de tampon de coloration et procéder à l’analyse FACS avec un cytomètre de flux et analyser le pourcentage de macrophages de positivité CFSE.

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Representative Results

Analyse de l’engloutement de thymocytes apoptotiques par le macrophage péritonéal. Les macrophages péritonéaux et les cellules apoptotiques ont été préparés et co-cultivés comme décrit dans le protocole. Les macrophages ont été détachés et colorés avec l’anticorps anti-CD11b conjugué au PE pendant 20 min sur la glace. Les macrophages ont ensuite été lavés et transformés dans un cytomètre à flux. Comme on le voit, il n’y a pas de macrophages positif CFSE dans le quadrant inférieur droit quand aucune cellule apoptotique n’a été ajoutée à la culture (figure 1a et figure 2, premier panneau). Les macrophages péritonéaux stimulés par le thioglycollate ont la capacité variable d’engloutir des cellules apoptotiques. Jusqu’à 30% des macrophages ont montré un résultat positif dans le canal CFSE, ce qui indique qu’ils ont ingéré des cellules apoptotiques étiquetées par CFSE dans cette expérience (figure 1). Il est intéressant de noter que les macrophages positifs CFSE répartis dans le quadrant inférieur droit en raison de différentes intensités, ce qui indique que le nombre de cellules apoptotiques dans les macrophages est différent. Par conséquent, l’observation microscopique de l’engloutement des macrophages de cellules apoptotiques est essentielle pour étudier la capacité des macrophiles à ingérer des cellules apoptotiques (figure 2). Le ratio plus élevé des cellules apoptotiques aux macrophages augmente non seulement le nombre de macrophages ingérer des cellules apoptotiques mais améliore également la capacité des macrophages à ingérer plus de cellules apoptotiques (figure 2).

Inhibition dose-dépendante de l’effocytose par blocage de mer.
Dans un autre ensemble d’expériences, nous avons constaté qu’environ 15% des macrophages sont devenus positifs pour le CFSE lorsque les thymocytes apoptotiques marqués par le CFSE (ration de 6:1) ont été ajoutés à la culture des macrophages pendant 4 h, ce qui indique qu’ils sont les macrophages phagocytaires (figure 3 B). une des fonctions de mer sur les macrophages est de reconnaître et de médier la phagocytose des cellules apoptotiques à travers la molécule de pontage, Gas6. Pour tester le pourcentage d’effocytose attribué par l’inhibition de la mer, nous avons ajouté des anticorps anti-mer dans la culture pour bloquer l’effocytose induite par la mer. L’anticorps de mer bloque le macrophages efferocytosis de façon dose-dépendante (figure 3C, figure 3D) et le blocage global peut représenter environ 30% de l’efficacité de l’effocytose dans le réglage actuel (figure 3) , Ces données ont également été confirmées dans notre étude précédente avec les macrophages de Knockout de mer13. Nous avons ensuite testé l’efficacité de l’inhibition avec le nouvel inhibiteur de récepteur de TAM approuvé par la FDA, RXDX-106, qui inhibe tous les récepteurs de TAM avec des affinités différentes (Axl > > Tyro3 > mer). RXDX-106 a été ajouté dans la culture macrophages 2 heures avant la co-incubation avec des thymocytes apoptotiques. Comme le montre la figure 4, le rxdx-106 inhibe l’effocytose des macrophages d’une manière dépendante de la dose. La concentration d’inhibition saturée était d’environ 100 nM (figure 4, ligne solide), une concentration qui semble être plus efficace que la carence en mer (figure 4 en pointillés) ou l’anticorps mer (figure 3, Panel D) seul. Depuis macrophages exprime les trois récepteurs TAM sur la surface16, il est prévu de voir que des concentrations plus élevées de rxdx-106 (plus de 100 nm) bloquera les trois récepteurs, et donc, sera plus efficace dans le blocage de l’effocytose que ciblant un seul récepteur TAM, mer.

