Summary
Описано здесь протокол для прямой иммуномаркировки некротических миофибы в мышечных криосекциях. Некротические клетки проницаемы белками сыворотки, включая иммуноглобулин G (IgG). Выявление поглощения IgG миофибарами позволяет идентификации и количественной оценки миофидеров, которые проходят некроз независимо от состояния мышц.
Abstract
Некроз мышечных волокон (мионекрез) играет центральную роль в патогенеза нескольких мышечных состояний, включая мышечную дистрофию. Терапевтические варианты решения причин мышечной дистрофии патогенеза, как ожидается, облегчить дегенерацию мышц. Таким образом, метод для оценки и количественной степени смерти клеток в биопсии мышц необходимо. Обычные методы для наблюдения дегенерации миофипла на месте либо плохо количественные или полагаться на инъекции жизненно важных красителей. В этой статье описывается протокол иммунофлуоресценции, который окрашивает некротические миофиберы, нацеливая на иммуноглобулин G (IgG) поглощение миофиберами. Метод поглощения IgG основан на клеточных особенностях, характеризующих некротическую кончину, включая 1) потерю целостности плазменной мембраны с высвобожденными молекулярными паттернами, связанными с ущербом, и 2) поглощением плазменных белков. В поперечных сечениях, совместноиммуномаркировки миофиберов, внеклеточных матричных белков, и мыши IgG позволяет чистой и прямой идентификации миофиберов с некротической судьбой. Этот простой метод подходит для количественного анализа и применим ко всем видам, включая образцы человека, и не требует инъекций жизненно важного красителя. Окрашивание некротических миофиберов поглощением IgG также может быть сопряжено с другими совместно иммуномаркировки.
Introduction
Стриженные скелетные мышцы в основном состоят из мышечных волокон (миофибы), которые отвечают за характерную добровольную контрактную функцию. Эти клетки многоядерных, пост-митотических структур, которые поддерживают механический стресс, происходящих во время сокращения. Структурная стабильность мембраны миофибра (саркольма) и ее внеклеточной матрицы имеют решающее значение для ткани гомеостаза. Спутниковые клетки составляют основную популяцию предтека мышц в зрелой скелетной мышце и существуют в состоянии покоя в здоровых мышцах. После смерти миофибра, регенерация мышц поддерживается спутниковыми клетками после миогенной программы, которая включает в себя активацию спутниковых клеток, пролиферацию, дифференциацию и синтез, чтобы в конечном итоге сформировать новые многоядерные миофибы.
Миофибра кончина может произойти в нескольких мышечных условиях, в том числе механические травмы, ишемия-реперфузии травм, или мышечной дистрофии, и это связано с некротической морфологии мертвых клеток1,2. Некротическая смерть характеризуется быстрой проницаемостью плазменной мембраны и высвобождением клеточного содержания в внеклеточном отсеке3. Это может быть результатом либо нерегулируемого процесса, не включающего надлежащей сигнализации клеток (т.е. случайного некроза), либо организованного внутриклеточного пути (т.е. регулируемого некроза). В миофидерах, как регулируемые4, так и нерегулируемые5 процессов могут привести к некрозу. Типичным следствием мионекроза является высвобождение связанных с повреждением молекул, активируя мощный воспалительный ответ6. Присутствие макрофагов наблюдается на уровне около 48 ч и 72 ч после травмы7. Помимо своей роли в расчистке некротического мусора, они также играют важную роль в регенерации мышц8,9.
Мышечные дистрофии (МД) представляют собой неоднородную группу патологий, которые часто являются результатом дефекта в структуре сарколеммы. Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является несовершеннолетним X-связанных заболеваний, затрагивающих примерно 1 из каждых 3500 мужских рождений во всем мире10, и это вызвано отсутствием экспрессии дистрофина в сарколемме. Хроническая дегенерация мышечной ткани у мальчиков DMD приводит к крайней мышечной слабости и ранней смертности. Воспаление в результате некротической смерти повышает цитотоксичность, и способствует мышечный фиброз и потеря мышечной функции11,12. Лечение в настоящее время в клинических испытаниях ориентации корни мышечных дегенеративных расстройств, таких как генная терапия, как ожидается, облегчить мионекрез. Простые методы для точной количественной оценки мышечной дегенерации, следовательно, необходимы.
