Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

एपोप्टोटिक थाइमोसाइट का प्रायोगिक विश्लेषण मैक्रोफेज द्वारा निगण

doi: 10.3791/59731 Published: May 24, 2019

Summary

यहाँ, हम अपोप्तोटिक थाइमोसाइट्स और पेरिटोनियल मैक्रोफेज तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और एफिरोसाइटोसिस की दक्षता का विश्लेषण और अपोप्तोटिक thymocytes निगमित की विशिष्ट अवरोध करनेवाला-मध्यस्थता अवरुद्ध । इस प्रोटोकॉल में कृत्रिम मोतियों और बैक्टीरिया सहित अन्य कणों के सेल-मीडिरेटेड क्लीयरेंस में एक व्यापक अनुप्रयोग है ।

Abstract

सेल apoptosis एक प्राकृतिक प्रक्रिया है और भ्रूण के विकास, समस्थैतिक विनियमन, प्रतिरक्षा सहिष्णुता प्रेरण, और सूजन के समाधान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । शरीर में अपोप्तोटिक मलबे का संचय पुरानी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं कि समय के साथ प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोगों के लिए नेतृत्व को ट्रिगर कर सकते हैं । बिगड़ा अपोप्तोटिक सेल निकासी कई स्व-प्रतिरक्षित रोगों में फंसाया गया है । एपोटोटिक निकासी एक जटिल प्रक्रिया है जो शायद ही कभी शारीरिक परिस्थितियों में पाई जाती है । यह प्रचुर मात्रा में सतह रिसेप्टर्स और संकेत अणुओं शामिल है । अपोप्तोटिक सेल क्लीयरेंस की प्रक्रिया का अध्ययन व्यावहारिक आणविक तंत्र और बाद में जैविक प्रतिक्रियाओं, जो नए चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं प्रदान करता है । यहाँ, हम अपोप्तोटिक thymocytes, पेरिटोनियल मैक्रोफेज की तैयारी, और प्रवाह कोशिका मिति और माइक्रोस्कोपी द्वारा अपोप्तोटिक सेल क्लीयरेंस के विश्लेषण के प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । सभी कोशिकाओं को एक निश्चित स्तर पर apoptosis गुजरना होगा, और कई आवासीय और परिसंचारी कोशिकाओं apoptosis मलबे तेज कर सकते हैं । इसलिए, प्रोटोकॉल यहां वर्णित कई अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता अपोप्तोटिक सेल बाइंडिंग और घूस कई अंय प्रकार के सेल की विशेषता है ।

Introduction

हमारा शरीर एक दैनिक आधार पर 1-10 अरब अपोप्तोटिक कोशिकाओं को उत्पंन करता है । इतनी बड़ी संख्या में अपोप्तोटिक कोशिकाओं को एक तरह से साफ किया जाना चाहिए कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं शांत रहते हैं । एक आवधिक रूप में अपोप्तोटिक कोशिकाओं की मंजूरी सुनिश्चित करने के लिए, ऊतक निवासी कोशिकाओं और परिसंचारी कोशिकाओं के कई प्रकार के अपोप्तोटिक कोशिकाओं को निगलकरने के लिए तंत्र विकसित. Apoptosis के बेकार विनियमन शुरू और विभिंन भड़काऊ रोग और autoimmunity2की प्रगति में फंसाया गया है । Apoptosis भी कैंसर के विकास के रोगजनन और पारंपरिक उपचार3,4के लिए इसके बाद प्रतिरोध में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । अपोप्तोटिक कोशिकाओं को हटाने आम तौर पर एक विरोधी भड़काऊ प्रतिक्रिया है, जो प्रतिरक्षाविज्ञानी सहिष्णुता5से जोड़ा जा सकता है को बढ़ावा देता है । अपोप्तोटिक सेल क्लीयरेंस की अशांति आत्म प्रतिरक्षण ड्राइव और मानव और चूहों दोनों में प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोग के विकास में योगदान देता है

