Summary
Beskrevet her er en protokol til direkte immun mærkning af nekrotiske myofibers i muskel kryosektioner. Nekrotiske celler er gennemtrængelig for serumproteiner, herunder immunglobulin G (IgG). Afslørende optagelsen af IgG ved myofibers tillader identifikation og kvantificering af myofibers, der gennemgår nekrose uanset muskel tilstand.
Abstract
Nekrose af muskelfibre (myonecrose) spiller en central rolle i patogenesen af flere muskel tilstande, herunder muskuløs dystrophies. Terapeutiske muligheder tackle årsagerne til muskuløs dystrofi patogenesen forventes at lindre muskel degeneration. Derfor er en metode til at assay og kvantificere omfanget af celledød i muskelbiopsier er nødvendig. Konventionelle metoder til at observere myofiber degeneration in situ er enten dårligt kvantitative eller stole på injektion af vitale farvestoffer. I denne artikel, en immunofluorescenstest protokol er beskrevet, at pletter nekrotiske myofibers ved at målrette immunglobulin G (IgG) optagelse af myofibers. IgG-optagelsesmetoden er baseret på celle funktioner, der karakteriserer den nekrotiske død, herunder 1) tabet af plasma membranens integritet med frigivelsen af skade relaterede molekylære mønstre og 2) optagelsen af plasmatiske proteiner. I murine tværsnit, den Co-immunolabelling af myofibers, ekstracellulære matrix proteiner, og mus IgG tillader ren og ligetil identifikation af myofibers med nekrotisk skæbne. Denne enkle metode er egnet til kvantitativ analyse og gælder for alle arter, herunder humane prøver, og kræver ikke injektion af vitale farvestof. Farvning af nekrotiske myofibre ved IgG-optagelse kan også kombineres med andre Co-immunolabelling.
Introduction
Tværstrieret skeletmuskulatur består hovedsageligt af muskelfibre (myofibers), som er ansvarlige for den karakteristiske frivillige kontraktile funktion. Disse celler er flerkernede, post-mitotiske strukturer, der understøtter mekanisk stress opstår under sammentrækning. Strukturel stabilitet af myofiber membranen (sarcolemma) og dens ekstracellulære matrix er afgørende for vævs homøostase. Satellit celler udgør den vigtigste muskel progenitorpopulation i modne skeletmuskulatur og findes i en lysende tilstand i raske muskler. Efter myofiber død, er muskel regenerering understøttet af satellit celler efter et myogen program, der involverer satellit celle aktivering, spredning, differentiering, og fusion til sidst danne nye flerkernede myofibers.
Myofiber død kan forekomme i flere muskel forhold, herunder mekaniske traumer, iskæmi-reperfusion skader, eller muskuløs dystrophies, og det er forbundet med den nekrotiske morfologi af døde celler1,2. Nekrotisk død er karakteriseret ved den hurtige permeabilitet af plasma membranen og frigivelse af celleindhold i det ekstracellulære rum3. Det kan skyldes enten en ureguleret proces, der ikke involverer nogen ordentlig celle signalering (dvs. utilsigtet nekrose), eller en orkestrated intracellulær pathway (dvs., reguleret nekrose). I myofibers, både regulerede4 og ureguleret5 processer kan føre til nekrose. En typisk konsekvens af myonecrosis er frigivelsen af skader-associerede molekyle mønstre, aktivering af en kraftig inflammatorisk respons6. Tilstedeværelsen af makrofager er observeret på omkring 48 h og 72 h efter skade7. Udover deres rolle i clearance af nekrotiske vragrester, de er også vigtige i muskel regenerering8,9.
Muskel dystrophier (MDs) er en heterogen gruppe af patologier, som ofte skyldes en defekt i sarcolemma struktur. Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en juvenil X-linked sygdom, der påvirker ca 1 ud af hver 3.500 mandlige fødsler på verdensplan10, og det er forårsaget af fraværet af dystrofin udtryk på sarcolemma. Kronisk degeneration af muskelvæv i DMD drenge fører til ekstrem muskelsvaghed og tidlig dødelighed. Betændelse som følge af nekrotisk død øger cytotoksicitet, og fremmer muskel fibrose og tab af muskelfunktion11,12. Behandlinger i øjeblikket i kliniske forsøg rettet mod rødderne af muskel degenerative lidelser, såsom genterapi, forventes at lindre myonekrose. Der er derfor behov for enkle teknikker til nøjagtig kvantificering af muskel degeneration.