Несколько методов обычно используются для мониторинга потери миофибра in vivo. Измерение ферментативной активности креатина киназы (КК) в крови позволяет надежно очислить продолжающийся некроз в мышечных и сердечных тканях. На месте, гематоксилин и эозин (H и E) окрашивание является наиболее популярным методом в настоящее время используется в диагностике для оценки дегенерации регенерации ремоделирования. Тем не менее, молекулярная основа маркировки Н И Е мертвых клеток остается неясной. Кроме того, цветовые изменения, предполагающие смерть миофибра при окрашивании Н и Е, являются относительно тонкими и не способствуют надежной и воспроизводимой количественной оценке. Методы выявления фрагментации ДНК, такие как терминал deoxynucleotidyl transferase dUTP ник конец маркировки (TUNEL), несовершенно ярлык некротической смерти3. Они также плохо приспособлены для мониторинга смерти синцитиальных клеток, таких как миофибы. Инъекции жизненно важных красителей, таких как синий краситель Эвана (EBD), представляет собой полезную альтернативу для оценки миофиберов, которые потеряли целостность сарколеммы, но не обязательно удобно в некоторых экспериментальных протоколов. Например, наличие EBD в образцах крови может повлиять на результаты измерений CK, колористетрического анализа. Кроме того, внутриклеточного поглощения EBD делает совместноиммуномаркировки сложной задачей. Таким образом, представляет интерес альтернативный метод, позволяющий прямое маркировка миофибы, проходящих некроз.
Механизм действия жизненно важных красителей зависит от потери целостности плазменной мембраны в некротических миофимерах и пассивного поглощения инъекционного красителя. Аналогичным образом, некротические миофиберы усваивают белки крови, такие как альбумин, для которого EBD имеет сильное сродство13,14, иммуноглобулин G (IgG), и IgM15. Ненормальное присутствие белков крови в myofibers поэтому представляет собой удобные маркеры для мионекроза на месте. Окрашивание этих белков может быть альтернативой для использования жизненно важных красителей.
Используя поглощение IgG в качестве маркера мионекроза на месте, этот протокол используется для оценки мышечной дегенерации в передней tibialis (TA) mdx dystrophin-дефицитных мышей. Этот метод представляет значительные преимущества перед альтернативными методами: 1) он воспроизводим и прост в своем исполнении; 2) он не требует лечения животных до сбора мышц, таких как инъекция циркулирующих жизненно важных красителей, и 3) как любой обычный иммуномаркировки, он совместим с совместной маркировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты проводились в соответствии с законодательством Франции и Европейского сообщества (лицензия No 11-00010).
1. Tragacanth препарат десен
- В стакане растворите 6 г порошка трагаканта в 100 мл деионизированной воды. Накройте фольгой и оставьте не менее 3 ч. Иногда перемешивайте вручную металлическим шпателем, так как смесь быстро становится вязкой.
- Оставьте трагакантовую смесь на ночь на 60 градусов на водяной бане или в духовке. Тщательно запечатайте стакан, чтобы избежать высыхания. Перемешать по крайней мере один раз, прежде чем aliquoting.
- Aliquot и хранить при 4 градусах По Цельсию в течение 2 недель.
2. Мышечная коллекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента, 4-недельный мужчина mdx мышь была принесена в жертву вывихшей шейки матки. Эта процедура не требует анестезии и является гуманным методом убийства в соответствии с местным законодательством.
- Рассечение передней (TA) мышцы tibialis
- После бритья мыши ногой положите мышь на спину и прикрепите ноги на пробковую доску с помощью игл. Используя точные ножницы (или скальпель) и щипцы, удалите кожу ноги от стопы до колена, чтобы разоблачить всю длину голени и TA.