जब कोशिकाओं apoptosis से गुजरना, वे झिल्ली के बाहरी पत्रक के लिए भीतरी पत्रक से फॉसटाइडिलोसेरिन (PtdSer) का पर्दाफाश । Ptdser तो सतह रिसेप्टर्स के माध्यम से फ़ैगोसाइट द्वारा मांयता प्राप्त हो जाएगा । एक दर्जन से अधिक रिसेप्टर्स को पहचान करने के लिए पहचान की गई है और/या अपोप्तोटिक कोशिकाओं की निगदीकरण की सुविधा । सामांय में, वहां सतह रिसेप्टर्स अपोप्तोटिक सेल क्लीयरेंस में शामिल के कम से तीन प्रकार के होते हैं: tethering रिसेप्टर्स, अपोप्तोटिक कोशिकाओं को पहचान; रिसेप्टर्स गुदगुदी, आरंभ निगलन; chaperoning रिसेप्टर्स, पूरी प्रक्रिया7की सुविधा । टैम रिसेप्टर tyrosine kinases (टैम rtks) टीyro-3, एकएक्स्ट्रा लार्ज, और एमईआर से मिलकर बनता है और मुख्य रूप से प्रतिरक्षा प्रणाली8के माइलॉयड कोशिकाओं द्वारा व्यक्त कर रहे हैं । ताम rtks का प्राथमिक समारोह tethering रिसेप्टर्स के रूप में सेवा करने के लिए है, अपोप्तोटिक कोशिकाओं और मलबे के भक्षकाण्विक हटाने की सुविधा. हमारे समूह ने कई वर्षों तक ऑटोइम्युनिटी की सेटिंग में टैम मीडिएटेड एपीऑप्टोटिक सेल क्लीयरेंस का अध्ययन किया है । विटामिन K-निर्भर प्रोटीन विकास गिरफ्तारी विशिष्ट प्रोटीन 6 (Gas6) और प्रोटीन एस (पेशेवरों) के लिए बांध और टैम रिसेप्टर्स9,10सक्रिय करता है । Gas6 दिल, गुर्दे, और फेफड़ों में उत्पादित है । पेशेवरों मुख्य रूप से11जिगर में उत्पादित है । टैम अपोप्तोटिक कोशिकाओं को इस तरह से पहचानता है कि एन टर्मिनल Gas6/पेशेवरों के एक अपोप्तोटिक सेल पर ptdser के लिए बांध और Gas6 के सी टर्मिनल/ एक साथ अन्य रिसेप्टर्स के साथ, अपोप्तोटिक कोशिकाओं की निगदीकरण12होता है. हालांकि मेर दोनों लिगन्डों पेशेवरों और Gas6 के लिए बाध्य कर सकते हैं, हमने पाया है कि Gas6 के लिए एकमात्र लिगामेंट होना प्रतीत होता है अपोप्तोटिक कोशिकाओं, जो विरोधी mer एंटीबॉडी13द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है की मध्यस्थता मैक्रोफेज phagocytosis । मैक्रोफेज प्रोफेशनल फैगोसाइट्स होते हैं । मैक्रोफेज द्वारा अपोप्तोटिक कोशिकाओं की तेजी से निकासी सूजन और intracellular एंटीजन के खिलाफ स्व-प्रतिरक्षित प्रतिक्रियाओं का निषेध के लिए महत्वपूर्ण है । मेर रिसेप्टर tyrosine काइनेज मैक्रोफेज निगल और अपोप्तोटिक कोशिकाओं के कुशल क्लीयरेंस के लिए महत्वपूर्ण है14. माउस तिल्ली में, मेर मुख्य रूप से सीमांत क्षेत्र और मूर्त शरीर मैक्रोफेज13पर व्यक्त करता है ।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल कोशिका apoptosis को प्रेरित करने के लिए एक बुनियादी विधि का वर्णन करता है और प्रक्रिया और efferocytosis की दक्षता को मापने के तरीकों का प्रदर्शन । इन प्रोटोकॉलों को विभिन्न मूल के अपोप्तोटिक कोशिकाओं के निगन में अन्य कोशिका प्रकारों द्वारा efferocytosis का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रयोगात्मक चूहों हमारे चूहों कॉलोनी में नस्ल और बनाए रखा गया. सभी जानवरों का काम सिनसिनाटी यूनिवर्सिटी की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर ऐंड यूज कमिटी (IACUC) के दिशा-निर्देशों के मुताबिक किया गया ।