Flere metoder bruges rutinemæssigt til at overvåge myofiber tab in vivo. Målingen af den enzymatiske aktivitet af kreatinkinase (CK) i blodet giver mulighed for pålidelig kvantificering af igangværende nekrose i muskler og hjerte væv. In situ, hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning er den mest populære metode, der i øjeblikket anvendes i diagnose for at vurdere degeneration-regenerering remodelling. Men det molekylære grundlag for H & E mærkning af døde celler er stadig uklar. Desuden farveændringer tyder myofiber død i H & E farvning er relativt subtile og ikke fremmer pålidelig og reproducerbar kvantificering. Metoder afslører DNA-fragmentering, såsom Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick ende mærkning (TUNEL), ufuldkomment etiket nekrotisk død3. De er også dårligt tilpasset til at overvåge død af syncytial celler såsom myofibers. Injektion af vitale farvestoffer, såsom Evan blå farvestof (EBD), repræsenterer et nyttigt alternativ til vurdering af myofibers, der har mistet integriteten af sarcolemma, men er ikke nødvendigvis praktisk i nogle eksperimentelle protokoller. For eksempel kan tilstedeværelsen af EBD i blodprøver påvirke resultaterne af CK målinger, en kolorimetrisk analyse. Desuden gør intracellulær optagelse af EBD medimmunolabelling udfordrende. Derfor er en alternativ metode til at tillade direkte mærkning af myofibers, der gennemgår nekrose, af interesse.
Virkningsmekanismen af vitale farvestoffer afhænger af tabet af plasma membranens integritet i nekrotiske myofibers og den passive optagelse af det injicerede farvestof. Tilsvarende, nekrotiske myofibers optagelse blodproteiner såsom albumin, for hvilke EBD har en stærk affinitet13,14, immunglobulin G (IgG), og IgM15. Den unormale tilstedeværelse af blodproteiner inden for myofibers repræsenterer derfor bekvemme markører for myonekrose in situ. Farvning disse proteiner kan være et alternativ til brug af vitale farvestoffer.
Ved at bruge IgG-optagelse som markør for myonecrosis in situ anvendes denne protokol til at vurdere muskel degeneration i tibias forreste (Ta) af MDX dystrophin-mangelfulde mus. Denne metode giver betydelige fordele i forhold til alternative teknikker: 1) den er reproducerbar og enkel i sin udførelse; 2) det kræver ikke nogen dyre behandling forud for muskel indsamling, såsom injektion af cirkulerende vitale farvestoffer, og 3) som enhver konventionel immunolmærkning, det er foreneligt med co-mærkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter blev udført i overensstemmelse med den franske og europæiske fællesskabslovgivning (licensnummer 11-00010).
1. forberedelse af tragacanth Gum
- I et glasbæger opløses 6 g traganth pulver i 100 ml deioniseret vand. Dæk med folie og lad i mindst 3 h. lejlighedsvis røre manuelt med en metalspatel, da blandingen hurtigt bliver viskøs.
- Lad traganth blandingen ligge ved 60 °c natten over i et vandbad eller i ovnen. Forsegl forsigtigt bægerglasset for at undgå tørring. Rør mindst én gang, før du aliciterer.
- Opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
2. muskel samling
Bemærk: til dette eksperiment blev en 4-ugers gammel mandlig MDX-mus ofret af livmoderhals dislokation. Denne procedure kræver ikke anæstesi og er en human killing metode i overensstemmelse med lokal lovgivning.
- Dissektion af tibias forreste (Ta) muskel
- Efter barbering af muse benet, lægge musen på ryggen og fastgør fødderne på en korkboard med nåle. Ved hjælp af præcision saks (eller en skalpel) og pincet, fjerne benet huden fra foden op til knæet for at afsløre hele længden af skinneben og TA.
- Med en saks, lave et snit mellem skinneben og TA. Dette vil lette adskillelsen af TA fra knoglen og give et let greb til epimysium. Brug præcisions tang, og fjern forsigtigt epimysium laget fra overfladen af TA.