- С ножницами, сделать разрез между голени и TA. Это облегчит отделение TA от кости и обеспечит легкое сцепление с эпимизием. Используя точные щипцы, тщательно удалите слой эпимизия с поверхности TA.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага, TA может быть более восприимчивым к сушке, которые следует избегать. - В области лодыжки, изолировать сухожилие TA от других сухожилий с щипками. Аккуратно поднимите сухожилие TA, чтобы изолировать его от голени и окружающих мышц.
- Когда живот TA полностью отделен, удерживайте сухожилие так, чтобы только проксимальная часть мышцы TA прикреплялась к колену. Аккуратно разорвать проксимального сухожилия как можно ближе к коленной кости.
- Поместите TA в марлю, которая слегка смоченной с солевым раствором, чтобы избежать высыхания перед замораживанием мышцы.
- Предварительно охладите 70–100 мл изопентана в пластиковом или политетрафтотриленном стакане, частично окунув его в жидкий азот. Дайте ему остыть до тех пор, пока изопентан в нижней части стакана не станет белым твердым.
- На круговой кусок пробки (20 мм х 11 мм х 8 мм) поместите 0,5 мл трагакантовой резинки. Тщательно предварительно обозначите другую сторону пробки так, чтобы биопсия была правильно идентифицирована после замораживания шага.
- Вложить TA в десну с щипками, дистального сухожилия вверх. Чтобы позволить соответствующие поперечные сечения мышцы, удерживайте мышцу своей оси перпендикулярно поверхности пробки. Качество криосекций улучшится, если биопсия не полностью встроена в десну. Разрешить по крайней мере половина TA (тендона стороны), которые будут обнаружены резинки.
- Быстро окуните пробку со встроенной мышцей в размороженный, холодный изопентановый слой. Обратите внимание, что пробка будет плавать в жидкости изопентан. Держите образец вверх дном, как мышцы должны быть окунуты в изопентан. Оставьте образцы в изопентане около 2 мин, чтобы обеспечить полное замораживание.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого этапа, TA должны оставаться замороженными до криосекции. Храните мышцы в сухом льду перед длительным хранением в морозильной камере -80 градусов.
3. Криосекция
- Установите температуру криостата при -25 градусов по Цельсию. Держите температуру объекта на уровне около -20 градусов по Цельсию. Исправить объект в криостате с помощью оптимальной температуры резки (OCT) соединения. Обрезать мышцы до достижения мышечного живота, а затем сократить 7'10 мкм разделов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стабилизация температуры объекта требует не менее 10 мин. - Храните стеклянные слайды, используемые для сбора криосекций при комнатной температуре (RT). Соберите по крайней мере две секции на каждом слайде. Мышечные секции автоматически прилипают и оттаивают при контакте теплой стеклянной горки. Снимите слайд и держите его на RT.
- Разрешить разделы высохнуть по крайней мере 20 мин на RT в вентилируемой среде.
- Храните криосекции на стеклянных слайдах при -80 градусов до использования.
4. Иммуномаркировка
- Оттепель скользит на RT, по крайней мере 15 минут в вентилируемой среде.
- Разграничив разделы области гидрофобным пером. Разрешить гидрофобный барьер, чтобы высохнуть.
- Зафиксировать ткань с 2% параформальдегидом в течение 10 мин во влажной камере.
- Вымойте разделы с фосфатами буферного солья (PBS) 2x в течение 5 минут каждый.
- Блок мышечных секций с 10% козьей сыворотки разбавленной в PBS в течение 1 ч на RT во влажной камере.
- Инкубировать секции в течение 2 ч при РТ (или на ночь при 4 градусах Цельсия) во влажной камере с первичными антителами, разбавленными 5% козьей сыворотки. Для простого поглощения IgG маркировки в myofibers, только инкубировать разделы с кроликом антитела к мыши пан-ламинин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие антигены внеклеточной матрицы могут быть направлены до тех пор, пока они обеспечивают четкую маркировку окружающей внеклеточной матрицы миофиберов. Маркеры для регенерации мышц, воспаления или других параметров могут быть объединены до тех пор, пока антитела не подняты в хосте мыши. Микроскоп, используемый для анализа, должен включать дополнительный цвет флуоресценции. - Вымойте разделы с PBS 3x в течение 5 минут каждый.