1. सीएफएसई लेबल अपोप्तोटिक थाइमोसाइट्स की तैयारी

  1. Euthanize दो भोली C57/2 द्वारा चूहों 10 मिनट के लिए सांस लेना और काटना छाती गुहा को खोलने के लिए, हटाने (बाहर खींच) ऊतक संस्कृति पेट्री डिश में घुमावदार ठीक टिप संदंश के साथ थाइमस RPMI1640 माध्यम से 10 मिलीलीटर युक्त ।
  2. माइक्रोस्कोप स्लाइड के दो पाले हुए सिरों के खिलाफ पूरे थाइमस पीस और फिर १०० μm कोशिका छलनी के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर द्वारा एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करें ।
  3. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 10 मिलीलीटर थाइमस को 5 मिनट के लिए ३०० x g में ले लीजिए ।
  4. Supernatant निकालें, 1x PBS के ४० मिलीलीटर में resuspend, और एक hemocytometer के साथ सेल नंबर गिनती ।
  5. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर अपकेंद्रित्र और supernatant हटा दें ।
  6. 1x PBS के 20 मिलीलीटर में एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में 2 x 108 कोशिकाओं के साथ एक एकल कोशिका निलंबन के रूप में फिर से निलंबित (यदि 2 x 108 कोशिकाओं से अधिक, एक अलग ५० मिलीलीटर ट्यूब में 1 एक्स pbs की एक और 20 मिलीलीटर में कोशिकाओं के बाकी को फिर से निलंबित) ।
  7. सीएफएसई के 5 μM बराबर मात्रा में (20 मिलीलीटर) 1x PBS की एक अलग ५० मिलीलीटर ट्यूब में CFSE स्टॉक समाधान (२.५ mM) के ४० μL 1 x PBS के 20 मिलीलीटर में pipetting द्वारा और अच्छी तरह से मिश्रण ट्यूब 2-3 बार ।
  8. चरण १.६ से 20 मिलीलीटर की कोशिका निलंबन में कदम १.७ से CFSE के 20 मिलीलीटर जोड़ें (CFSE की अंतिम एकाग्रता अब २.५ μM है) ।
    नोट: प्रत्येक 20 मिलीलीटर सेल निलंबन के लिए, CFSE ट्यूब की एक 20 मिलीलीटर की जरूरत है ।
  9. सेल और सीएफएसई मिश्रण ट्यूब पलटे 2-3 बार और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 2 मिनट की एक अधिकतम के लिए, तो गर्मी inसक्रियित घोड़ा सीरम के 10 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए सेते ।
  10. अपकेंद्रित्र ५० मिलीलीटर ट्यूब मिश्रण पर ३०० x g कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ।
    नोट: यदि CFSE लेबलिंग सफल है, सेल गोली रंग में हल्के पीले हो जाएगा ।
  11. Supernatant निकालें और सेल गोली 1x PBS के ४० मिलीलीटर में resuspend और एक hemocytometer के साथ सेल नंबर गिनती ।
  12. 5 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर कोशिका निलंबन अपकेंद्रित्र और supernatant त्यागने ।
  13. सेल गोली फिर RPMI1640 माध्यम से ४० मिलीलीटर के साथ धो लें ।
  14. Supernatant निकालें और RPMI1640 ऊतक संस्कृति माध्यम (RPMI1640, 20 मिमी HEPES, 10% FBS (गर्मी inसक्रियित), 20 मिमी glutamine, और 1x पेन १००/
    नोट: यदि अधिक कोशिकाओं को प्राप्त कर रहे हैं, एक अलग १०० mm ऊतक संस्कृति पकवान की जरूरत होगी ।
  15. कोशिका निलंबन संस्कृति में staurosporine 1 μM की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और 4 ज के लिए संस्कृति में ३७ ° c एक ऊतक संस्कृति में 5% CO2के साथ आपूर्ति की इनक्यूबेटर.

2. पेरिटोनियल मैक्रोफेज की तैयारी

  1. दो C57B6 चूहों (या प्रयोगशाला में किसी भी जीन-हेरफेर चूहों) intraperitoneally 0 दिन में 3% वृद्ध thioglycollate के 1 मिलीलीटर के साथ सुई ।
  2. 5 दिन में चूहों euthanize के रूप में कदम १.१, कट और छील पेट की त्वचा खुला है लेकिन पेरिटोनियम बरकरार छोड़ दें । एक 18 ग्राम सुई के साथ संलग्न एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग पेरिटोनियल गुहा में जल्दी से धोने बफर के 10 मिलीलीटर (RPMI1640, 2% FBS, ०.०४% EDTA) धक्का द्वारा पेरिटोनियल गुहा फ्लश ।
  3. ५० एक ही सुई के साथ धीरे धोने बफर निकालते/(विवरण janssen लैब अनुच्छेद 15 का संदर्भ लें) ।
  4. पेरिटोनियल गाटेज को दो बार 1x PBS के साथ धोएं, RPMI1640 ऊतक संवर्धन माध्यम में पेरिटोनियल मैक्रोफेज को 2 x 106 कोशिकाओं ५००/ प्लेट को 2 ज के लिए टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में छोड़ दें ।
  5. Aspirating द्वारा अस्थायी कोशिकाओं को हटाने और ताजा संस्कृति माध्यम के ५०० μL के साथ की जगह, दो बार.
  6. वैकल्पिक रूप से, ताम रिसेप्टर tyrosine अवरोध करनेवाला, RXDX-१०६, स्थूल phage संस्कृति के प्रत्येक अच्छी तरह से और एक और 2 एच के लिए इनक्यूबेट में चित्रा किंवदंतियों में संकेत सांद्रता में ।