Bemærk: fra dette trin kan TA være mere modtagelig for tørring, hvilket bør undgås. - I ankel regionen isoleres TA-senen fra andre sener med tang. Træk forsigtigt TA sene op for at isolere det fra skinneben og omgivende muskler.
- Når TA maven er helt adskilt, hold senen op, så kun den proksimale del af TA-musklen er fastgjort til knæet. Luk forsigtigt den proksimale sene så tæt som muligt på knæknoglen.
- Placer TA i en gaze, der er let fugtet med saltvand for at undgå tørring før frysning af musklen.
- Pre-cool 70 − 100 mL isopentan i et plast-eller polytetrafluorethylen bægerglas ved delvist at dyppe det i flydende nitrogen. Lad den køle af, indtil isopentanen i bunden af bægerglasset bliver et hvidt fast stof.
- På et cirkulært stykke kork (20 mm x 11 mm x 8 mm) placeres ~ 0,5 ml traganth tyggegummi. Formærk forsigtigt den anden side af proppen, så Biopsien kan identificeres korrekt efter fryse trinnet.
- Integrer TA i tyggegummiet med pincet, distale sene op. For at give passende tværsnit af musklen, holde musklen med sin akse vinkelret på kork overfladen. Kvaliteten af kryosektionerne vil forbedre, hvis biopsi ikke er helt indlejret i tyggegummiet. Lad mindst halvdelen af TA (sener side), der skal dækkes af tyggegummi.
- Hurtigt dyppe kork med den indlejrede muskel i det ufrosne, kolde isopentan lag. Bemærk, at kork vil flyde i væsken isopentan. Hold prøven på hovedet, da musklen skal dyppes i isopentan. Lad prøverne i isopentan i ca. 2 min. for at tillade fuldstændig frysning.
Bemærk: fra dette stadie skal TA forblive frosset indtil kryosektion. Opbevar musklen i tøris før langtidsopbevaring i a-80 °C fryser.
3. cryosectioning
- Indstil kryostat temperaturen ved-25 °C. Opbevar objekttemperaturen omkring-20 °C. Fastgør objektet i kryostat ved hjælp af optimal skære temperatur (Oct) sammensatte. Trim musklen indtil nå muskel maven derefter skæres 7 − 10 μm sektioner.
Bemærk: stabiliseringen af objekttemperaturen kræver mindst 10 min. - Opbevar glas skred, der bruges til opsamling af kryosektioner ved stuetemperatur (RT). Saml mindst to sektioner på hvert dias. Musklen sektioner vil automatisk holde og tø ved kontakt af den varme glas slide. Fjern diaset, og Behold det på RT.
- Lad sektioner tørre mindst 20 minutter ved RT i et ventileret miljø.
- Kryosektionerne opbevares på glas rutsjebaner ved-80 °C indtil brug.
4. immunolabelling
- Tø glider på RT i mindst 15 minutter i et ventileret miljø.
- Delineate sektioner område med en hydrofobe pen. Lad den hydrofobe barriere tørre.
- Fastgør vævet med 2% PARAFORMALDEHYD i 10 min i et fugtigt kammer.
- Vask sektionerne med fosfat bufferet saltvand (PBS) 2x i 5 min. hver.
- Bloker muskel sektionerne med 10% gede serum fortyndet i PBS i 1 time ved RT i et fugtigt kammer.
- Afsnittene i 2 timer ved RT (eller natten over ved 4 °C) inkubates i et fugtigt kammer med de primære antistoffer fortyndet i 5% gede serum. For simpel IgG optagelse mærkning i myofibers, kun der inkuberes ved sektioner med kanin antistof til mus pan-Laminin.
Bemærk: andre antigener af den ekstracellulære matrix kan målrettes, så længe de giver klar mærkning af den omgivende ekstracellulære matrix af myofibers. Markører for muskel regenerering, inflammation, eller andre parametre kan kombineres, så længe antistofferne ikke er rejst i en mus vært. Det mikroskop, der anvendes til analysen, bør omfatte en supplerende fluorescens farve. - Vask sektionerne med PBS 3x i 5 minutter hver.
