Summary
Aquí se describe un protocolo para el inmunoetiquetado directo de miofibers necróticas en criosecciones musculares. Las células necróticas son permeables a las proteínas séricas, incluyendo la inmunoglobulina G (IgG). Revelar la aceptación de IgG por miofibers permite la identificación y cuantificación de miofibers que sufren necrosis independientemente de la condición muscular.
Abstract
La necrosis de las fibras musculares (mionecrosis) desempeña un papel central en la patogénesis de varias afecciones musculares, incluyendo distrofias musculares. Se espera que las opciones terapéuticas que abordan las causas de la patogénesis de la distrofia muscular alivien la degeneración muscular. Por lo tanto, se necesita un método para determinar y cuantificar el alcance de la muerte celular en las biopsias musculares. Los métodos convencionales para observar la degeneración de la miofibra in situ son poco cuantitativos o dependen de la inyección de distos vitales. En este artículo, se describe un protocolo de inmunofluorescencia que mancha las miofibers necróticas al atacar la admisa de inmunoglobulina G (IgG) por miofibers. El método de admisión de IgG se basa en características celulares que caracterizan la muerte necrótica, incluyendo 1) la pérdida de integridad de la membrana plasmática con la liberación de patrones moleculares asociados al daño y 2) la adopción de proteínas plasmáticas. En las secciones transversales murinas, el co-inmunoetiquetado de miofibers, proteínas de matriz extracelular e IgG de ratón permite una identificación limpia y directa de las miofibers con el destino necrótico. Este método simple es adecuado para el análisis cuantitativo y aplicable a todas las especies, incluidas las muestras humanas, y no requiere la inyección de tinte vital. La tinción de miofibers necróticas por la suación de IgG también se puede emparejar con otro co-inmunoetiquetado.
Introduction
El músculo esquelético estriado consiste principalmente en fibras musculares (miofibers), que son responsables de la característica función contráctile voluntaria. Estas células son estructuras multinucleadas y postmitoticas que soportan el estrés mecánico que ocurre durante la contracción. La estabilidad estructural de la membrana de la miofiber (sarcolemma) y su matriz extracelular son cruciales para la homeostasis tisular. Las células satélite comprenden la población principal de progenitores musculares en el músculo esquelético maduro y existen en un estado de reposo en músculos sanos. Después de la muerte de la miofibra, la regeneración muscular es apoyada por células satélite después de un programa miogénico que implica activación de células satelitales, proliferación, diferenciación y fusión para, en última instancia, formar nuevas miofibers multinucleadas.
La miofibra la muerte puede ocurrir en múltiples condiciones musculares, incluyendo trauma mecánico, lesiones de isquemia-reperfusión, o distrofias musculares, y se asocia con la morfología necrótica de las células muertas1,2. La muerte necrótica se caracteriza por la rápida permeabilidad de la membrana plasmática y la liberación del contenido celular en el compartimiento extracelular3. Puede ser el resultado de un proceso no regulado que no implica señalización celular adecuada (es decir, necrosis accidental), o de una vía intracelular orquestada (es decir, necrosis regulada). En la miofibras, tanto los procesosregulados 4 comolos 5 no regulados pueden conducir a la necrosis. Una consecuencia típica de la mionecrosis es la liberación de patrones de moléculas asociadas al daño, activando una potente respuesta inflamatoria6. La presencia de macrófagos se observa alrededor de 48 h y 72 h después de una lesión7. Además de su papel en el aclaramiento de escombros necróticos, también son importantes en la regeneración muscular8,9.
Las distrofias musculares (MID) son un grupo heterogéneo de patologías que a menudo resultan de un defecto en la estructura del sarcolemma. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad juvenil ligada al X que afecta aproximadamente a 1 de cada 3.500 nacimientos masculinos en todo el mundo10,y es causada por la ausencia de expresión de distrofina en el sarcolemma. La degeneración crónica del tejido muscular en los niños DMD conduce a la debilidad muscular extrema y la mortalidad temprana. La inflamación resultante de la muerte necrótica mejora la citotoxicidad, y promueve la fibrosis muscular y la pérdida de la función muscular11,12. Se espera que los tratamientos actualmente en ensayos clínicos dirigidos a las raíces de los trastornos degenerativos musculares, como la terapia génica, alivien la mionecrosis. Por lo tanto, se necesitan técnicas simples para cuantificar con precisión la degeneración muscular.