3. अपोप्तोटिक thymocytes के साथ पेरिटोनियल मैक्रोफेज के सह संस्कृति

  1. चरण 1 से अपोप्तोटिक thymocytes इकट्ठा और RPMI1640 माध्यम से तीन बार धोने । अपोप्तोटिक प्रेरण की दक्षता के साथ इस स्तर पर मापा जा सकता है V/7-aad किट ।
  2. 0-12 x 106 कोशिकाओं (५०० μl मध्यम) में प्रोटोकॉल #2 से महाविभोजी संस्कृतियों के प्रत्येक कुएं में वितरित, प्रयोगात्मक व्यवस्था के अनुसार (उदाहरण के लिए, चित्रा 1देखें). यह 24-कूप प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर की पूरी संस्कृति की मात्रा बनाता है । तुरंत अपोप्तोटिक thymocytes के अलावा संस्कृति में ब्लॉकिंग एंटीबॉडी जोड़ें ।
  3. 4 ज के लिए ३७ ° c पर सेल मिश्रण संस्कृति 5% सह2के साथ आपूर्ति की एक ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर ।
  4. 1 x pbs के साथ संस्कृति के प्रत्येक अच्छी तरह से धोने (५०० μm edta युक्त) दो बार मुक्त अस्थाई अपोप्तोटिक कोशिकाओं को हटाने के लिए ।
  5. इस अवस्था में प्लेट-बाउंड मैक्रोफेज को CD11b-पीई के साथ दागें ।
    1. एक बार धुंधला बफर (1x PBS, 1% BSA) के साथ प्लेट-बाउंड मैक्रोफेज धो लें ।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से 2 μL CD11b-PE युक्त धुंधला बफर के २०० μL जोड़ें ।
    3. प्लेट को 4 ° ब् पर 20 मिनट के लिए सेक्यूबेट करना ।
    4. प्लेट के प्रत्येक कुएं को धुंधला बफर से तीन बार धोएं ।
    5. धुंधला बफर के २०० μL जोड़ें और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत छवि विश्लेषण के लिए थाली आगे बढ़ें ।
  6. वैकल्पिक रूप से, प्लेट-बाउंड मैक्रोफेज को पीबीएस में 1% लिडोकेन से जोड़कर अलग करें और ३७ ° c पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबैटिंग करें ।
  7. प्लेट-बाउंड मैक्रोफेज को दोहराएँ pipetting के साथ अलग.
  8. एक व्यक्तिगत 5 मिलीलीटर गोल-तल FACS ट्यूब में 24-कूप प्लेट के प्रत्येक कुएं से मैक्रोफेज निलंबन स्थानांतरण ।
  9. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर अपकेंद्रित्र ।
  10. Supernatant निकालें और CD11b-PE (धुंधला बफर में 1:200 तनुकरण) के 2 μL युक्त धुंधला बफर के २०० μL जोड़ें ।
  11. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला बफर में कोशिका निलंबन सेते ।
  12. सेल निलंबन दो बार धुंधला बफर के साथ धो लें ।
  13. धुंधला बफर के २०० μL जोड़ें और एक प्रवाह cytometer के साथ FACS विश्लेषण के लिए आगे बढ़ना और CFSE धनात्मकता macrophages के प्रतिशत के लिए विश्लेषण ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पेरिटोनियल मैक्रोफेज-मध्यस्थता के विश्लेषण अपोप्तोटिक थाइमोसाइट्स का निगल । पेरिटोनियल मैक्रोफेज और अपोप्तोटिक कोशिकाओं को तैयार किया गया था और सह-संवर्धित के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है । मैक्रोफेज अलग किया गया और बर्फ पर 20 मिनट के लिए पीई संयुग्मित विरोधी CD11b एंटीबॉडी के साथ दाग थे । मैक्रोफेज तो धोया और एक प्रवाह cytometer में संसाधित किया गया । के रूप में देखा, वहां नीचे सही वृत्त का चतुर्थ भाग में कोई cfse सकारात्मक महाविभोजी है जब कोई अपोप्तोटिक कोशिकाओं को संस्कृति में जोड़ा गया (चित्रा 1 और चित्रा 2, पहली पैनल) । थायोग्लाइकॉलेट-उत्तेजित पेरिटोनियल मैक्रोफेज में एपीऑप्टोटिक कोशिकाओं को निगलित करने की परिवर्तनीय क्षमता होती है । मैक्रोफेज के 30% तक cfse चैनल में सकारात्मक दिखाया, वे इस प्रयोग में cfse लेबल अपोप्तोटिक कोशिकाओं का पता चला है (चित्रा 1) का संकेत है । यह नोट करने लायक है कि cfse सकारात्मक मैक्रोफेज नीचे सही वृत्त का चतुर्थ भाग में अलग तीव्रता के कारण बाहर फैल, यह दर्शाता है कि मैक्रोफेज के भीतर अपोप्तोटिक कोशिकाओं की संख्या अलग है. इसलिए, अपोप्तोटिक कोशिकाओं की मैक्रोफेज निगल की सूक्ष्म अवलोकन करने के लिए अपोप्तोटिक कोशिकाओं निगलना के लिए मैक्रोफेज की क्षमता की जांच करने के लिए आवश्यक है (चित्रा 2). मैक्रोफेज के लिए अपोप्तोटिक कोशिकाओं के उच्च अनुपात न केवल अपोप्तोटिक कोशिकाओं ingesting मैक्रोफेज की संख्या बढ़ जाती है, लेकिन यह भी अधिक अपोप्तोटिक कोशिकाओं को निगलना के लिए मैक्रोफेज की क्षमता को बढ़ाता है (चित्रा 2).