- Inkuber afsnittene med rødt fluorescerende gede polyklonal sekundært antistof til kanin IgG H & L og grønt fluorescerende gede polyklonal sekundært antistof til mus IgG H & L. Inkuber ved RT for 45 min i et fugtigt kammer.
- Vask med PBS 3x i 10 minutter hver.
- Monter sektionerne i fluorescerende monterings medium, der indeholder 100 ng/mL 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), og dæk hver slide med en dækseddel.
- Lad tørring natten over ved 4 °C før billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myofibers er omgivet af en Laminin-holdige ekstracellulære matrix. Rød farvning afgrænse myofibers periferi og giver mulighed for deres identifikation. IgG vises med grønt. Kerner farves med DAPI og findes blå under mikroskopet. Men, kerner er vist i hvidt her (figur 1). Der forventes en svag IgG-immunoreaktivitet i det ekstracellulære rum, som kan øges i tilfælde af betændelse. Grøn farvning i myofibers afspejler tilstedeværelsen af IgG.
MDX Mouse TAs er karakteriseret ved en forbigående fase af akut myonekrose ved 3 ugers alderen, efterfulgt af asynkron degeneration-regenererende hændelser. Som følge heraf viser TAs fra 4-ugers gamle MDX-mus ofte heterogene profiler, herunder dårligt berørte områder, og degenererer og genopretter områder sammen i det samme tværsnit (figur 1a). Upåvirket/mildt påvirkede muskel områder indeholder myofibers med stor og homogen størrelse, og kerner findes ved lav densitet og er hovedsageligt placeret i periferien eller mellem myofibers (figur 1b). IgG-positive myofibers er generelt fraværende i sådanne sunde eller mildt ramte områder.
IgG-immunoreactivity inden for myofibers indikerer myonekrose (figur 1c, nedre del). Efter celle degeneration ryddes nekrotiske fibre ud af phagocytter. Nyligt dannede myofibers præsentere lille størrelse på tidlige stadier, og derefter gradvist forstørre som muskel forfædre Fuse og bidrage til den syncytial celle. Under denne proces forbliver myonuclei i den centrale position. Klynger af små, centralt nukleerede myofibers indikerer for nylig regenererende myofibers (figur 1c, øvre del).
Figur 1: repræsentativt billede af IgG Optag farvning i et tværsnit fra degenereret MDX muskel. (a) TA fra en 4-ugers-gammel MDX-mus blev cryosekeret og immunolmærket ved hjælp af antistoffer mod pan-Laminin opvokset i kanin (rød) og mus IgG (grøn). Kerner blev mærket med DAPI (hvid). (b, c) Forstørrede områder i panel a. Scale bar = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myofiber nekrose er en almindelig konsekvens af traumatisk motion i normale muskler. Det er godt kompenseret af en kraftfuld regenerativ kapacitet af de lokale muskel progenitorer. Men i flere muskel tilstande som i MDS, er den regenerativ kapacitet af satellit celler kompromitteret af kronisk myonekrose og overdreven fibrose. Nylige fund viser, at muskelfibrene kan dø ved nekroptose, en reguleret form for nekrose. Mere specifikt kan hæmning af nekroptose blive en ny terapeutisk strategi for DMD behandling4. Undersøge celledød veje i muskel degeneration lidelser kræver pålidelige metoder til muskel celle død kvantificering. Denne protokol beskriver IgG uptake immunofluorescens teknik, der mærker myofibers, der gennemgik nekrose.
Tabet af plasma membran integritet, der karakteriserer nekrose fører til frigivelse af skader-associerede molekyler mønstre og optagelsen af plasmatiske proteiner såsom albumin, IgG og IgM15. Virkningsmekanismen for metoden til anvendelse af IgG-optagelsen svarer til den, der gælder for vitale farvestoffer såsom EBD. Nekrotiske myofibers bliver gennemtrængelig og fælde blodproteiner af injicerede vitale farvestoffer, mens levende celler ikke. Proof-of-koncept af denne teknik er blevet valideret af Kevin Campbell's gruppe om MDs15 , men er stadig utilstrækkeligt formidlet.