- Инкубировать разделы с красным флуоресцентным козьим поликлональным вторичным антителом к кролику IgG H и L и зеленым флуоресцентным козьим поликлональным вторичным антителам мыши IgG H и L. Инкубировать на RT в течение 45 минут во влажной камере.
- Вымойте pbS 3x по 10 мин каждый.
- Смонтировать разделы в флуоресцентной монтажной среде, содержащей 100 нг/мл 4 ",6-диамидино-2-фенилиноле (DAPI) и покрыть каждый слайд с крышкой.
- Разрешить сушки на ночь при 4 градусах Цельсия до изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Миофибы окружены ламининосодержащей внеклеточной матрицей. Красное окрашивание разграничает периферию миофиферов и позволяет их идентифицировать. IgG показан зеленым цветом. Ядра окрашены DAPI и находятся синий под микроскопом. Тем не менее, ядра показаны в белом здесь(рисунок 1). Слабая иммунореактивность IgG ожидается в внеклеточном отсеке, который может быть увеличен в случае воспаления. Зеленое окрашивание в миофибы отражает присутствие IgG.
Mdx мыши TAs характеризуются временной фазы острого мионекроза в возрасте 3 недель, а затем асинхронные события дегенерации-регенерации. Как следствие, TAs от 4-недельных мышей mdx часто отображают неоднородные профили, включая плохо пострадавшие районы, и вырождающиеся и регенерирующие области вместе в том же поперечном сечении (Рисунок 1a). Незатронутые/слабо пораженные области мышц содержат миофиферы с большим и однородным размером, а ядра находятся при низкой плотности и в основном расположены на периферии или между миофиферами(рисунок 1b). IgG-положительные миофибы, как правило, отсутствуют в таких здоровых или слабо пострадавших районах.
IgG-иммунореактивность в миофиперах указывает на мионекрез(рисунок 1c,нижняя часть). После дегенерации клеток некротические волокна очищаются фагоцитами. Новообразованные миофибы представляют небольшой размер на ранних стадиях, а затем постепенно увеличиваются по мере того, как мышечные прародители предохраняют и способствуют синхронизации клетки. Во время этого процесса мионуклей остается на центральном месте. Кластеры небольших, централизованно нуклеадных миофибы указывают на недавние регенерации миофидеров(рисунок 1c,верхняя часть).
Рисунок 1: Представитель изображение IgG поглощения окрашивания в поперечном сечении от вырождающейся мышцы mdx. () TA от 4-недельной мыши mdx был криосекционирован и иммуномаркировки с использованием антител к пан-ламинин, поднятый в кролика (красный) и мыши IgG (зеленый). Ядра были помечены с помощью DAPI (белый). (b, c) Увеличенные области панели a. Шкала бар 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Миофибр некроз является общим следствием травматических упражнений в нормальных мышцах. Он хорошо компенсируется мощной регенеративной способностью местных мышечных прародителей. Однако, в нескольких мышечных условиях, таких как в MDs, регенеративная способность спутниковых клеток скомпрометирована хроническим мионекрозом и чрезмерным фиброзом. Последние результаты показывают, что мышечные волокна могут умереть от некроптоза, регулируемой формы некроза. Более конкретно, ингибирование некроптоза может стать новой терапевтической стратегией для лечения DMD4. Исследование путей смерти клеток при расстройствах дегенерации мышц требует надежных методов количественной оценки смерти мышечных клеток. Этот протокол описывает метод иммунофлуоресценции IgG, который маркирует миофибы, которые подверглись некрозу.
Потеря целостности плазменной мембраны, характеризующая некроз, приводит к высвобождению связанных с ущербом молекул и поглощению плазменных белков, таких как альбумин, IgG и IgM15. Механизм действия метода маркировки поглощения IgG аналогичен механизму жизненно важных красителей, таких как EBD. Некротические миофибы становятся проницаемыми и ловят белки крови инъекционных жизненно важных красителей, в то время как живые клетки этого не делают. Доказательство концепции этого метода была подтверждена группой Кевина Кэмпбелла на MDs15, но остается недостаточно распространены.