डोमर रुकावट द्वारा efferocytosis की खुराक पर निर्भर निषेध ।
प्रयोगों के एक और सेट में, हमने पाया कि लगभग 15% मैक्रोफेज cfse पॉजीटिव बन गए जब cfse-लेबल अपोप्तोटिक thymocytes (6:1 का राशन) को मैक्रोफेज कल्चर में 4 एच के लिए जोड़ा गया, यह दर्शाता है कि वे फैगोसाइटिक मैक्रोफेज हैं (चित्रा 3 B) । मैक्रोफेज पर मेर के एक समारोह को पहचानने और अपोप्तोटिक कोशिकाओं की भंजक अणु, Gas6. मेर अवरोध द्वारा उत्तरदायी efferocytosis के प्रतिशत का परीक्षण करने के लिए, हम मर-mediated efferocytosis ब्लॉक करने के लिए संस्कृति में एंटी-मेर एंटीबॉडी जोड़ा. मेर एंटीबॉडी ब्लॉक मैक्रोफेज efferocytosis एक खुराक पर निर्भर तरीके से (चित्रा3सी, चित्रा 3डी) और समग्र रुकावट वर्तमान सेटिंग में efferocytosis दक्षता के बारे में 30% के लिए खाते हो सकता है (चित्रा 3) , इस डेटा को भी हमारे पिछले अध्ययन में मर नॉकआउट मैक्रोफेज13के साथ की पुष्टि की थी । हम तो नए एफडीए को मंजूरी दी टैम रिसेप्टर अवरोध करनेवाला, rxdx-१०६, जो विभिन्न बंधुता के साथ सभी टैम रिसेप्टर्स (axl > > Tyro3 > Mer) को रोकता है के साथ निषेध की दक्षता का परीक्षण किया । Rxdx-१०६ महाविभोजी संस्कृति में जोड़ा गया 2 घंटे पहले अपोप्तोटिक thymocytes के साथ सह ऊष्मायन । के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, rxdx-१०६ एक खुराक पर निर्भर तरीके से मैक्रोफेज efferocytosis हिचकते हैं । संतृप्त निरोध एकाग्रता लगभग १०० एनएम (चित्रा 4, ठोस रेखा), एक एकाग्रता है कि मेर से अधिक प्रभावी प्रतीत होता है की कमी (चित्रा 4 डॉटेड लाइन) या मेर एंटीबॉडी (चित्रा 3, पैनल डी) अकेले । चूंकि मैक्रोफेज16सतह पर सभी तीन टैम रिसेप्टर्स व्यक्त करता है, यह देखने के लिए कि RXDX के उच्च सांद्रता-१०६ (१०० एनएम से अधिक) सभी तीन रिसेप्टर्स ब्लॉक होगा, और इसलिए, और अधिक प्रभावी हो जाएगा की तुलना में efferocytosis अवरुद्ध एक एकल टैम रिसेप्टर, मेर लक्ष्यीकरण ।