Figur 1 giver typiske resultater af IgG-optagelses mærkning i dystrofiske muskler, som påvirkes af myonekrose. Med en immunolabelling, herunder kun tre farver (IgG i grøn, ekstracellulær matrix i rødt og kerner i blå/hvid). Flere vigtige parametre i musklen histologi kan kvantificeres, herunder antallet og størrelsen af myofibers og omfanget af myonecrose, udtrykt enten ved den procentdel af mærkningen i tværsnitsarealet eller procentdel af nekrotiske myofibers. En rimelig vurdering af regenerering kan også bestemmes med denne farvning. Faktisk afspejler tilstedeværelsen af centralt nukleerede myofibers (figur 1c, øvre del) lokal regenerering og dermed forbi den degenererede hændelse. Til sammenligning, sundt muskelvæv er præsenteret i figur 1b. Bemærk, at centrale nukleation i nydannede myofibers varer i flere uger i de regenererede myofibers af voksne mus. Men nuklear repositionering sker betydeligt hurtigere før fravænning alder i mus16.
Denne type resultat kan let beriges ved at tilføje en anden mærkning, der er afsløret af en anden farve. F. eks. kan de infiltrerende cellernes art og fænotype undersøges yderligere ved hjælp af passende markører. Antistoffer rettet mod CD68 vil fortrinsvis mærke makrofag populationer, uanset deres inflammatoriske status4,9. Hvis det er nødvendigt, kan den inflammatoriske status af disse celler undersøges yderligere17.
Som enhver konventionel fluorescerende farvning, kvaliteten af musklen er afgørende. Muskelbiopsier og kryosektioner skal opbevares i tøris til enhver tid og til langtidsopbevaring ved-80 °C indtil brug. Opbevaring ved-20 °C bør undgås, da det kan påvirke vævs konservering. Fryse-optøning cyklusser af prøver bør også være strengt undgås.
Denne teknik har betydelige fordele i forhold til de mest populære teknikker, såsom EBD og H & E pletter. Det er enkelt og fleksibelt og kræver kun konventionelt immunolabelling materiale og et fluorescerende mikroskop. Fleksibilitet tilbydes med hensyn til valget af fluoroforet farve forbundet med IgG i henhold til eksperimentelle behov, samt med hensyn til udførelsen af co-immunolmærkning mod yderligere antigener. Som en sammenligning kan H & E Stain og EBD kun afsløres i samme farve og kan ikke forbindes med anden mærkning for at vurdere vigtige parametre såsom myofiber placering eller omfanget og karakteren af inflammatorisk celle infiltrat. EBD-metoden kræver farve injektion af dyr omkring 24 timer før høst af musklerne, mens IgG optagelsesmetoden kan udføres i alle prøver, herunder mennesker. Hele muskulaturen af EBD-injicerede dyr indeholder farvestoffet, der kan muligvis påvirke yderligere analyse såsom fluorescerende immunolabelling af muskler eller blod CK kolorimetrisk assay.
Bestemmelse af den nøjagtige kvantificering af myonekrose fortrinsvis indebærer en pålidelig markør af celletype. Her kan arten af cellerne vurderes sammen med nekrotisk skæbne ved at co-mærkning IgG med det ekstracellulære rum omkring myofibers. I figur 1blev myofibrene identificeret ved hjælp af antistoffer rettet mod proteiner i den omgivende ekstracellulære matrix såsom Laminin. Andre komponenter såsom kollagen kan også farves. Antistoffer mod proteiner, der tilhører sarcolemma, bør dog undgås. I vores erfaring, deres immunoreactivity forsvinder straks efter nekrose af fiber.
Den immunolabelling af IgG optagelse inden for myofibers er en enkel og pålidelig metode til specifikt bejdsenekrotiske muskelfibre. Det kan let og rutinemæssigt udføres og gælder for prøver, der er modtagelig for klassisk immunofluorescens farvning. I betragtning af dets specificitet og generelle mangel på kontraindikationer, anbefales det at bruge som en guld standard for myonecrosis vurdering, uanset arten af den nekrotiske skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Association Française contre les Myopathies med Translamuscle programmet. Forfatterne takker Dr. Perla Reyes-Fernandez og Dr. Matthew Borok for deres omhyggelige læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