Varios métodos se utilizan rutinariamente para controlar la pérdida de miofibra in vivo. La medición de la actividad enzimática de la creatina quinasa (CK) en la sangre permite una cuantificación fiable de la necrosis continua en los tejidos musculares y cardíacos. In situ, la tinción de hemexilina y eosina (H&E) es el método más popular que se utiliza actualmente en el diagnóstico para evaluar la remodelación de la degeneración-regeneración. Sin embargo, la base molecular del etiquetado H&E de las células muertas sigue sin estar clara. Además, las modificaciones de color que sugieren la muerte de miofibra en la tinción de H&E son relativamente sutiles y no facilitan la cuantificación fiable y reproducible. Métodos que revelan la fragmentación del ADN, como el etiquetado terminal de desoxinucleorden de la transferencia dUTP (TUNEL), etiqueta imperfectamente la muerte necrótica3. También están mal adaptados para monitorear la muerte de células sincitiales como la miofibras. La inyección de tintes vitales, como el tinte azul (EBD) de Evan, representa una alternativa útil para evaluar las miofibers que han perdido la integridad del sarcolemma, pero no es necesariamente conveniente en algunos protocolos experimentales. Por ejemplo, la presencia de EBD en muestras de sangre puede afectar a los resultados de las mediciones de CK, un ensayo colorimétrico. Además, la ingesta intracelular de EBD dificulta el co-inmunoetiquetado. Por lo tanto, un método alternativo que permite el etiquetado directo de miofibers sometidos a necrosis es de interés.
El mecanismo de acción de los tintes vitales se basa en la pérdida de la integridad de la membrana plasmática en las miofibers necróticas y la aceptación pasiva del tinte inyectado. Del mismo modo, las miofibers necróticas toman proteínas de la sangre como la albúmina, para la que EBD tiene una fuerte afinidad13,14,inmunoglobulina G (IgG) e IgM15. Por lo tanto, la presencia anormal de proteínas sanguíneas dentro de las miofibers representa marcadores convenientes para la mionecrosis in situ. La tinción de estas proteínas puede ser una alternativa para el uso de colorantes vitales.
Mediante el uso de la ingesta de IgG como un marcador de mionecrosis in situ, este protocolo se utiliza para evaluar la degeneración muscular en los tibialis anterior (TA) de ratones con deficiencia de distrofina mdx. Este método presenta ventajas significativas sobre las técnicas alternativas: 1) es reproducible y simple en su ejecución; 2) no requiere ningún tratamiento animal antes de la recolección muscular, como la inyección de dedos vitales circulantes, y 3) como cualquier inmunoetiquetado convencional, es compatible con el etiquetado cooperativo.
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Protocol
Los experimentos se realizaron de conformidad con la legislación francesa y comunitaria (número de licencia 11-00010).
1. Preparación de las encías tragacanth
- En un vaso de precipitados de vidrio, disolver 6 g de polvo de tragacanth en 100 ml de agua desionizada. Cubrir con papel de aluminio y dejar durante al menos 3 h. Revuelva ocasionalmente manualmente con una espátula metálica a medida que la mezcla se vuelve rápidamente viscosa.
- Dejar la mezcla de tragacanto a 60oC durante la noche en un baño de agua o en el horno. Selle cuidadosamente el vaso de precipitados para evitar el secado. Revuelva al menos una vez antes de alícuota.
- Aliquot y conservar a 4oC durante un máximo de 2 semanas.
2. Colección muscular
NOTA: Para este experimento, un ratón mdx macho de 4 semanas de edad fue sacrificado por dislocación cervical. Este procedimiento no requiere anestesia y es un método de matanza humano de acuerdo con la legislación local.
- Disección del músculo tibialis anterior (TA)
- Después de afeitar la pierna del ratón, coloca el ratón sobre su espalda y coloca los pies en una tabla de corcho con agujas. Usando tijeras de precisión (o un bisturí) y fórceps, retire la piel de la pierna del pie hasta la rodilla para exponer toda la longitud de la tibia y el TA.
- Con tijeras, haga una incisión entre la tibia y la TA. Esto facilitará la separación de la TA del hueso y proporcionará un fácil agarre al epimisio. Usando fórceps de precisión, retire cuidadosamente la capa de epimisio de la superficie de la TA.