Figure 1
चित्रा 1 . पेरिटोनियल मैक्रोफेज द्वारा अपपोटोटिक थाइमोसाइट्स की फैगोसायसिस का प्रतिशत । एपोप्टोटिक थाइमोसाइट्स को 4 ज के लिए 1 मिमी स्टेरॉस्पोरिन के साथ इनक्यूबैटिंग द्वारा प्रेरित किया गया और चित्र पैनलों में दर्शाए अनुसार एक अनुपात में मैक्रोफेज कल्चर में जोड़ा गया: (a) 1:0; () 1:1 () 1:2; () 1:4; () 1:6; () 1:8 () 1:10; () 1:12 डेटा एक प्रवाह cytometer के साथ अधिग्रहण किया गया । फ्लो सायटोमीटर से जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर फैगोसाइटिक मैक्रोफेज के प्रतिशत का विश्लेषण किया गया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 . Efferocytosis का सूक्ष्म विश्लेषण । अपरोसिटोसिस चित्र 1के रूप में तैयार किया गया था. फागोसाइटिक मैक्रोफेज CD11b-पीई के साथ थाली पर यथावत् दाग थे, paraformaldehyde के साथ तय की, और मूल्यांकन किया । छवियां फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अधिग्रहीत कर रहे थे और माइक्रोस्कोप से जुड़े सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया । प्रतिनिधि निवेशन डिजिटल बढ़े थे और प्रत्येक छवि में नीचे दिखाया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 . एक एंटी-मेर एंटीबॉडी द्वारा पेरिटोनियल मैक्रोफेज efferocytosis के निषेध । प्रोटोकॉल में वर्णित 4 ज के लिए मैक्रोफेज के साथ apoptotic कोशिकाओं को तैयार किया और सह-संवर्धित किया गया । एंटी-मेर एबी को एपोटोटिक कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति के तुरंत पहले मैक्रोफेज कल्चर में जोड़ा गया । फागोसाइटिक मैक्रोफेज तो अलग थे और 20 मिनट के लिए बर्फ पर विरोधी माउस CD11b-पीई एंटीबॉडी के साथ दाग । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 . RXDX-१०६ मैक्रोफेज efferocytosis के मध्यस्थता निषेध । अपरोसिटोसिस को चित्र 3में वर्णित के अनुसार स्थापित किया गया था । Rxdx-१०६ से पहले दो घंटे जोड़ा गया था अपोप्तोटिक thymocytes के साथ सह संस्कृति । मर-कमी पेरिटोनियल मैक्रोफेज इसी तरह तैयार किया गया था और नियंत्रण समूह के रूप में सेवा की । डेटा का अधिग्रहण किया गया था और फैगोसाइटिक मैक्रोफेज के प्रतिशत CD11b सकारात्मक कोशिकाओं पर gated थे और फ्लो cytometer सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Apoptosis एक उच्च संरक्षित कोशिका मृत्यु प्रक्रिया है कि कई संकेत cascades शामिल है और प्रोटीन अभिव्यक्ति, स्राव लाती है, और परिवहन । Apoptosis अक्सर सेलुलर आकारिकी परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है17. Apoptotic कोशिकाओं को सक्रिय रूप से साइटोकिन्स और chemokines कि फ़ैगोसाइट को आकर्षित करने के लिए साइट पर स्थानांतरित करने के लिए और निगलन की प्रक्रिया शुरू, तंग नियंत्रण के तहत एक अत्यंत जटिल मार्ग जारी18. दूसरी ओर, परिगलित कोशिका मृत्यु खतरे के संकेत है कि ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रियाओं1जारी । अपोप्तोटिक कोशिकाओं की दोषपूर्ण या लंबे समय तक निकासी इन कोशिकाओं के माध्यमिक परिगलन को बढ़ावा देगा19. इसलिए, apoptosis प्रेरण में समय प्रयोग में बहुत महत्वपूर्ण है । सेल apoptosis20प्रेरित करने के लिए कई तरीके हैं । हालांकि, अवधि और प्रेरण की ताकत सेल प्रकार निर्भर हैं । हम अधिकतम की इष्टतम स्थिति निर्धारित करने के लिए एक अनुमापन प्रयोग सेट करने की सिफारिश (90-95%) apoptosis उत्पादन । अनुबंध-V/7-aad अपोप्तोटिक डिटेक्शन किट का उपयोग किया गया था और अपोप्तोटिक दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में निर्देशों का पालन कर रहे थे । हमारी प्रयोगशाला ने पूर्व में थाइमोसाइट्स एपीऑप्टोसिस के लिए प्रेरित करने के लिए दो अलग तरीके आजमाए हैं । गामा विकिरण एक बेहतर तरीका लगता है, क्योंकि यह संस्कृति में कोई रासायनिक अवशिष्ट है और कुछ परिगलित कोशिका मौतों लाती है । हम RPMI1640 माध्यम में 4-h संस्कृति के बाद जी विकिरण के ५०० रेड को thymocytes का पर्दाफाश । हमने लगभग ९५% अपोप्तोटिक थाइमोसाइट्स13देखा । जब एक रेडिएटर उपलब्ध नहीं है, हम thymocytes 4 एच (कदम १.१५) के लिए संस्कृति में staurosporine के 1 μM के साथ apoptosis गुजरना करने के लिए प्रेरित । प्राथमिक कोशिकाएं एपीऑप्टोसिस प्रेरण के प्रति सामान्यत अधिक संवेदनशील होती हैं । फैगोसाइट्स के साथ सह-संस्कृति से पहले संस्कृति से रसायनों को हटाने के लिए व्यापक धुलाई के कदम भी आवश्यक हैं । अपोप्तोटिक कोशिकाओं को लेबल करने के लिए कई तरीके हैं. हालांकि विषाक्तता उच्च एकाग्रता के साथ जुड़ा हुआ है, CFSE बहुत कुशलता से कोशिका द्रव्य के भीतर बनाए रखा है जब ध्यान से अनुकूलित21. pHrodo एक एसिड के प्रति संवेदनशील रंग है, जो प्रतिदीप्ति में वृद्धि के रूप में पर्यावरण के पीएच कम हो जाती है । कारण phagolysosome के कम पीएच के लिए, फैगोसाइटी अपोप्तोटिक कोशिकाओं को आसानी से शारीरिक रूप से संलग्न लेकिन22परख में अपोप्तोटिक कोशिकाओं को चपेट में नहीं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।