Figure 1
Figure 1 . Pourcentage de phagocytose des thymocytes apoptotiques par les macrophages péritonéaux. Les thymocytes apoptotiques ont été induits en incubant avec 1 mm de la staurosporine pendant 4 h et ajoutés dans la culture des macrophages à un ratio tel qu’indiqué dans les panneaux de figures: (a) 1:0; B) 1:1; C) 1:2; D) 1:4; E) 1:6; F) 1:8; G) 1:10; H) 1:12. Les données ont été acquises avec un cytomètre de flux. Le pourcentage de macrophages phagocytaires a été analysé à l’aide du logiciel associé au cytomètre de flux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
La figure 2 . Analyse microscopique de l’effocytose. L’effocytose a été préparée comme dans la figure 1. Les macrophages phagocytaires ont été tachés in situ sur la plaque avec CD11b-PE, fixés avec du paraformaldéhyde, et évalués. Les images ont été acquises à l’aide du microscope fluorescent et analysées avec le logiciel associé au microscope. Les insertions représentatives ont été agrandies numériquement et montrées ci-dessous dans chaque image. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 . Inhibition du macrophages péritonéal efferocytosis par un anticorps anti-mer. Les cellules apoptotiques ont été préparées et co-cultivées avec des macrophages pendant 4 h comme décrit dans le protocole. Anti-mer AB a été ajouté dans la culture macrophages immédiatement avant la co-culture avec des cellules apoptotiques. Les macrophages phagocytaires ont été ensuite détachés et colorés avec l’anticorps anti-souris CD11b-PE sur la glace pendant 20 min. les données ont été acquises et analysées comme dans la figure 1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 . RXDX-106 inhibition induite par la macrophages efferocytosis. Efferocytosis a été mis en place comme décrit dans la figure 3. RXDX-106 a été ajouté deux heures avant la co-culture avec des thymocytes apoptotiques. Des macrophages péritonéaux déficients en mer ont été préparés de la même façon et ont servi de groupe témoin. Les données ont été acquises et le pourcentage de macrophages phagocytaires ont été contrôlés sur des cellules positives de CD11b et analysés à l’aide du logiciel de cytomètre de flux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

L’apoptose est un processus de mort cellulaire hautement conservé qui implique de nombreuses cascades de signaux et induit l’expression des protéines, la sécrétion et le transport. L’apoptose est souvent associée à des changements de morphologie cellulaire17. Les cellules apoptotiques libèrent activement des cytokines et des chimiokines qui attirent les phagocytes pour migrer vers le site et initier le processus d’engloutement, une voie extrêmement complexe sous contrôle serré18. D’autre part, la mort des cellules nécrotiques libère des signaux de danger qui déclenchent des réponses inflammatoires1. Une clairance défectueuse ou prolongée des cellules apoptotiques conduira à une nécrose secondaire de ces cellules19. Par conséquent, le timing dans l’induction de l’apoptose est très critique dans l’expérience. Il existe de nombreuses façons d’induire l’apoptose cellulaire20. Cependant, la durée et la force de l’induction sont dépendantes du type de cellule. Nous recommandons de mettre en place une expérience de titrage pour déterminer l’état optimal du maximum (90-95%) production d’apoptose. Le kit de détection apoptotique Annexin-V/7-AAD a été utilisé et les instructions ont été suivies dans notre laboratoire pour évaluer l’efficacité apoptotique. Notre laboratoire a essayé deux façons différentes d’induire l’apoptose des thymocytes dans le passé. Le rayonnement gamma semble être une meilleure méthode, car il n’a pas de résidus chimiques dans la culture et induit peu de décès de cellules nécrotiques. Nous exposons les thymocytes à 500 rad de g-rayonnement suivi de la culture 4-h dans le milieu RPMI1640. Nous avons observé environ 95% de thymocytes apoptotiques13. Lorsqu’un radiateur n’est pas disponible, nous avons induit des thymocytes à subir une apoptose avec 1 μM de la staurosporine dans la culture pendant 4 h (étape 1,15). Les cellules primaires sont généralement plus sensibles à l’induction de l’apoptose. Des étapes de lavage étendues sont également nécessaires pour éliminer les produits chimiques de la culture avant la co-culture avec les phagocytes. Il existe de nombreuses façons d’étiqueter les cellules apoptotiques. Bien que la toxicité ait été associée à une concentration élevée, le CFSE est maintenu très efficacement dans le cytoplasme lorsqu’il est soigneusement optimisé21. le pHrodo est un colorant sensible à l’acide, qui augmente en fluorescence à mesure que le pH de l’environnement diminue. En raison du faible pH de la phagolysosome, les cellules apoptotiques phagocytisées peuvent être facilement distinguées des cellules apoptotiques physiquement attachées mais non englouties dans le test22.