Рисунок 1 обеспечивает типичные результаты igG поглощения маркировки в дистрофических мышц, пострадавших от мионекроза. С одной иммуномаркировки, включающей только три цвета (IgG в зеленом, внеклеточной матрице в красном и ядрах в синем/белом). Несколько важных параметров мышечной гистологии могут быть количественно, в том числе количество и размер миофиберов и степень мионекроза, выраженный либо процент маркировки в поперечной области или процент некротические миофиберы. Справедливая оценка регенерации также может быть определена с помощью этого окрашивания. Действительно, наличие централизованно нуклеадных миофидеров(рисунок 1с,верхняя часть) отражает локальную регенерацию и, таким образом, мимо вырождающегося события. Для сравнения, здоровая мышечная ткань представлена на рисунке 1b. Следует отметить, что центральное ядро в новообразованных миофибрах длится несколько недель в регенерированных миофибрах взрослых мышей. Тем не менее, ядерное перепозиционирование происходит значительно быстрее до отлужели возраста у мышей16.
Этот тип результата может быть легко обогащен путем добавления другой маркировки показали другой цвет. Например, природа и фенотип проникающих клеток могут быть дополнительно изучены с использованием соответствующих маркеров. Антитела, направленные против CD68 будет преимущественно ярлык макрофагов населения, независимо от их воспалительного статуса4,9. При необходимости, воспалительный статус этих клеток могут быть дополнительно исследованы17.
Как и любое обычное флуоресцентное окрашивание, качество мышц имеет решающее значение. Мышечная биопсия и криосекции должны храниться в сухом льду в любое время и для длительного хранения при -80 градусах Цельсия до использования. Хранение при -20 градусах Цельсия следует избегать, так как это может повлиять на сохранение тканей. Циклы замораживания- образцов также следует строго избегать.
Этот метод имеет значительные преимущества перед наиболее популярными методами, такими как EBD и N и E пятна. Она проста и гибка и требует только обычного иммуномаркировки и флуоресцентного микроскопа. Гибкость предлагается в отношении выбора цвета фторрофа, связанного с IgG в соответствии с экспериментальными потребностями, а также в отношении выполнения совместной иммуномаркировки против дальнейших антигенов. Для сравнения, н и E пятно и EBD могут быть выявлены только в том же цвете и не могут быть связаны с другими маркировки для оценки важных параметров, таких как расположение миофибра или степень и характер воспалительных клеток инфильтра. Метод EBD требует инъекции красителя животных около 24 ч до сбора мышечной массы, в то время как метод поглощения IgG может быть выполнен в любых образцах, включая людей. Вся мускулатура EBD-инъекционных животных содержит краситель, который может повлиять на дальнейший анализ, такие как флуоресцентные иммуномаркировки мышц или крови CK колористетрического анализа.
Определение точной количественной оценки мионекроза преимущественно подразумевает надежный маркер типа клеток. Здесь, природа клеток может быть оценена вместе с некротической судьбы путем совместной маркировки IgG с внеклеточным отсеком, окружающим myofibers. На рисунке 1миофибы были идентифицированы с помощью антител, направленных против белков окружающей внеклеточной матрицы, таких как ламинин. Другие компоненты, такие как коллаген также могут быть окрашены. Однако антител против белков, принадлежащих к сарколемме, следует избегать. По нашему опыту, их иммунореактивность быстро исчезает после некроза волокна.
Иммуномаркировка поглощения IgG в myofibers является простым и надежным методом, чтобы конкретно пятно некротических мышечных волокон. Это может быть легко и регулярно выполняется и применимо к образцам поддается классическому окрашиванию иммунофлуоресценции. Учитывая его специфику и общее отсутствие контрпоказаний, рекомендуется использовать в качестве золотого стандарта для оценки мионекроза, независимо от характера некротической травмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Ассоциацией Франсез contre les Myopathies с программой Translamuscle. Авторы благодарят д-ра Перлу Рейес-Фернандес и доктора Мэтью Борока за тщательное прочтение рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