कई सतह रिसेप्टर्स (टैम रिसेप्टर्स, मननाक रिसेप्टर, integrins (CD11b/CD18), मेहतर रिसेप्टर्स, एफसी रिसेप्टर्स, एट अल) फ़ैगोसाइट स्वयं रोगजनकों और भेदभाव के बाद प्रतिक्रियाओं से अलग करने की अनुमति23. विभिंन रिसेप्टर्स एक साथ काम करने के लिए एक जगह जटिल प्रक्रिया खत्म । रिसेप्टर (ओं) को अवरुद्ध होने की संभावना फैगोसाइसिस के एक आंशिक निषेध में परिणाम है । प्राथमिक मैक्रोफेज विभिन्न विधियों (अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज, पेरिटोनियल मैक्रोफेज, प्लीहा मैक्रोफेज, एट अल.) के साथ विभिन्न संसाधनों से तैयार किया जा सकता है । थायोग्लाइकॉलेट प्रेरित मैक्रोफेज का लाभ मैक्रोफेजेस की विषम फैगोसाइटिक फीनोटाइप है; नुकसान यह है कि thioglycollate की जरूरत के लिए अंधेरे में आयु वर्ग के लिए 3 महीने कम है । तथापि, थाओग्लाइकॉलेट विलयन की शेल्फ लाइफ 2 वर्ष है । समाधान का एक निरंतर स्टॉक इस नुकसान को दूर करना चाहिए । पेरिटोनियल मैक्रोफेज की तैयारी में पेरिटोनियल मैक्रोफेज संग्रह में लाल रक्त कोशिकाओं की मात्रा का पता लगाने के प्रयोग को प्रभावित नहीं करना चाहिए, क्योंकि वे macrophages संस्कृति के 2 एच के बाद तैरते हुए कोशिकाओं के साथ बह जाने के लिए जा रहे हैं । लाल रक्त कोशिकाओं की एक बड़ी राशि (दिखाई गोली) ACK lysing बफर के साथ उपचार की आवश्यकता हो सकती है । मैक्रोफेज संस्कृति की सतह से कसकर पालन करते हैं । विभिंन तरीकों साहित्य में उद्धृत किया गया है24सतह से आसंजन कोशिकाओं को अलग । एंजाइम आधारित टुकड़ी सेल वसूली के उच्चतम स्तर पैदावार लेकिन सतह रिसेप्टर्स को नुकसान हो सकता है, सेल समारोह और संबद्ध विश्लेषण आई । सतह रिसेप्टर्स के परिवर्तन भी रिसेप्टर आधारित प्रवाह कोशिका मिति विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं. Lidocaine कोशिका आकृति विज्ञान के कारण कैल्शियम आयन चैनलों की नाकाबंदी के लिए एक और अधिक गोलाकार रचना करने के लिए बदल25. यह हमारे प्रयोग में कोई ध्यान देने योग्य क्षति के साथ सतह से मैक्रोफेज अलग करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है ।