De nombreux récepteurs de surface (récepteurs TAM, récepteurs de mannose, intégrines (CD11b/CD18), récepteurs du Trésor, récepteurs FC, et al) permettent aux phagocytes de distinguer l’individu des agents pathogènes et de discriminer les réponses ultérieures23. Différents récepteurs travaillent ensemble pour terminer un processus plutôt complexe. Le ou les récepteurs de blocage se traduit probablement par une inhibition partielle de la phagocytose. Les macrophages primaires peuvent être préparés à partir de différentes ressources avec diverses méthodes (macrophages dérivés de la moelle osseuse, macrophages péritonéaux, macrophages de la rate, et al.). L’avantage des macrophages induits par le thioglycollate est le phénotype phagocytaire biaisé des macrophages; l’inconvénient est que le thioglycolate doit être vieilli dans l’obscurité pendant au moins 3 mois. Cependant, la solution de thioglycolate a une durée de conservation de 2 ans. Un stock constant de la solution devrait surmonter ce désavantage. Dans la préparation des macrophages péritonéaux, la quantité de traces de globules rouges dans la collection de macrophages péritonéaux ne devrait pas affecter l’expérience, car ils vont être lavés avec les cellules flottantes après 2 h de culture macrophages. Une grande quantité de globules rouges (granulés visibles) peut nécessiter un traitement avec ACK lyse tampon. Les macrophages ont tendance à adhérer étroitement à la surface de la culture. Différentes méthodes ont été citées dans la littérature pour détacher les cellules d’adhérence de la surface24. Le détachement enzymatique produit les plus hauts niveaux de rétablissement cellulaire, mais peut endommager les récepteurs de surface, altérer la fonction cellulaire et les analyses associées. L’altération des récepteurs de surface peut également affecter l’analyse de cytométrie de flux basée sur les récepteurs. La lidocaïne provoque une modification de la morphologie des cellules à une conformation plus sphérique due au blocus des canaux d’ions calciques25. C’est la meilleure façon de détacher les macrophages de la surface sans aucun dommage notable dans notre expérience.

Les macrophages contenant des cellules apoptotiques peuvent être analysés par des tests basés sur la cytométrie en flux ou par microscopie. FACS peut être appliqué pour analyser un grand nombre de cellules dans un court laps de temps et peut encore identifier les sous-types de cellules par coloration différentielle avec des anticorps contre la surface spécifique ou les protéines cytoplasmiques. Une concentration optimale (ratio) des nombres de cellules apoptotiques dans le système de co-culture peut également être décidée par l’analyse FACS. L’analyse microscopique a des limitations concernant les nombres cellulaires et la coloration différentielle par rapport à l’analyse FACS. Cependant, la microscopie fluorescente fournit des informations approfondies. L’analyse microscopique de l’engloutement des macrophages de cellules apoptotiques est essentielle pour étudier la capacité et la cinétique des macrophiles à ingérer les cellules apoptotiques. Un laps de temps de la progression de l’ingestion entière peut fournir des informations détaillées sur le temps qu’il faut pour engloutir une cellule apoptotique, et combien de cellules apoptotiques peuvent un seul macrophages ingérer simultanément. Les macrophages phagocytaires peuvent également être analysés par Blot occidental pour enquêter sur les molécules de signalisation régulées par le processus d’flammes. Les profils d’expression génique associés à ce processus peuvent être évalués par PCR en temps réel.

Enfin, ce protocole fournit une plate-forme de base dans l’analyse expérimentale de l’effocytose. D’autres types de cellules (cellules dendritiques, cellules mesangiales, cellules épithéliales) peuvent également fonctionner à l’absorption des cellules apoptotiques à leurs sites résidentiels. Ces cellules ont des préférences dans l’utilisation de différents récepteurs pour reconnaître et initier le processus de clairance cellulaire apoptotique2. L’efficacité phagocytaire globale peut être influencée par plusieurs facteurs, y compris des facteurs expérimentaux et des types de cellules spécifiques. Les résultats variables rapportés dans la littérature sont probablement dus à 1) la durée de la co-culture; 2) ressources et préparation des phagocytes et des cellules apoptotiques; 3) méthodes pour dissocier les cellules apoptotiques des phagocytes. Le protocole décrit ici peut s’appliquer au potentiel phagocytaire d’autres cellules. L’optimisation peut être nécessaire pour maximiser le potentiel phagocytaire des cellules cibles. Nous avons analysé la phagocytose des cellules mesangiales rénales des thymocytes apoptotiques générés de la même manière que décrit dans ce protocole. Les neutrophiles jouent un rôle clé dans le système immunitaire inné par l’élimination des agents pathogènes. La phagocytose de neutrophiles de bactéries ou de particules étiquetées peut être analysée par cytométrie en flux26. Cependant, les neutrophiles ont une demi-vie très courte (6-8 h) et la phagocytose neutrophile des bactéries ou des champignons se produit en quelques secondes jusqu’à la minute27,28.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

La recherche dans le laboratoire de Shao est soutenue par le prix novateur de recherche du Collège de médecine et le prix de pilote de la faculté junior du département de médecine interne, Université de Cincinnati et Grant DK K01_095067 de NIDDK/NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie et infection numéro 147 macrophage cellules apoptotiques efferocytose microscopie immunofluorescente cytométrie en flux tyrosine kinases du récepteur TAM
Analyse expérimentale de l’Engloutement des thymocytes apoptotiques par les macrophages
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Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental… More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

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