NOTA: A partir de este paso, el TA puede ser más susceptible al secado, lo que debe evitarse. - En la región del tobillo, aísle el tendón TA de otros tendones con fórceps. Tire suavemente hacia arriba del tendón TA para aislarlo de la tibia y los músculos circundantes.
- Cuando el vientre TA esté completamente separado, sostenga el tendón hacia arriba de modo que sólo la parte proximal del músculo TA esté unida a la rodilla. Corta suavemente el tendón proximal lo más cerca posible del hueso de la rodilla.
- Coloque el TA en una gasa ligeramente humedecida con salina para evitar el secado antes de congelar el músculo.
- Pre-enfriar 70-100 ml de isopentano en un vaso de precipitados de plástico o politetrafluoroetileno sumergiéndolo parcialmente en nitrógeno líquido. Deje que se enfríe hasta que el isopentane en la parte inferior del vaso de precipitados se convierta en un sólido blanco.
- Sobre una pieza circular de corcho (20 mm x 11 mm x 8 mm), coloque 0,5 ml de goma tragacanto. Pre-etiquete cuidadosamente el otro lado del corcho para que la biopsia pueda ser identificada correctamente después del paso de congelación.
- Incruste el TA en la encía con fórceps, tendón distal hacia arriba. Para permitir secciones transversales apropiadas del músculo, sostenga el músculo con su eje perpendicular a la superficie del corcho. La calidad de las criosecciones mejorará si la biopsia no está completamente incrustada en la encía. Deje que al menos la mitad de la TA (lado del tendón) sea descubierta por la encía.
- Sumerja rápidamente el corcho con el músculo incrustado en la capa de isopentano frío y sin congelar. Tenga en cuenta que el corcho flotará en el líquido isopentano. Sostenga la muestra boca abajo como el músculo necesita ser sumergido en isopentano. Deje las muestras en el isopentane durante unos 2 minutos para permitir la congelación completa.
NOTA: A partir de esta etapa, el TA debe permanecer congelado hasta la criosección. Almacene el músculo en hielo seco antes de guardarlo a largo plazo en un congelador de -80 oC.
3. Criosección
- Establezca la temperatura del criostato en -25 oC. Mantenga la temperatura del objeto a unos -20 oC. Fije el objeto en el criostato usando el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). Recorta el músculo hasta que llegues al vientre muscular y luego corta secciones de 7 a 10 m.
NOTA: La estabilización de la temperatura del objeto requiere al menos 10 minutos. - Mantenga los portaobjetos de vidrio utilizados para recoger criosecciones a temperatura ambiente (RT). Recopile al menos dos secciones en cada diapositiva. Las secciones musculares se pegarán y descongelarán automáticamente al contacto del tobogán de vidrio caliente. Retire la diapositiva y manténgala en RT.
- Deje que las secciones se sequen al menos 20 minutos a RT en un ambiente ventilado.
- Conservar las criosecciones en portaobjetos de vidrio a -80 oC hasta su uso.
4. Inmunoetiquetado
- Descongelar los toboganes a RT durante al menos 15 minutos en un ambiente ventilado.
- Delinear el área de secciones con una pluma hidrófoba. Deje que la barrera hidrófoba se seque.
- Fijar el tejido con 2% de paraformaldehído durante 10 minutos en una cámara húmeda.
- Lave las secciones con solución salina tamponada de fosfato (PBS) 2 veces durante 5 min cada una.
- Bloquear las secciones musculares con 10% de suero de cabra diluido en PBS durante 1 h a RT en una cámara húmeda.
- Incubar las secciones durante 2 horas a RT (o durante la noche a 4oC) en una cámara húmeda con los anticuerpos primarios diluidos en suero de cabra al 5%. Para un simple etiquetado de admisión de IgG en miofibers, solo incuba las secciones con anticuerpos de conejo a la pan-laminina de ratón.
NOTA: Otros antígenos de la matriz extracelular pueden ser dirigidos siempre y cuando proporcionen un etiquetado claro de la matriz extracelular circundante de las miofibers. Los marcadores para la regeneración muscular, la inflamación u otros parámetros se pueden combinar siempre y cuando los anticuerpos no se eluden en un huésped del ratón. El microscopio utilizado para el análisis debe incluir un color de fluorescencia suplementario. - Lave las secciones con PBS 3x durante 5 min cada una.
- Incubar las secciones con anticuerpo secundario policlonal de cabra fluorescente rojo para conejo IgG H&L y anticuerpo secundario policlonal de cabra fluorescente verde al ratón IgG H&L. Incubar a RT durante 45 minutos en una cámara húmeda.
- Lavar con PBS 3x durante 10 min cada uno.
- Monte las secciones en un medio de montaje fluorescente que contenga 100 ng/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y cubra cada diapositiva con un cubreobjetos.
- Dejar secar durante la noche a 4oC antes de tomar imágenes.
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Representative Results
Las miofibers están rodeadas por una matriz extracelular que contiene laminina. La tinción roja delimita la periferia de miofibras y permite su identificación. IgG se muestra en verde. Los núcleos se tiñen con DAPI y se encuentran en azul bajo el microscopio. Sin embargo, los núcleos se muestran en blanco aquí (Figura 1). Se espera una inmunoreactividad IgG débil en el compartimento extracelular, que puede aumentarse en caso de inflamación. La tinción verde dentro de las miofibers refleja la presencia de IgG.
Los TA de ratón Mdx se caracterizan por una fase transitoria de la mionecrosis aguda a las 3 semanas de edad, seguida de eventos asincrónicos de degeneración-regeneración. Como consecuencia, los TA de ratones mdx de 4 semanas de edad a menudo muestran perfiles heterogéneos, incluidas las zonas mal afectadas, y degenerando y regenerando áreas juntas en la misma sección transversal(Figura 1a). Las áreas musculares no afectadas/ligeramente afectadas contienen miofibras de tamaño grande y homogéneo, y los núcleos se encuentran a baja densidad y se encuentran principalmente en la periferia o entre miofibers(Figura 1b). Las miofibers IgG positivas generalmente están ausentes en áreas tan saludables o ligeramente afectadas.
La IgG-inmunoreactividad dentro de las miofibers indica mionecrosis(Figura 1c, parte inferior). Después de la degeneración celular, las fibras necróticas son eliminadas por fagocitos. Las miofibras recién formadas presentan un tamaño pequeño en las primeras etapas, y luego se agrandan progresivamente a medida que los progenitores musculares se fusionan y contribuyen a la célula sincitial. Durante este proceso, myonuclei permanecen en la posición central. Los racimos de miofibers pequeñas y centralmente nucleadas indican miofibers regeneradoras recientemente(Figura 1c,parte superior).
Figura 1: Imagen representativa de la tinción de la toma de IgG en una sección transversal del músculo mdx degeneración. (a) TA de un ratón mdx de 4 semanas de edad fue criodisección e inmunoetiquetado utilizando anticuerpos para pan-laminina criado en conejo (rojo) y ratón IgG (verde). Los núcleos fueron etiquetados con DAPI (blanco). (b, c) Agrandadas las áreas del panel a. Barra de escala a 500 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La necrosis de miofibra es una consecuencia común del ejercicio traumático en los músculos normales. Está bien compensado por una poderosa capacidad regenerativa de los progenitores musculares locales. Sin embargo, en varias condiciones musculares como en los D, la capacidad regenerativa de las células satélite se ve comprometida por la mionecrosis crónica y la fibrosis excesiva. Los hallazgos recientes muestran que las fibras musculares pueden morir por necroptosis, una forma regulada de necrosis. Más específicamente, la inhibición de la necroptosis puede convertirse en una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento con DMD4. Investigar las vías de muerte celular en trastornos de degeneración muscular requiere métodos confiables de cuantificación de la muerte de células musculares. Este protocolo describe la técnica de inmunofluorescencia de admiso de IgG que etiqueta las miofibras que se sometieron a necrosis.
La pérdida de la integridad de la membrana plasmática que caracteriza la necrosis conduce a la liberación de patrones de moléculas asociadas al daño y la aceptación de proteínas plasmáticas como la albúmina, IgG e IgM15. El mecanismo de acción del método de etiquetado de la ingesta de IgG es similar al de los tendedores vitales como el EBD. Las miofibers necróticas se vuelven permeables y atrapan las proteínas de la sangre de los diáculos vitales inyectados, mientras que las células vivas no. La prueba de concepto de esta técnica ha sido validada por el grupo de Kevin Campbell en los documentos de calidad15, pero sigue siendo insuficientemente difundida.
La Figura 1 proporciona resultados típicos del etiquetado de la ingesta de IgG en músculos distróficos afectados por la mionecrosis. Con un inmunoetiquetado que incluye sólo tres colores (IgG en verde, matriz extracelular en rojo y núcleos en azul/blanco). Se pueden cuantificar varios parámetros importantes de la histología muscular, incluyendo el número y el tamaño de las miofibers y la extensión de la mionecrosis, expresada ya sea por el porcentaje de etiquetado en el área transversal o porcentaje de miofibers necróticas. Una estimación justa de la regeneración también se puede determinar con esta tinción. De hecho, la presencia de miofibers nucleadas centralmente(Figura 1c, parte superior) refleja la regeneración local y, por lo tanto, más allá del evento degenerativo. Para la comparación, tejido muscular sano se presenta en la Figura 1b. Cabe destacar que la nucleación central en miofibers recién formadas dura varias semanas en las miofibers regeneradas de ratones adultos. Sin embargo, el reposicionamiento nuclear ocurre significativamente más rápido antes de la edad de destete en ratones16.
Este tipo de resultado puede enriquecerse fácilmente añadiendo otro etiquetado revelado por otro color. Por ejemplo, la naturaleza y el fenotipo de las células infiltrantes pueden examinarse más a fondo utilizando marcadores apropiados. Los anticuerpos dirigidos contra CD68 etiquetarán preferentemente las poblaciones de macrófagos, independientemente de su estado inflamatorio4,9. Si es necesario, el estado inflamatorio de estas células se puede investigar más a fondo17.
Como cualquier tinción fluorescente convencional, la calidad del músculo es crucial. Las biopsias musculares y las criosecciones deben mantenerse en hielo seco en todo momento y para su almacenamiento a largo plazo a -80 oC hasta su uso. Se debe evitar el almacenamiento a -20 oC, ya que podría afectar a la preservación del tejido. También se deben evitar estrictamente los ciclos de congelación de descongelación de las muestras.
Esta técnica tiene ventajas significativas sobre las técnicas más populares, como las manchas EBD y H&E. Es simple y flexible y sólo requiere material de inmunoetiquetado convencional y un microscopio fluorescente. Se ofrece flexibilidad con respecto a la elección del color del fluoróforo asociado con el IgG de acuerdo con las necesidades experimentales, así como con respecto al rendimiento de la co-inmunolacooperación contra otros antígenos. Como comparación, la mancha de H&E y el EBD sólo pueden revelarse en el mismo color y no pueden asociarse con otros etiquetados para evaluar parámetros importantes como la ubicación de la miofiber o la extensión y naturaleza del infiltrado inflamatorio de células. El método EBD requiere la inyección de tinte de animales alrededor de 24 horas antes de cosechar los músculos, mientras que el método de admisión de IgG se puede realizar en cualquier muestra, incluidos los seres humanos. Toda la musculatura de los animales inyectados por EBD contiene el tinte que posiblemente puede afectar a análisis adicionales como el inmunoetiquetado fluorescente de los músculos o el ensayo colorimétrico de la CK de sangre.
Determinar la cuantificación precisa de la mionecrosis implica preferentemente un marcador fiable del tipo de célula. Aquí, la naturaleza de las células se puede evaluar junto con el destino necrótico mediante el co-etiquetado de IgG con el compartimiento extracelular que rodea las miofibers. En la Figura 1,las miofibers se identificaron utilizando anticuerpos dirigidos contra proteínas de la matriz extracelular circundante como laminina. Otros componentes como el colágeno también se pueden teñir. Sin embargo, se deben evitar los anticuerpos contra las proteínas pertenecientes al sarcolemma. Según nuestra experiencia, su inmunoreactividad desaparece rápidamente tras la necrosis de la fibra.
El inmunolado de la ingesta de IgG dentro de las miofibers es un método simple y confiable para manchar específicamente las fibras musculares necróticas. Se puede realizar de forma fácil y rutinaria y es aplicable a muestras susceptibles a la tinción clásica de inmunofluorescencia. Teniendo en cuenta su especificidad y falta general de contraindicaciones, se recomienda utilizar como un estándar de oro para la evaluación de la mionecrosis, independientemente de la naturaleza de la lesión necrótica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Asociación Francesa contre les Myopathies con el programa Translamuscle. Los autores agradecen al Dr. Perla Reyes-Fernandez y al Dr. Matthew Borok por su cuidadosa lectura del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