मैक्रोफेज अपोप्तोटिक कोशिकाओं युक्त प्रवाह कोशिका मिति द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है आधारित या खुर्दबीन आधारित assays हैं. FACS एक कम समय में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है और आगे विशिष्ट सतह या साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ अंतर धुंधला द्वारा सेल उपप्रकारों की पहचान कर सकते हैं. सह संस्कृति प्रणाली में अपोप्तोटिक सेल नंबरों के एक इष्टतम एकाग्रता (अनुपात) भी facs विश्लेषण द्वारा निर्णय लिया जा सकता है । माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण में FACS विश्लेषण की तुलना में सेल नंबर और विभेदक धुंधला होने की सीमाएं होती हैं । हालांकि, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में गहराई से जानकारी प्रदान करता है । बृहदान्त्र का सूक्ष्म विश्लेषण, अपोप्तोटिक कोशिकाओं को निगलित करने के लिए क्षमता और मैक्रोफेज की कैनेटीक्स की जांच करने के लिए आवश्यक है अपोप्तोटिक कोशिकाओं । एक समय-पूरा घूस प्रगति की एक बार चूक के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते है कितनी देर तक यह एक अपोप्तोटिक सेल को निगल लेता है, और कितने अपोप्तोटिक कोशिकाओं को एक साथ एक महाविभोजी एक साथ निगलना कर सकते हैं । फैगोसाइटिक मैक्रोफेज भी निगलन प्रक्रिया द्वारा विनियमित संकेत अणुओं की जांच करने के लिए वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । इस प्रक्रिया से जुड़े जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल का मूल्यांकन रीयल टाइम पीसीआर द्वारा किया जा सकता है ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल efferocytosis के प्रयोगात्मक विश्लेषण में एक बुनियादी मंच प्रदान करता है । अन्य कोशिका प्रकार (dendritic कोशिकाओं, mesangial कोशिकाओं, उपकला कोशिकाओं) भी अपने आवासीय स्थलों पर अपोप्तोटिक कोशिकाओं तेज करने के लिए कार्य कर सकते हैं । उन कोशिकाओं को पहचानने और अपोप्तोटिक सेल क्लीयरेंस2की प्रक्रिया शुरू करने के लिए अलग रिसेप्टर्स के उपयोग में वरीयताओं है । संपूर्ण फैगोसाइटिक दक्षता कई कारकों द्वारा प्रभावित हो सकती है, जिसमें प्रायोगिक और कोशिका प्रकार विशिष्ट कारक शामिल हैं । चर साहित्य में रिपोर्ट के परिणाम शायद के कारण कर रहे है 1) सह संस्कृति की अवधि; 2) संसाधन और फ़ैगोसाइट और अपोप्तोटिक कोशिकाओं की तैयारी; 3) फैगोसाइट्स से एपोप्टोटिक कोशिकाओं को अलग करने के तरीके । यहां वर्णित प्रोटोकॉल अन्य कोशिकाओं की फैगोसाइटिक क्षमता पर लागू हो सकता है । अनुकूलन के लिए लक्ष्य कोशिकाओं की भक्षकाण्विक क्षमता को अधिकतम करने की आवश्यकता हो सकती है । हम इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक ही रास्ते में उत्पंन अपोप्तोटिक thymocytes के गुर्दे mesangial कोशिका phagocytosis का विश्लेषण किया है । Neutrophils रोगजनकों के उंमूलन के माध्यम से जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । लेबल्ड बैक्टेरिया या कणों के न्युट्रोफिल फैगोसाइटोसिस का विश्लेषण26प्रवाह कोशिका मिति द्वारा किया जा सकता है । हालांकि, न्यूट्रोफिल एक बहुत ही कम आधा जीवन है (6-8 एच) और जीवाणुओं या कवक के न्युट्रोफिल फैगोसाइसिस सेकंड के भीतर होता है मिनट27,28

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

Shao लैब में अनुसंधान चिकित्सा के कॉलेज से अनुसंधान अभिनव पुरस्कार और आंतरिक चिकित्सा, सिनसिनाटी विश्वविद्यालय और अनुदान डीके K01_095067 से NIDDK/NIH के विभाग से कनिष्ठ संकाय पायलट पुरस्कार से समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13, (1), 202 (2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28, (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14, (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172, (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (11), 009076 (2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80, (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123, (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133, (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411, (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, (3), 20130001 (2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (3), 0003561 (2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (1), 008748 (2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68, (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31, (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112, (4), 935-945 (2008).
एपोप्टोटिक थाइमोसाइट का प्रायोगिक विश्लेषण मैक्रोफेज द्वारा निगण
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter